Bockstael Olivier

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (IRIBHM) Laboratoire de Neurochirurgie Expérimentale

Evaluation de stratégies de transfert de gènes via les virus adéno-associés recombinants pour la thérapie génique et

cellulaire de la maladie de Parkinson.

Bockstael Olivier

Thèse de doctorat présentée en vue de l’obtention du titre académique de Docteur en Sciences Biomédicales.

Promoteurs : Docteur Liliane Tenenbaum Professeur Olivier Dewitte

8 septembre 2010

COMPOSITION DU JURY

Pr. Gilbert VASSART Président du jury

Dr. Liliane TENENBAUM Secrétaire du Jury Promoteur de thèse

Pr. Olivier DEWITTE Promoteur de thèse

Dr. Christine DELPORTE Expert de la Faculté

Pr. Massimo PANDOLFO Expert de la Faculté

Pr. Serge SCHIFFMANN Expert de la Faculté

Dr. François LACHAPELLE Expert étranger

Dr. Jean-Michel HEARD Expert étranger

Je dédie cette thèse à ma très chère Laurence, compagne de mes jours et à notre fils adoré, Aubin.

Je désire aussi dédier cette thèse à la mémoire de ma collègue, Enni Lehtonen, trop tôt enlevée à l’affection de ses proches.

REMERCIEMENTS

Je souhaite remercier le « Fond de la Recherche Scientifique-FNRS (F.R.S.-FNRS) » et en particulier le « Fond pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture (FRIA) » et l’opération « Télévie » pour leur soutien financier durant ma thèse.

Je désire aussi remercier « la Fondation David et Alice Van Buuren » et le fond « Bourses Suzanne Maraite» qui m’ont permis, par l’octroi de leurs prix, de terminer ma thèse dans de bonnes conditions.

Tout d’abord, je désire remercier chaleureusement Liliane Tenenbaum qui m’a accompagné et soutenu tout au long de cette thèse. Pour ses encouragements tout au long de ces années, pour sa disponibilité, sa patience, les nombreuses discussions scientifiques ou autres, qu’elle soit mille fois remerciée.

Je tiens ensuite à remercier le Professeur Jacques Brotchi et le Professeur Olivier Dewitte pour m’avoir permis d’effectuer ce travail au sein de leur groupe. Je leur suis reconnaissant pour cette opportunité de travailler dans la recherche universitaire et pour leur soutien.

J’adresse mes plus vifs remerciements à tous les membres de notre groupe : Catherine Melas, Abdelwahed Chtarto, Xin Yang, Janica Wakkinen qui, par leurs nombreux conseils et encouragements, par leurs coups de main et leur disponibilité, m’ont permis de réaliser ma thèse dans d’aussi bonnes conditions.

Je remercie les Professeurs J. E. Dumont et G. Vassart pour m’avoir accueilli dans l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (IRIBHM) me permettant de réaliser mon travail dans les meilleures conditions.

Mes remerciements vont également à Marc Leviver pour sa sympathie et ses remarques pertinentes lors de nos réunions.

Je remercie également les Docteurs Veerle Baekelandt, David Blum, Vanessa Depaepe et Satyan Chintawar qui ont toujours su faire preuve de disponibilité et de bons conseils à mon égard.

Je désire remercier particulièrement Audrey Sutherland pour ses encouragements et la patience dont elle a fait preuve en relisant et corrigeant ce manuscrit.

Ma gratitude est aussi dirigée vers tous ceux que j’ai pu côtoyer durant ce travail et qui m’ont apporté, qui un conseil, qui un encouragement : Catherine Bryuns, Lise Nuttin, Maya Makhoul, Sandra Pietri, Thalie Devosse, Jean-Yves Springael, Tristan Bouschet, Gregory Driessens, François Willermain, Philippe Koch.

Je remercie le Professeur G. Vassart, Le Docteur C. Delporte, le Professeur O. Dewitte, le Professeur M. Pandolfo, le Professeur S. Schiffmann, le Docteur F. Lachapelle et le Professeur J. M.

Heard, qui, malgré leur emploi du temps chargé, ont accepté de juger cette thèse.

J’adresse des remerciements particuliers à Germain Mazère pour son amitié, son humour et pour m’avoir appris ce qu’est une belle thèse mais aussi à Jordane Dimidschstein pour la touche de

surréalisme qu’il a su apporter à nos discussions.

Je remercie particulièrement ma famille et mes amis pour leur amour, leur présence et leurs encouragements tout au long de ce travail.

Enfin, je désire remercier ma compagne Laurence qui a fait preuve tout au long de cette thèse d’amour, de patience, de soutien et de tendresse mais aussi de disponibilité pour me ménager des plages de calme dans un appartement que nous devons partager avec un petit garçon.

TABLE DES MATIERES

COMPOSITION DU JURY ... I REMERCIEMENTS...III TABLE DES MATIERES ... VI LISTE DES FIGURES ET DES TABLES... IX LISTE DES ABREVIATIONS...X

INTRODUCTION GENERALE ...- 1 -

A. LA MALADIE DE PARKINSON...- 1 -

I. Généralités ...- 1 -

1. Epidémiologie de la maladie de Parkinson...- 1 -

2. Pathologie de la maladie de Parkinson ...- 2 -

3. La boucle motrice dans la maladie de Parkinson...- 2 -

4. Biologie de la dopamine ...- 4 -

II. La mort cellulaire dans la maladie de Parkinson...- 5 -

1. L’apoptose...- 5 -

2. Les mécanismes de neuro-inflammation...- 5 -

3. Le stress oxydatif ...- 6 -

4. L’excitotoxicité et l’homéostasie du calcium ...- 8 -

III. Génétique de la maladie de Parkinson ...- 8 -

1. Gènes causant une maladie de Parkinson autosomale dominante ...- 9 -

1.1 α-synucléine...- 9 -

1.2 Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2)...- 10 -

2. Gènes causant une maladie de Parkinson autosomale récessive...- 11 -

2.1 Parkine ...- 11 -

2.2 PTEN induced kinase 1 (PINK1)...- 12 -

2.3 Omi/HtrA2 ...- 12 -

2.4 DJ-1...- 12 -

2.5 ATP13A2 ...- 13 -

IV. Modèles animaux de la maladie de Parkinson...- 13 -

V. Traitements existants...- 13 -

1. Les traitements médicamenteux dopaminergiques ...- 14 -

2. Les traitements chirurgicaux...- 14 -

2.1 La thalamotomie ...- 14 -

2.2 La stimulation haute fréquence du noyau sous-thalamique ou stimulation du cerveau profond...- 15 -

3. Les traitements neuroprotecteurs et neurorégénératifs ...- 15 -

3.1 Les traitements par des facteurs de croissance...- 16 -

3.2 Le GDNF...- 17 -

3.3 La neurturine...- 18 -

3.4 Le CDNF...- 19 -

3.5 Les virus recombinants comme agents de thérapie génique ...- 19 -

4. Autres approches de thérapie génique ...- 20 -

4.1 Transduction du gène de la GAD dans le STN...- 20 -

4.2 Stratégie de thérapie génique dans le but de rétablir une synthèse de dopamine dans le striatum...- 20 -

5. La transplantation de cellules dans la maladie de Parkinson...- 22 -

5.1 Les cellules souches embryonnaires ...- 24 -

5.2 Les cellules progénitrices neurales ...- 25 -

6. La neurogenèse endogène pour le remplacement des neurones dopaminergiques...- 27 -

6.1 Neurogenèse striatale durant la maladie de Parkinson...- 27 -

6.2 Neurogenèse nigrale durant la maladie de Parkinson ...- 28 -

6.3 Approches thérapeutiques basées sur la neurogenèse endogène ...- 29 -

B. LA NEUROGENESE ENDOGENE :...- 30 -

I. Généralités ...- 30 -

II. La Zone Sous-Ventriculaire: ...- 31 -

III. Régulation de la neurogenèse adulte dans la SVZ...- 34 -

1. Les astrocytes...- 35 -

2. L’épendyme ...- 35 -

3. La vasculature ...- 35 -

4. La lame basale et la matrice extracellulaire ...- 36 -

5. Régulation de la neurogenèse par les neurotransmetteurs ...- 37 -

6. Les signaux diffusibles et les signaux intercellulaires de contact...- 37 -

7. Activation des progéniteurs de la SVZ par les atteintes cérébrales. ...- 40 -

8. Les maladies neurodégénératives...- 41 -

C. LES PARVOVIRUS ADENO-ASSOCIES (AAV)...- 43 -

I. Biologie des AAV...- 43 -

1. Classification : ...- 43 -

2. Epidémiologie des AAV : ...- 43 -

3. Organisation génomique ...- 44 -

4. Le cycle viral...- 47 -

4.1 La phase lytique ...- 48 -

4.2 La phase de latence et l’intégration génomique...- 48 -

II. Les vecteurs adéno-associés recombinants ...- 49 -

1. Stratégies de production de rAAV ...- 50 -

2. Sérotypes d’AAV...- 52 -

3. Facteurs limitant la transduction par les rAAV ...- 52 -

3.1 Attachement et internalisation des AAV ...- 52 -

3.2 Trafic intracellulaire...- 53 -

3.3 Entrée dans le noyau et décapsidation ...- 54 -

3.4 Synthèse du second brin du génome rAAV ...- 55 -

4. Maintien épisomal et intégration des génomes rAAV ...- 56 -

5. Trans-encapsidation du génome recombinant dans des capsides de différents sérotypes .- 58 - 6. Les rAAV pseudotypés dans le cerveau ...- 59 -

7. Les vecteurs adéno-associés self-complémentaires (scAAV) ...- 60 -

BUT DU TRAVAIL ...- 64 -

RESULTATS...- 65 -

A. Profil d’expression différentiel dans le cerveau de rat en utilisant des vecteurs rAAV2/1 combinés avec le promoteur inductible à la tétracycline et celui du cytomégalovirus...- 66 -

I. Objectifs:...- 66 -

II. Résultats et conclusions : ...- 66 -

B. Les vecteurs AAV de sérotype 1 inhibent transitoirement la prolifération des précurseurs de la zone sous-ventriculaire de rat. ...- 67 -

I. Objectifs:...- 67 -

II. Résultats et conclusions : ...- 67 -

C. Transfert de gènes dans les progéniteurs neuronaux in vitro ...- 88 -

I. Objectifs :...- 88 -

II. Résultats et conclusions...- 88 -

DISCUSSION ET PERSPECTIVES :...- 100 -

A. Injection intrastriatale de rAAV2/1...- 102 -

B. Injection nigrale de rAAV2/1...- 106 -

C. Injection de rAAV2/1 dans la SVZ ...- 107 -

D. Transfert de gènes par les rAAV dans les NPC in vitro...- 109 -

E. Inhibition de la prolifération par les vecteurs rAAV...- 110 -

F. Perspectives ...- 111 -

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...- 113 -

ANNEXES ...- 177 -

A. PUBLICATIONS...- 177 -

PUBLICATIONS DANS DES REVUES A COMITE DE LECTURE ...- 177 -

CHAPITRE DE LIVRE ...- 177 -

RESUMES PUBLIES ...- 178 -

COMMUNICATIONS DURANT DES CONGRES SCIENTIFIQUES ...- 178 -

B. CURRICULUM VITAE ...- 181 -

C. THESE ANNEXE ...- 182 -

Dissection de voies inflammatoires rétiniennes dans les modèles d’uvéités auto-immunes par des vecteurs viraux rapporteurs utilisant des séquences transcriptionnelles spécifiques...- 182 -

RESUMÉ ...- 184 -

LISTE DES FIGURES ET DES TABLES

Figure 1 : Représentation schématique des principaux circuits neuraux de la boucle motrice p.3 Figure 2 : Représentation schématique des voies cérébrales de synthèse et de dégradation de la dopamine et des mécanismes d’action des drogues dopaminergiques utilisées dans le traitement des

symptômes de la maladie de Parkinson. p.4

Figure 3 : Neurogenèse dans la zone sous-ventriculaire. p.31

Figure 4 : Modèle tridimensionnel de la niche neurogénique de la zone sous-ventriculaire. p.34

Figure 5 : Organisation du génome de l’AAV2 p.44

Figure 6 : Structure secondaire de l’ITR de l’AAV2. p.45

Figure 7 : Modèle de la réplication du génome d’AAV. p.46

Figure 8 : Cycle biologique de l’AAV. p.47

Figure 9 : Comparaison du devenir des génomes des rAAV et scAAV dans le noyau de la cellule-hôte.

p.61

Table 1 : Résumé des efficacités de différents vecteurs (adénovirus, AAV et lentivirus) exprimant le GDNF à induire la TH dans le striatum dans différents modèles animaux de la PD. p.17 Table 2 : Homologie de capsides entre les sérotypes 1 à 9 d’AAV. p.59

LISTE DES ABREVIATIONS

5-HT : 5-hydroxytryptamine ou sérotonine 6-OHDA : 6-hydroxydopamine

7-OH-DPAT : 7-hydroxyl-N,N-di-n-propyl-2 aminotétraline AADC : L-aromatique amino acide decarboxylase

AAV : virus adéno-associé

AAV2 : AAV de sérotype 2

AAVS1: Adeno-associated virus integration site 1 Aβ : peptide β-amyloïde

ADAM : disintegrin and metaloproteases ADN : acide désoxyribonucléique

AMPA : acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique AP : phosphatase alkaline

ARN : acide ribonucléique

ATP : adénine tri-phosphate BBB : barrière hémato-méningèe BC : basic cluster

BDNF : brain-derived neurotrophic factor bFGF : basic fibroblast growth factor β-gal : β-galactosidase

BH4 : tétrahydrobioptérine

BMP: bone morphogenic protein BO : bulbe olfactif

bp : paire de bases

BrdU : 5-bromo-2’-deoxyuridine-5’-monophosphate BSA : albumine de sérum bovin

CA : corno ammonis

CBP : CREB binding protein

CDNF: facteur de croissance dopaminergique conservé CH1 : GTP cyclohydrolase 1

CNTF : ciliary neurotrophic factor COMT: catechol-O-methyl transferase

COX: cyclo-oxygénase

Cpu : caudate putamen

CREB : cyclic AMP response element-binding protein CsCl : chlorure de césium

CSF : fluide cérébro-spinal

CSPG : chondroitin sulphate proteoglycans

DARPP-32 : dopamine and cyclic AMP regulated phosphoprotein 32 DAT : transporteur de dopamine

DBS : stimulation du cerveau profond DMSO : diméthyl-sulfoxyde

DNA-PK : protéine kinase dépendante de l’ADN

DOPAC : acide 3, 4-dihydroxyphenylacetique

DSB : cassure double-brin

EDTA : acide ethylènedinitrilotetraacetique EGF : epidermal growth factor

EGFR : récepteur à l’EGF

ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay ERF : Ets2 repressor factor

ESC: cellules souche embryonnaire FACS: fluorescent activated cell sorting FCS : sérum de veau fœtal

FGF2 : fibroblast growth factor 2 GABA : acide γ-aminobutyrique

GAD : acide glutamique décarboxylase GDNF : facteur de croissance dérivé de la glie GE : éminence ganglionnaire

GFAP : protéine fibrillaire acide gliale GFP : green fluorescent protein GP : globus palidus

GPe : globus palidus externe GPi : globus palidus interne GTP : guanine tri-phosphate

H2O2 : peroxyde d’hydrogène HBSS : Hank’s balanced salt solution HGF : hepatocyte growth factor HPV : human papilloma virus HS : sérum de cheval

HSPG : protéoglycans héparan sulphate HSV : virus herpes simplex IEE : integration efficiency element ITR : inverted terminal repeat

kb : kilobase

kDa: kiloDalton

KO : knock out

L-dopa : L-3, 4-dihydroxyphenylalanine LGF : liver growth factor

LIF : leukemia inhibitory factor

Lmx1a : LIM homeobox transcription factor 1 LRRK2 : leucine rich repeat kinase 2

MAO-B: monoamine oxydase-B

Mash1: mammalian acheate scute homolog 1 MBP : protéine basique de la myéline MFB : medial forebrain bundle

MOI : multiplicité d’infection

MPTP : méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine Msx1 : muscle segment homeobox transcription factor 1

NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate sous forme réduite NeuroD : neurospecific basis helix-loop-helix transcrition factor

NFκB: facteur nucléaire kappa B NGF : nerve growth factor

Ngn2 : neurogénine 2

NMDA: N-methyl-D-aspartate NPC : cellule progénitrice neurale NT3 : neurotrophine 3

NTN : neurturine

Nurr1 : nuclear receptor 1 ORF : phase ouverte de lecture PBS : tampon phosphate

pCBA : promoteur hybride entre le pCMV et le promoteur de la chicken β actine pCMV : promoteur précoce du cytomégalovirus

PD: maladie de Parkinson

PDGF : platelet-derived neurotrophic factor PEDF : pigment epithelium-derived factor PET : tomographie d’émission de positrons PI3K : phosphatidylinositol-3-kinase

PINK1 : PTEN induced kinase 1

Pitx3 : paired like homeobox transcription factor 3 pNSE : promoteur du gène de la neuron-specific enolase

PSA-NCAM : forme polysialylisée de la molécule d’adhésion cellulaire neurale qPCR : réaction de polymérase en chaîne quantitative

rAAV: virus adéno-associé recombinant

RBS: Rep binding site

RMS : flux migratoire rostral

RNS : espèce réactive d’azote

ROC : Ras of complex proteins (domaine “GTPase like”) ROS : espèce réactive d’oxygène

rtTA-M2 : reverse tet trans-activator variant M2 sAPP : protéine précurseur amyloïde soluble

scAAV : virus adéno-associé recombinant self-complémentaire Shh : sonic hedgehog

SN : substance noire

SNC : système nerveux central SNpc: substance noire pars compacta SNpr: substance noire pars reticulata STN : noyau sous-thalamique

SVZ : zone sous ventriculaire TAF: facteur associé à TBP TBP : TATA binding protein

TFIIB : facteur général de transcription IIB TFIIH : facteur général de transcription IIH TGFα : transforming growth factor α TGFβ : transforming growth factor β TH : tyrosine hydroxylase

TRAP1 TNF receptor associated protein 1 TRS: terminal resolution site

tTA: tet trans-activator

UV: ultra-violet

VEGF : vascular endothelial growth factor VM : mésencéphale ventral

VMAT2 : vesicular monoamine transporter 2 VTA : aire tégumentaire ventrale

WPRE : élément de régulation posttranscriptionnel du woodchuck hepatitis virus

INTRODUCTION GENERALE

A. LA MALADIE DE PARKINSON

I. Généralités

La première description de la maladie de Parkinson (PD) a été faite en 1857 par James Parkinson ¹. Il s’agit d’une maladie neurodégénérative extrêmement commune. Elle est caractérisée d’un point de vue neuropathologique principalement par la dégénérescence et la mort des neurones dopaminergiques de la substance noire et la présence d’inclusions intracellulaires contenant de l’α- synucléine appelées corps de Lewy. D’un point de vue clinique, les patients présentent plusieurs symptômes. Un tremblement au repos d’une fréquence de quatre à six hertz est le signe le plus classique observé au diagnostic de symptômes moteurs. On observe aussi mais moins fréquemment une bradykinésie. Il s’agit d’un ralentissement du mouvement avec des difficultés à initier et à continuer un geste. Il y a aussi une rigidité caractérisée par une résistance à l’étirement des muscles squelettiques.

Au cours de l’évolution de la maladie, de nombreux symptômes comme l’instabilité posturale, des gels de la posture (freezing of gait) ou des défauts de l’élocution sont susceptibles de faire leur appartion.

La grande majorité des patients atteints de la PD va développer des symptômes non moteurs dans l’évolution de la pathologie. On peut compter parmi ceux-ci des perturbations du sommeil, des dysfonctions des systèmes autonomes, des déficits olfactifs et plus généralement sensoriels, et toute une gamme de problèmes neuropsychiatriques dont les plus fréquents sont les problèmes cognitifs et la démence.

Comprise au départ comme une maladie liée à un déficit en dopamine, des indices de plus en plus nombreux indiquent qu’il s’agit d’une maladie impliquant de multiples systèmes cérébraux, que divers systèmes de transmetteurs non dopaminergiques sont impliqués dans l’apparition des symptômes moteurs et que ces systèmes sont de plus en plus affectés au cours de la maladie ².

1. Epidémiologie de la maladie de Parkinson

La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus commune après la maladie d’Alzheimer ³ avec une prévalence de 17.4 cas par 100 000 habitants âgés de cinquante à

cinquante-neuf ans et par an. Cette prévalence augmente à 93,1 cas par 100 000 habitants âgés de septante à septante-neuf ans et par an. L’âge médian d’apparition de la maladie est de soixante ans, avec une durée moyenne de la maladie (entre le diagnostic et la mort) de quinze ans et un rapport de mortalité de deux pour un ^{4, 5}. Comme on le voit cette maladie touche principalement les populations âgées. Avec le vieillissement des populations dans les contrées développées, la PD représente un enjeu de santé publique majeur et d’importance croissante.

2. Pathologie de la maladie de Parkinson

Bien que d’étiologie inconnue, la PD se caractérise par une perte des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNpc) et dans une moindre mesure des neurones dopaminergiques de l’aire tégumentaire ventrale (ventral tegmental area, VTA) ^{6, 7}, ce qui entraîne les symptômes moteurs classiques. Par ailleurs, la maladie de Parkinson affecte d’autres régions cérébrales comme le cortex, le BO, le tronc cérébral, mais aussi le système nerveux sympathique ^{8, 9}. C’est néanmoins dans le système nigro-striatal que les mécanismes de neurodégénération ont été le plus étudiés. La présence d’inclusions cytoplasmiques éosinophiles appelées corps de Lewy dans les neurones dopaminergiques de la substance noire survivants mais aussi dans d’autres régions du cerveau est une autre caractéristique pathologique de la maladie de Parkinson, de même que les neurites de Lewy ¹⁰. Le noyau dense des corps de Lewy est composé de lipides et il est entouré d’éléments périphériques filamenteux qui comprennent différentes protéines dont l’ubiquitine, le neurofilament, des éléments du protéasome et l’α-synucléine ^{11, 12}.

3. La boucle motrice dans la maladie de Parkinson

Les neurones dopaminergiques nigro-striés font partie de la boucle motrice (Fig. 1a) qui comprend le cortex, le caudate putamen (Cpu) aussi appelé striatum, la substance noire (SN), le globus palidus (GP), le noyau sous-thalamique (STN) et le thalamus. Cette boucle régule l’activité motrice.

Les fibres dopaminergiques nigro-striées stimulent les neurones inhibiteurs striataux. Ces derniers utilisent l’acide γ-aminobutyrique (GABA) comme neurotransmetteur principal et projettent vers le globus pallidus interne et externe (GPi et GPe). Le GPi contient des neurones inhibiteurs GABA- ergiques qui projettent dans le thalamus. Le GPe projette vers le STN des afférences inhibitrices GABA-ergiques. Le STN projette en retour ses axones stimulateurs glutamatergiques dans le GPi. La baisse de sécrétion de dopamine (Fig. 1b) au Cpu par les neurones nigro-striataux entraîne une baisse de la stimulation des neurones inhibiteurs projetant vers le GPe. L’inhibition striatale des neurones du

GPi est alors partiellement levée. Les neurones du GPi sont alors plus actifs provoquant une sur- inhibition du thamalus.

Figure 1 :Représentation schématique des principaux circuits neuraux de la boucle motrice. a) situation normale ; les deux voies striatales (directe et indirecte) sont équilibrées. b) Effet présumé de la déplétion dopaminergique du Cpu ; le déséquilibre des deux voies de sortie striatales entraînent une inhibition de l’activité thalamo-corticale. c) La stimulation haute fréquence du noyau sous-thalamique inhibe son activité et rétablit une activité thalamo-corticale. d) Le changement phénotypique des neurones du noyau sous-thalamique de glutamatergique à GABA-ergique transforme son activité excitatrice en activité inhibitrice et permet un rétablissement de l’activité thalamo-corticale. L’épaisseur des flèches représente le niveau d’activité. Abréviations : Cpu : caudate putamen ; D1 : récepteur à la dopamine D1 ; D2 récepteur à la dopamine D2 ; GABA : acide γ-aminobutitique GPe : globus pallidus extrene ; GPi globus pallidus interne ; SNpc : substance noire pars compacta ; SNpr substance noire pars reticulata ; STN : noyau sous-thalamique. Adapté de “Levodopa: Past, Present and Future” de Hauser R. A., European Neurology, 2009

Figure 2 : Représentation schématique des voies cérébrales de synthèse et de dégradation de la dopamine et des mécanismes d’action des drogues dopaminergiques utilisées dans le traitement des symptômes de la maladie de Parkinson. Abréviations : AADC: L-aromatique amino acide decarboxylase, DA: dopamine;

COMT: catechol-O-methyl transferase; MAO-B: monoamine oxydase-B ; TH : tyrosine hydroxylase ; VMAT2 : vesicular monoamine transporter 2 Adapté de « Advances in the treatment of Parkinson’s disease. » de Singh N., Progrss in neurobiology ,2007.

4. Biologie de la dopamine

La première étape de la synthèse de la dopamine (fig.2) consiste en l’absorption par l’alimentation de la tyrosine, un acide aminé. Dans les neurones dopaminergiques, la tyrosine est convertie en L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (L-dopa) par l’enzyme tyrosine hydroxylase (TH). La TH est l’enzyme limitante pour la synthèse de la dopamine ¹³ et nécessite la présence de tétrahydrobioptérine (BH4) comme co-facteur pour son fonctionnement. La GTP cyclohydrolase 1 (CH1) est l’enzyme limitante pour la synthèse de la BH4 à partir du GTP ¹⁴. La L-dopa est ensuite transformée en dopamine par la L-aromatique amino acide decarboxylase (AADC) qui est présente en excès dans les neurones dopaminergiques ¹³. La dopamine ainsi synthétisée est alors transférée et stockée dans les vésicules synaptiques par le transporteur de la dopamine vésiculaire VMAT2 (vesicular monoamine transporter 2). Lors de l’influx nerveux, les vésicules synaptiques fusionnent avec la membrane plasmique et relâchent leur contenu dans la fente synaptique. La dopamine peut alors se lier sur ses récepteurs pour médier la transmission du signal. La dopamine peut ensuite soit être dégradée dans l’espace extra-cellulaire par la catechol-O-methyl transferase (COMT), soit être recapturée par la cellule présynaptique via le transporteur de dopamine (DAT, dopamine transporter).

La dopamine recapturée va être soit recyclée dans une vésicule synaptique soit dégradée par la monoamine oxydase-B (MAO-B).

II. La mort cellulaire dans la maladie de Parkinson

On considère que les causes de la maladie de Parkinson idiopathique sont multifactorielles et que des prédispositions génétiques, l’exposition à des toxines environnementales et l’âge sont des facteurs susceptibles d’influencer le déclenchement et l’évolution de la maladie ¹⁵.

On ne connaît pas précisément les mécanismes entraînant la mort cellulaire dans les neurones dopaminergiques. Néanmoins, les études post mortem de cerveaux de patients de même que l’étude des différents gènes impliqués dans les formes familiales de la PD ont permis de dégager différents mécanismes impliqués dans la dégénérescence au niveau cellulaire.

1. L’apoptose

Un nombre croissant d’indices semble impliquer l’apoptose comme contribuant à la mort cellulaire dans la PD. L’apoptose est un phénomène de mort cellulaire physiologique. Les cellules subissant une apoptose présentent toute une série de changements morphologiques comme la condensation de la chromatine, des modifications de la membrane plasmique, la compression de la cellule et l’apparition des corps apoptotiques ^{16, 17}.

Différents signes d’apoptose ont été trouvés lors d’analyse post-mortem de SN de patients comme la fragmentation de l’ADN caractéristique des dernières étapes de l’apoptose ^18-20 ou d’autres critères morphologiques ^{21, 22}. Néanmoins, certains auteurs n’ont pas pu reproduire ces résultats ^{23, 24}. Il faut garder à l’esprit qu’étant donné la lente progression de la maladie (plusieurs années) et la vitesse du processus d’apoptose (quelques heures), on s’attend à ne trouver que très peu de cellules en apoptose à un moment donné.

2. Les mécanismes de neuro-inflammation

On considère le cerveau comme étant protégé par une forme de privilège immun dû à la présence de la barrière hémato-méningée et à l’absence de système lymphatique dans cet organe.

Néanmoins, le cerveau est capable de développer une réponse inflammatoire en réponse à différentes agressions. Des agents comme des pathogènes, un traumatisme ou un accident vasculaire cérébral peuvent activer les cellules de la microglie, entraîner une invasion locale de cellules immunitaires circulantes, la production d’espèces réactives d’oxygène et d’azote (reactive oxygen species, ROS,

reactive nitrogen species, RNS), la production de cytokines, de chimiokines et d’autres facteurs inflammatoires. Tous ces processus sont susceptibles d’entraîner un œdème dans le cerveau. On considère souvent la réaction inflammatoire dans le cerveau comme étant à double tranchant. Dans des situations aigües, et pour peu qu’elle soit de courte durée, la réaction inflammatoire limite les dégâts et favorise la guérison, alors que lorsqu’elle est chroniquement maintenue à un haut niveau, la neuro- inflammation peut sérieusement endommager le tissu sain ^{25, 26}.

Pour résoudre une situation inflammatoire, le cerveau mobilise un trafic cellulaire, de la phagocytose et la production de médiateurs anti-inflammatoires pour contrebalancer l’expression de gènes pro-inflammatoires. En résumé, les réponses pro- et anti-inflammatoires doivent être équilibrées pour éviter les effets délétères d’une réponse inflammatoire prolongée ou non contrôlée.

On a montré l’existence d’un processus inflammatoire dans la PD ^{15, 25} caractérisé par la présence de microglie activée, l’accumulation de cytokines, l’activation du facteur nucléaire kappa B (nuclear factor kappa B, NFκB) et la présence de dommages oxydatifs sur les protéines du fluide cérébro-spinal (cerebro-spinal fluid, CSF) et du cerveau des patients ^{23, 27-30}. On a montré que les patients atteints de maladie de Parkinson idiopathique ont une neuro-inflammation élevée dans le pons, les ganglions de la base, le striatum et les régions frontales et temporales du cortex comparée aux patients sains du même âge, sans corrélation avec la durée de la maladie ²⁷. Par ailleurs, on a trouvé des cellules microgliales activées regroupées autour des neurones dopaminergiques ^{23, 31, 32}. De plus, les neurones dopaminergique relâchent des agents chimioattractants en mourant ^33-35. Ce phénomène est susceptible d’augmenter encore l’infiltration de la région par de la microglie activée qui élimine les débris cellulaires et qui peut être un facteur contribuant à la progression de la maladie car le burst respiratoire accompagnant la phagocytose peut amplifier le stress oxydatif des neurones dopaminergiques survivants.

3. Le stress oxydatif

On appelle stress oxydatif les conditions dans lesquelles les défenses antioxydantes cellulaires sont insuffisantes pour maintenir les niveaux de ROS et de RNS en dessous du seuil toxique. Ces conditions peuvent être dues à une production excessive de ROS ou à une perte des mécanismes de détoxification.

Le cerveau est considéré comme particulièrement sensible au stress oxydatif car il a une consommation en oxygène correspondant à 20% de la consommation totale du corps. De plus, il est

enrichi en acides gras sensibles à la peroxydation alors que les défenses anti-oxydantes (comme la catalase, la super-oxyde dismutase, le glutathion et la glutathion peroxydase) ne sont pas particulièrement élevées ³⁶.

Au sein du cerveau, la SN est une zone particulièrement vulnérable car elle combine un métabolisme élevé, un contenu élevé en oxydants et une faible concentration en antioxydants, en particulier le glutathion ³⁷. Il est à noter que la dopamine elle-même peut jouer un rôle dans la génération de ROS. En effet, la dopamine peut être dégradée enzymatiquement ou s’auto-oxyder pour former des semiquinones potentiellement toxiques ^{38, 39}. La dégradation enzymatique est réalisée par la monoamine oxydase-B (MAO-B) et génère de l’acide 3, 4-dihydroxyphenylacétique (DOPAC) avec une production du peroxyde d’hydrogène (H2O2) comme sous-produit ^{40, 41}. L’H2O2 est normalement relativement stable dans la cellule et il est transformé en eau par la glutathion peroxydase qui utilise le glutathion comme substrat réducteur. Par ailleurs, ces deux voies cataboliques sont aussi accélérées en présence d’éléments rédox actifs comme le fer, le cuivre ou le manganèse ⁴². Or la SN contient une haute concentration en fer comparée aux autres régions du cerveau, suggérant qu’une augmentation du niveau de fer puisse catalyser la conversion de l’ H2O2 produit lors de la dégradation de la dopamine en radicaux hydroxyles hautement réactifs, entraînant une augmentation des dommages oxydatifs dans cette région ⁴³.

La mitochondrie est au centre des mécanismes de stress oxydatif car lors du métabolisme respiratoire, des intermédiaires ROS sont générés. Si un dysfonctionnement mitochondrial apparaît, ces ROS sont susceptibles d’être libérées dans le cytoplasme. De plus, un dysfonctionnement de la mitochondrie peut entraîner une baisse de production d’ATP et donc une diminution de l’énergie disponible pour les processus de détoxification. Par ailleurs, la mitochondrie est sensible aux conditions de stress oxydatif qui peuvent induire un fonctionnement métabolique anormal ^{44, 45}.

Les observations chez les patients suggèrent que le stress oxydatif joue un rôle important dans la PD. En effet, les patients présentent une augmentation des métabolites issus de l’oxydation des nucléotides ^46-49, des protéines ^{50, 51} et des lipides ^{52, 53}.

On observe une déficience du complexe mitochondrial 1 dans la SNpc de patients atteints de PD idiopathique ⁵⁴. Néanmoins cette déficience n’est pas présente chez tous les patients. Le défaut dans le complexe 1 des patients atteints de maladie de Parkinson abaisse le seuil d’induction de l’apoptose médiée par la mitochondrie par une baisse de la production d’ATP et par la production de

radicaux libres. Il entraîne aussi une sensibilisation des cellules à l’effet pro-apoptotique de la protéine Bax ⁵⁵.

4. L’excitotoxicité et l’homéostasie du calcium

Il y a longtemps que l’excitotoxicité et les déséquilibres dans l’homéostasie intracellulaire du calcium sont considérés comme des mécanismes pouvant entraîner la neurodégénérescence ⁵⁶. Le glutamate, principal neurotransmetteur excitateur dans le cerveau, induit l’augmentation de la concentration calcique du cytoplasme via l’activation directe des récepteurs-canaux N-methyl-D- aspartate (NMDA) et acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazol-propionique (AMPA) ainsi qu’en activant indirectement les canaux calciques dépendants du voltage. En cas de stress énergétique (niveaux d’ATP bas), les neurones ont du mal à maintenir leur potentiel de membrane ce qui peut entraîner une activation persistante des récepteurs par le glutamate ambiant ⁵⁷. Une moindre disponibilité en énergie cellulaire a aussi une influence sur l’homéostasie intracellulaire du calcium.

Une augmentation de la concentration cytosolique de calcium peut déclencher de nombreux processus délétères y compris l’activation de l’oxyde nitrique synthétase et la génération d’oxyde nitrique mais aussi l’activation des calpaïnes. Le stress oxydatif peut donc entraîner -via une baisse de l’énergie cellulaire disponible- une excitotoxicité et une homéostasie calcique perturbée qui peuvent mener à l’apoptose.

Parmi les gènes associés aux formes familiales de la PD, on a montré que plusieurs d’entre eux pouvaient avoir une localisation mitochondriale et sont impliqués dans la fonction mitochondriale comme la parkine ⁵⁸, PINK1 ^59-61, DJ-1 ⁶² ou HtrA2/Omi ⁶³.

III. Génétique de la maladie de Parkinson

On observe que 5 à 10 % des cas de PD peuvent être rattachés à une histoire familiale et présentent une transmission mendélienne. Ces patients présentent souvent une apparition précoce de la maladie. Des études de liaison (linkage) et de clonage positionnel ont mis en évidence six gènes et quatre autres loci associés à la maladie de Parkinson. La découverte de ces gènes a permis l’étude de facteurs qui mènent à la dégénérescence neurologique dans la PD.

1. Gènes causant une maladie de Parkinson autosomale dominante 1.1 α-synucléine

Le premier gène à avoir été identifié comme associé à la PD est le gène de l’α-synucléine.

Cette protéine est le composant fibrillaire principal des corps de Lewy dans les cas familiaux mais aussi dans les cas sporadiques de la PD ⁶⁴ ce qui a suscité un grand intérêt de la communauté scientifique. On a mis en évidence deux types de mutations associées à la maladie de Parkinson : soit des mutations ponctuelles entraînant la production d’un variant protéique « missense » ^65-67 soit des duplications voire des triplications de l’entièreté du gène ⁶⁸ entraînant une surexpression importante de l’α-synucléine.

L’α-synucléine physiologique se présente sous la forme d’un monomère auto-inhibé partiellement reployé ⁶⁹ et possède une plasticité de conformation dépendant de l’environnement ⁷⁰. Les mutations ponctuelles, mais aussi les polyamines et les ions cuivre, déstabilisent le monomère et en modifient la structure pour mettre la protéine dans un état non replié ^71-73. Dans cet état, l’α- synucléine forme un feuillet β puis des oligomères et enfin des fibrilles qui se déposent pour former les corps de Lewy ⁷⁴. Le mécanisme exact de toxicité neuronale liée au changement de conformation de l’α-synucléine n’est que peu compris, mais il semble que ce soit la forme oligomérique qui soit toxique.

D’une part, on observe des corps de Lewy chez environ 10 à 15 % des adultes de plus de 65 ans qui ne présentent pas de signes cliniques ou pathologiques de la PD ⁷⁵, suggérant que les corps de Lewy en eux-mêmes ne sont pas toxiques. De plus les patients atteints de triplications de l’α- synucléine ont un taux d’oligomères important ⁶⁸. On a suggéré que la formation de corps de Lewy est une manière pour la cellule de réduire la concentration de l’α-synucléine oligomérique et constitue donc un mécanisme de neuroprotection ^{10, 76}.

D’autre part, dans les modèles animaux, la toxicité neuronale se manifeste en l’absence d’agrégats d’α-synucléine. En effet, dans des modèles de surexpression de l’α-synucléine dans la substance noire de rat par un vecteur lentiviral, on observe une toxicité sélective pour les neurones dopaminergiques, mais sans inclusions fibrillaires ⁷⁷. De plus certaines des mutations pathogènes dans l’α-synucléine favorisent l’oligomérisation mais pas la formation de fibrilles ⁷⁸. La toxicité causée par les oligomères d’α-synucléine pourrait être causée par une perforation des vésicules synaptiques ^{79, 80}.

On ne connaît pas précisément la voie de dégradation normalement utilisée pour l’α- synucléine, mais la présence de sous-unités du protéasome et d’ubiquitine dans les corps de Lewy permet de soupçonner fortement l’implication du protéasome dans la pathogénicité de l’α- synucléine⁸¹. Néanmoins, l’α-synucléine peut aussi être dégradée via la voie de l’autophagie médiée par les chaperonnes. On a montré que les mutants pathogènes de l’α-synucléine sont bien localisés par les chaperonnes sur le lysosome, mais ils restent liés aux récepteurs des lysosomes et ne sont pas internalisés, bloquant ainsi la fonction du lysosome et l’élimination d’autres protéines ⁸².

L’α-synucléine est aussi impliquée dans la régulation de la mitochondrie, mais le mécanisme demeure inconnu ⁸³. On a récemment identifié un signal de localisation mitochondriale cryptique dans la partie N-terminale de l’α-synucléine et détecté la protéine à la membrane interne de la mitochondrie⁸⁴. Ces auteurs ont aussi démontré que l’accumulation d’α-synucléine peut interférer avec la fonction du complexe 1. Par ailleurs, l’α-synucléine agit comme un modulateur de stress oxydatif ⁸⁵ et les souris transgéniques KO pour l’α-synucléine sont résistantes aux toxines mitochondriales ⁸⁶. 1.2 Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2)

On a montré que des mutations « missenses » tout le long du gène LRRK2 sont associées au développement de la PD ^{87, 88}. En particulier, la mutation G2019S a été détectée dans 5-6 % des cas de maladie de Parkinson familiale autosomale dominante, mais aussi dans 1-2 % des cas sporadiques de PD ⁸⁹. Néanmoins, la présence d’un autre variant, le G2385R, associé à la PD chez 3 % de sujets contrôles, semble indiquer qu’il s’agit plus d’un allèle de risque plutôt que d’un gène associé avec la PD avec une haute pénétrance.

La protéine LRRK2 endogène est ubiquitaire dans les neurones, on la trouve associée aux membranes et aux « lipid raft ». La protéine est présente dans les terminaisons présynaptiques, associée aux vésicules et aux endosomes, mais aussi à la membrane externe de la mitochondrie et à l’appareil de Golgi ^{90, 91}. On a montré récemment que LRRK2 régule l’endocytose de vésicules synaptiques en interagissant directement avec le marqueur protéique de l’endosome précoce, Rab5 ⁹². La fonction physiologique de LRRK2 n’est pas clairement définie. Il semble néanmoins que LRRK2 soit impliquée dans la régulation de la morphologie des neurites et ce via le processus d’autophagie ^93,

94. La protéine LRRK2 interagit avec la protéine Parkine (qui cause un parkinsonisme juvénile lorsque mutée), la β-tubuline et la moesine mais pas avec l’α-synucléine ^95-97.

Certaines mutations liées à la maladie de Parkinson, comme la mutation G2019S, augmentent

l’activité kinase de LRRK2 de 2-3 fois, indiquant donc qu’un gain de fonction de cette protéine est impliqué dans le mécanisme pathologique de LRRK2. Quelques études ont montré que c’est bien l’activité kinase des mutants qui est responsable de la toxicité neurale et que cette activité kinase dépendait à son tour de l’activité de son domaine ROC/GTPase N-terminal ^98-101.

2. Gènes causant une maladie de Parkinson autosomale récessive 2.1 Parkine

Les mutations dans le gène de la parkine ont été identifiées comme étant la cause la plus commune de PD autosomale récessive précoce, comptant pour à peu près 50% de ces cas ¹⁰². Il est rare de trouver des mutations dans le gène de la parkine pour des cas de PD se développant après 45 ans.

La parkine est une protéine de 465 acides aminés généralement cytoplasmique, que l’on peut retrouver à la synapse et qui peut s’associer avec les membranes ^{103, 104}. Elle est impliquée dans le processus de dégradation des protéines par l’ubiquitination en tant qu’ubiquitine ligase ^{105, 106}. La protéine parkine est impliquée dans la modulation et le remplacement de différentes protéines présynaptiques dont l’α- synucléine et une protéine liant l’α- synucléine , la synphiline ¹⁰⁷. Certaines des mutations de la parkine associées à la maladie de Parkinson détériorent sa fonction ubiquitine ligase, entraînant l’accumulation intracellulaire de ses substrats ¹⁰⁸. On a aussi montré que la parkine n’entraînait pas seulement une ubiquitination sur la lysine 48 (K48) qui dirige la protéine vers la dégradation via le protéasome, mais aussi sur la lysine 63 (K63) qui cible la protéine ubiquitinylée vers la dégradation par autophagie ^{109, 110}. Ceci pourrait jouer un rôle dans la signalisation cellulaire, mais aussi dans la formation des corps de Lewy. Par conséquent, une perte de fonction de la protéine parkine pourrait entraîner un dysfonctionnement dans les deux processus de dégradation des protéines, le protéasome et l’autophagie.

La protéine parkine compense les dysfonctionnements de la mitochondrie chez la drosophile déficiente pour la protéine PINK1, elle aussi impliquée dans des formes autosomales récessive de la PD ⁵⁹. On a récemment montré que la perte du gène de la parkine aggrave les dommages mitochondriaux chez la souris surexprimant l’α-synucléine ¹¹¹. Il semble que la protéine parkine soit impliquée dans la protection de la cellule contre les stress oxydatifs.

2.2 PTEN induced kinase 1 (PINK1)

Des mutations dans le gène PINK1 ont été identifiées comme étant une cause de parkinsonisme précoce autosomal récessif ⁶¹. Il s’agit d’une protéine mitochondriale de 581 acides aminés agissant comme sérine/thréonine kinase ¹¹².

On a montré que la kinase PINK1 et la parkine font partie de la même voie de signalisation avec un lien direct entre PINK1 située en amont et la parkine ⁵⁹. On a aussi montré que PINK1 était liée à la machinerie de fusion et de fission de la mitochondrie ^{113, 114} et que la perte de fonction de cette protéine entraîne des dommages mitochondriaux dans des cellules humaines in vitro ⁶⁰.

Le premier substrat de PINK1 identifié est la protéine chaperonne mitochondriale TRAP1 (TNF receptor associated protein 1). En phosphorylant TRAP1, PINK1 bloque le larguage du cytochrome C de la mitochondrie et protège ainsi la cellule d’une mort cellulaire induite par le stress oxydatif. Les mutations de PINK1 liées à la PD détériorent cette activité ¹¹⁵. Une autre protéine intéressante, Omi /HtrA2, est aussi dépendante de PINK1 pour sa modulation. En effet, lorsque la p38, une protéine impliquée dans la signalisation du stress cellulaire, est activée HtrA2 subit une phosphorylation dépendante de PINK1 ¹¹⁶.

2.3 Omi/HtrA2

La sérine protéase HtrA2, aussi appelée Omi, est une protéine anti-apoptotique localisée dans l’espace inter-membranaire de la mitochondrie ⁶³. Le knock-out de cette protéine chez la souris entraîne une neurodégénérescence avec des signes de dysfonctionnement des neurones moteurs, d’ataxie et de parkinsonisme avec des atteintes striatales ¹¹⁷. On a montré la présence d’une mutation (G399S) dans le gène Omi chez quelques patients atteints de maladie de Parkinson tardive ¹¹⁸.

2.4 DJ-1

Les mutations dans le gène DJ-1 sont des causes rares de la PD autosomale récessive ^{119, 120}. Elles entraînent une maladie précoce et d’évolution lente. La fonction physiologique de DJ-1 n’est pas connue, pas plus que son rôle dans la dégénérescence dopaminergique, mais certains indices semblent lier cette protéine à la réponse au stress oxydatif et à la fonction mitochondriale ¹²¹. DJ-1 a une localisation cytoplasmique mais est aussi présente dans l’espace intra-membranaire et la matrice de la mitochondrie ⁶². On a montré qu’en cas de stress oxydatif, DJ-1 se transloque à la membrane externe de la mitochondrie et que cela apporte une certaine neuroprotection ¹²².

2.5 ATP13A2

On a récemment identifié des mutations « perte de fonction » dans le gène ATP13A2 comme associées à la PD ¹²³. L’ATP13A2 appartient à la super famille des ATPases P5 de type P qui servent généralement de pompe à ions pour maintenir un gradient ionique de part et d’autre d’une membrane cellulaire. Ce mécanisme est généralement réversible et l’ATPase utilise alors le gradient de membrane pour produire de l’ATP ¹²⁴. On ne sait pas comment cette perte de fonction est impliquée dans la pathogenèse de la PD, ni si cette protéine interagit avec d’autres protéines impliquées dans la maladie de Parkinson. Dans certains modèles cellulaires, cette protéine est associée au lysosome et sa forme mutante est retenue dans le réticulum endoplasmique puis dégradée par le protéasome ¹²³.

En conclusion, même si différents gènes sont associés à des formes monogéniques de la PD, il ne se dégage pas de mécanisme commun. Les études de ces gènes et des mécanismes pathologiques dans les formes idiopathiques de la PD ont mis en évidence différentes voies métaboliques impliquées et éventuellement en connexion les unes avec les autres et susceptibles de se stimuler mutuellement.

IV. Modèles animaux de la maladie de Parkinson

Pour étudier la PD, les chercheurs utilisent différents modèles animaux. Parmi ceux-ci, on distingue les modèles neurotoxiques dont les plus classiques sont basés soit sur l’utilisation systémique du méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP), soit sur l’injection stéréotaxique de 6- hydroxydopamine (6-OHDA) ¹²⁵. Ces deux toxines tuent sélectivement les neurones dopaminergiques de la SN. Il est intéressant de noter que la 6-OHDA est classiquement injectée unilatéralement, entraînant une asymétrie du comportement spontané ou induit par des drogues. Cette asymétrie peut être quantifiée et permet donc de mesurer l’efficacité d’un traitement à réduire cette asymétrie. Il existe aussi des modèles transgéniques basés sur la surexpression de protéines impliquées dans des formes familiales de la PD comme l’α-synucléine ¹²⁶ et des modèles utilisant des virus recombinants pour surexprimer des protéines impliquées dans la pathogenèse de la PD ^{127, 128}.

V. Traitements existants

A ce jour, il n’y a pas de traitement curatif pour la PD. Les traitements actuellement offerts aux patients ne permettent qu’une amélioration symptomatique. Même s’ils sont conçus pour offrir aux malades une amélioration de leurs capacités fonctionnelles la plus longue possible, ces traitements ne parviennent pas à arrêter la maladie.

Il y a plusieurs axes pour le traitement de la maladie de Parkinson. D’une part, on peut chercher

à rétablir une signalisation dopaminergique dans le Cpu des patients en utilisant des composés médicamenteux qui facilitent la production de dopamine ou qui imitent les effets de la dopamine. Une autre approche, plus ancienne, consiste à utiliser la chirurgie pour compenser les symptômes moteurs de la maladie.

1. Les traitements médicamenteux dopaminergiques

Les différents traitements médicamenteux existants pour la PD sont basés sur la biologie de la dopamine et cherchent à augmenter la biodisponibilité de la dopamine aux synapses dopaminergiques striatales.

L’administration du précurseur de la dopamine, la L-dopa, permet d’augmenter la synthèse de dopamine dans le striatum car elle permet de contourner l’étape de conversion de la tyrosine par la TH, étape limitante pour la synthèse de la dopamine. La plupart des patients réagissent bien à la L-dopa et connaissent une amélioration importante de leurs symptômes moteurs ; néanmoins les symptômes non moteurs ne sont pas affectés ¹²⁹. De plus, la maladie progressant, toute une gamme d’effets secondaires vont se manifester, parmi lesquels un phénomène On-Off (alternance d’effet et d’absence d’effet de la L-dopa), un estompement de plus en plus rapide de l’effet d’une prise de L-dopa, une absence d’effets, une akinésie et des dyskinésies ^{130, 131}.

Par ailleurs, on utilise des inhibiteurs d’AADC ne traversant pas la barrière hémato-méningée pour augmenter la biodisponibilité cérébrale de la L-dopa ¹³² en bloquant la dégradation de la L-dopa dans le système sanguin. De la même manière l’entacapone, un inhibiteur de la COMT périphérique, est utilisé avec succès pour augmenter la biodisponibilité de la L-dopa dans le cerveau ^133-135.

Pour stimuler les récepteurs dopaminergiques du striatum, on utilise aussi des agonistes dopaminergiques. Les agonistes ont montré une bonne efficacité pour contrôler les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson et pour réduire les périodes Off ¹³⁶.

2. Les traitements chirurgicaux 2.1 La thalamotomie

Avant la découverte de l’effet de la L-dopa sur les patients, la thalamotomie était le traitement le plus efficace pour contrôler le tremblement au repos contralatéral et dans une certaine mesure la rigidité des muscles squelettiques ^137-139. Néanmoins, ces traitements chirurgicaux étaient limités par le peu d’effets qu’ils avaient sur la bradykinésie en plus de la morbidité importante associée à une

chirurgie bilatérale, ce qui les a fait abandonner rapidement après l’introduction de la L-dopa.

2.2 La stimulation haute fréquence du noyau sous-thalamique ou stimulation du cerveau profond

Durant les années 80 une approche non lésionnelle est venue relancer le champ des traitements chirurgicaux de la PD avec la stimulation haute fréquence du thalamus à l’aide d’électrodes implantées¹⁴⁰ aussi appelée stimulation profonde du cerveau (deep brain stimulation, DBS).

La stimulation à haute fréquence des noyaux de la base implique la pose stéréotaxique d’électrodes de stimulation dans le STN. L’électrode va émettre un champ électrique de haute fréquence qui va inhiber les neurones glutamatergiques stimulateurs qui projettent dans le globus pallidus (Fig. 1c). Les neurones GABA-ergiques inhibiteurs du globus pallidus seront donc moins stimulés, ce qui permet de compenser du moins partiellement la levée de l’inhibition de leur activité entraînée par la chute de dopamine sécrétée dans le Cpu.

La DBS entraîne une amélioration considérable des symptômes moteurs des patients, tant le tremblement que la rigidité ou la bradykinésie ^141-143 permettant une baisse de la dose quotidienne d’équivalent de L-dopa (somme des doses de toutes les médications pondérées par leur affinité respective pour les récepteurs à la dopamine) d’environ 67 % après un an, taux qui reste stable durant les cinq années qui suivent la pose des électrodes ¹⁴³. La plupart des patients arrêtent la L-dopa pour revenir aux agonistes des récepteurs à la dopamine, évitant ainsi les risques de dyskinésies.

Comme on le voit, la DBS peut offrir une réelle amélioration de la qualité de vie des patients.

Néanmoins, ce traitement ne s’adresse qu’aux patients atteints de maladie de Parkinson idiopathique qui répondent bien à la L-dopa ¹⁴⁴. Elle est contre indiquée si il y a présence de démence ou de déficits cognitifs. De plus la progression de la maladie n’est pas altérée et les dégénérescences se poursuivent à un rythme inchangé ¹⁴⁵.

3. Les traitements neuroprotecteurs et neurorégénératifs

Les thérapies actuelles sont basées sur le remplacement de la dopamine striatale. Ces approches ont apporté une amélioration remarquable des symptômes moteurs pour les patients, néanmoins aucune de ces thérapies n’a apporté de restauration des neurones dopaminergiques, ni même protégé les neurones dopaminergiques survivants chez les patients. Les traitements dopaminergiques actuels soulignent le rôle central de la dégénérescence nigro-striée dans la symptomatologie de la PD.

3.1 Les traitements par des facteurs de croissance

Durant la progression de la PD, la dégénérescence fonctionnelle des neurones dopaminergiques s’étend sur une longue durée. Les symptômes moteurs deviennent évidents seulement après la perte de plus de la moitié des neurones dopaminergiques de la SNpc ^146-148. Cette dégénérescence progressive suggère qu’une stratégie visant à protéger les neurones de la mort cellulaire, voire à promouvoir leur croissance et leur régénération, puisse être d’un intérêt particulier. Dans cette optique, de nombreux facteurs neurotrophiques ont été testés comme agents potentiels de neuroprotection ^149-152. Le GDNF a émergé de ces études comme étant le facteur le plus puissant pour les neurones dopaminergiques^{153, 154}. De même, la neurturine (NTN) est apparue comme un facteur de croissance intéressant pour la PD car très proche du GDNF. Plus récemment le facteur de croissance dopaminergique conservé (conserved dopaminergic neurotrophic factor, CDNF) a été identifié comme un facteur prometteur dans le cadre d’une thérapie pour la maladie de Parkinson.

Les facteurs neurotrophiques sont rapidement dégradés dans le corps humain et ne traversent pas la barrière hémato-méningée. La délivrance directement dans le cerveau des patients est donc la seule option disponible à ce jour. Différentes stratégies d’administration de facteurs neurotrophiques dans le cerveau ont donc été élaborées pour promouvoir une neuroprotection voire une neurorégénération comme l’infusion de la protéine dans le cerveau ^155-159, les microsphères permettant un relargage progressif de la protéine ^160-162, l’implantation de capsules contenant des cellules modifiées génétiquement pour produire un facteur neurotrophique ^163-165 ou la thérapie génique tant in vivo ¹⁶⁶ qu’ex vivo ^167-171. Principalement trois grands types de vecteurs de transfert de gènes ont été testés pour exprimer du GDNF dans divers modèles animaux de la PD : les adénovirus, les virus adéno associés (AAV) et les lentivirus. Tous ont montré leur capacité à protéger et dans certains cas à restaurer les neurones dopaminergiques victimes de lésions (table 1).

Table 1 : Résumé des efficacités de différents vecteurs (adénovirus, AAV et lentivirus) exprimant le GDNF à induire la TH dans le striatum dans différents modèles animaux de la PD. Extrait de « Emerging restorative treatments for Parkinson’s disease”, Deierborg T., Progress in neurobiology 2008

3.2 Le GDNF

Le GDNF est un facteur neurotrophique appartenant à la famille du TGFβ (transforming growth factorβ). On a montré tant in vitro qu’in vivo que le GDNF a des propriétés antiapoptotiques et plus généralement neurotrophiques sur les neurones dopaminergiques ^172-175. En plus de cette capacité de cytoprotection, le GDNF promeut la régénération axonale et a des fonctions neurorestauratives. Par exemple, dans un modèle progressif de lésion dopaminergique rétrograde chez le rat (induite par une injection intrastriatale de la neurotoxine dopaminergique 6-hydroxydopamine, la 6-OHDA), l’infusion de GDNF protège presque complètement les neurones dopaminergiques de la SNpc ^175-178. Lorsque la lésion est striatale, le GDNF n’est capable de protéger les neurones que lorsqu’il est délivré au site de lésion ¹⁷⁹ et non dans la SNpc suggérant qu’il a une action différente sur les axones et les corps cellulaires comme le BDNF et le NGF ¹⁸⁰. On a aussi montré que le GDNF promeut le bourgeonnement axonal (axonal sprouting) à proximité de son site d’injection ^{176, 181}. Il est difficile à l’heure actuelle de savoir si ce phénomène est bénéfique pour une récupération fonctionnelle.

Le GDNF procure une protection durant une longue durée, ce fait entraînant des débats quant au mode de délivrance continue ou discontinue, voire ponctuelle. On a montré que l’on peut interrompre le traitement pendant des mois après avoir protégé les neurones d’une lésion à la 6-OHDA sans que la survie neuronale ne soit affectée ¹⁷⁸. De plus, des expériences chez le rat suggèrent que l’effet d’une dose unique de 10 µg peut durer jusqu’à 4 semaines ¹⁸² et qu’une infusion continue de 4 semaines entraîne une récupération sur le long terme ¹⁸³. Néanmoins, le fait que la maladie de Parkinson est une affection de longue durée durant laquelle les dégénérescences neuronales sont continues et à bas bruit, plaide pour une stratégie d’administration à long terme plutôt que ponctuelle.

Le GDNF a été testé chez l’humain en infusion intra-cérébrale. Lorsqu’il est injecté mensuellement dans le ventricule latéral il entraîne des effets secondaires comme des perceptions somatosensorielles perturbées ¹⁵⁸. Deux autres études en « open label » durant lesquelles le GDNF a été infusé directement dans le putamen (équivalent du striatum chez les primates) ont produit des résultats plus encourageants ^{155, 184}. En effet, les deux études suggèrent que le GDNF est capable d’améliorer certains symptômes moteurs. Une étude post-mortem de cerveaux de patients ayant participé à ces essais a montré que le GDNF stimule le bourgeonnement axonal (axonal sprouting) des neurones dopaminergiques innervant le putamen ¹⁸⁵.

Néanmoins, ces résultats encourageants ont été remis en question par une étude ultérieure. Il s’agit d’un essai clinique en « double blind placebo-controlled » d’infusion directe de GDNF dans le putamen. Dans cet essai les doses de GDNF étaient plus basses et l’infusion s’est faite via un cathéter plus large que dans les essais précédents. Les auteurs n’ont pas pu mettre en évidence d’améliorations des symptômes moteurs des patients. De plus, certains patients ont développé des anticorps contre cette protéine ¹⁵⁶.

3.3 La neurturine

La neurturine est un analogue structurel et fonctionnel du GDNF ¹⁸⁶. La NTN agit sur les neurones dopaminergiques via un complexe-récepteur composé des récepteurs au GDNF des familles α-1 et α-2 ^{187, 188}. Bien que le striatum soit dépourvu de récepteur spécifique pour la NTN, celle-ci peut agir via les récepteurs au GDNF, imitant son effet ¹⁸⁹ entraînant une neuroprotection et une neurorégénération identique à celle du GDNF in vitro ¹⁹⁰ comme in vivo ¹⁹¹. Un essai clinique de phase 1 en « open label » utilisant un vecteur de thérapie génique dérivé du virus adéno associé de sérotype 2 exprimant la NTN a été réalisé récemment ¹⁶⁶. Un an après la chirurgie, les patients semblent montrer

une amélioration de leurs symptômes moteurs mais étant donné le petit nombre de patients traités et du design de l’étude aucune conclusion définitive ne peut être tirée de cette étude. Un essai de Phase II a ensuite été mis sur pied comportant 58 patients. Dans un premier temps, après 1 an, aucun effet clinique statistiquement significatif n’a pu être démontré. Néanmoins, à plus long terme (18 mois), les patients traités à la NTN présentent une amélioration significative de leurs symptômes (http://www.ceregene.com/press_052709.asp).

3.4 Le CDNF

Le CDNF a des effets similaires au GDNF dans des modèles animaux de la PD ¹⁹². Ce facteur possède la capacité, lorsqu’il est administré préventivement, de protéger les neurones dopaminergiques des dommages causés par une injection striatale de 6-OHDA. De plus, lorsqu’il est administré quatre semaines après la toxine, il restaure la fonction dopaminergique et protège les neurones dopaminergiques de la mort cellulaire.

3.5 Les virus recombinants comme agents de thérapie génique

Etant donné la nature chronique et progressive de la maladie de Parkinson, l’utilisation de vecteurs viraux transgéniques pour la délivrance de facteurs neurotrophiques dans le cerveau des patients est une alternative intéressante. En effet ces systèmes permettent une expression locale stable sur une longue durée en une seule intervention alors que les autres systèmes (sauf les transferts de gènes ex vivo) nécessitent une maintenance voir des réadministrations et impliquent un stockage des facteurs neurotrophiques durant un certain temps, stockage susceptible d’entraîner des problèmes liés à la stabilité de ces protéines.

L’absence de toxicité, d’immunogénicité ainsi que la stabilité génétique sont les principaux critères de sécurité permettant de sélectionner un vecteur susceptible d’être utilisé en clinique.

Les adénovirus peuvent transduire des cellules en prolifération comme quiescentes, ont une capacité de clonage assez grande, permettent une expression forte de leur transgène et de plus peuvent être transportés de manière rétrograde par les axones, permettant une transduction de l’ensemble de la voie nigro-striée lorsqu’ils sont injectés dans le striatum ¹⁹³. Néanmoins, les vecteurs adénoviraux peuvent déclencher une réponse inflammatoire sévère qui peut entraîner une perte de l’expression à long terme.

Les vecteurs lentiviraux ont été développés plus récemment. Ils ont eux aussi une grande

capacité de clonage, sont capables de transduire des cellules en division comme post-mitotiques avec une grande efficacité, sont peu toxiques et permettent une expression à long terme. Néanmoins, ces vecteurs doivent s’intégrer dans le génome des cellules transduites pour pouvoir exprimer leurs transgènes. Cette intégration entraîne un risque de mutation insertionnelle qui peut perturber le fonctionnement normal des gènes aux alentours et peut mener à la formation de tumeurs.

Les vecteurs adéno associés (AAV) sont dérivés de virus non pathogènes et n’entraînent qu’une réaction immune faible. De plus ils ne s’intègrent pas dans le génome des cellules infectées mais se maintiennent sous forme épisomale. Ils permettent néanmoins une expression à long terme de leurs transgènes. Le seul inconvénient des vecteurs AAV est leur faible capacité de clonage (environ 4.5kb).

4. Autres approches de thérapie génique 4.1 Transduction du gène de la GAD dans le STN

Une approche de thérapie génique basée sur la même logique que la DBS est actuellement en développement. Il s’agit d’induire un changement phénotypique des neurones glutamatergiques excitateurs du STN en neurones GABA-ergiques inhibiteurs. Ce changement phénotypique peut être obtenu par le transfert d’un seul gène, l’acide glutamique décarboxylase (GAD) qui est l’enzyme responsable de la production de GABA à partir du glutamate dans le cerveau. Chez un patient atteint de la PD, le STN est suractif et surstimule le GPi et la SNpr. Si cette stimulation glutamatergique est transformée en inhibition GABA-ergique, on peut théoriquement espérer une baisse de l’activité inhibitrice du GPi et du SNpr, et donc une amélioration des symptômes moteurs (fig 1d).

Cette approche a entraîné l’établissement d’un protocole d’essai clinique de phase 1 en « open label » chez des patients parkinsoniens. Pour des raisons de sécurité, le transfert du gène de la GAD a été unilatéral. Les auteurs ont pu constater une amélioration significative des symptômes moteurs des patients du coté contralatéral à l’hémisphère traité un an après le traitement ¹⁹⁴.

4.2 Stratégie de thérapie génique dans le but de rétablir une synthèse de dopamine dans le striatum.

L’introduction de gènes impliqués dans la synthèse de la dopamine dans les cellules striatales est une autre approche de thérapie génique pour la PD. En effet, lors de la progression de la maladie, la dégénérescence des neurones dopaminergique réduit de plus en plus les capacités de production de la dopamine dans le striatum. C’est pour faciliter cette production que les patients se voient prescrire per