Organisation génomique

Le génome des AAV (fig.5) est composé d’un ADN simple-brin de 4,7 kb ⁵²³. Les génomes sens ou antisens sont encapsidés à la même fréquence ⁵²⁴. Le génome des AAV est caractérisé par des séquences palindromiques inversées non codantes de 145 paires de bases (bp) appelées « inverted terminal repeat » (ITR) qui encadrent le génome viral.

La partie codante du génome est organisée en deux phases ouvertes de lecture (open reading frame, ORF), la première codant pour des protéines non structurales Rep et la seconde pour trois protéines de capside VP.

Figure 5 : Organisation du génome de l’AAV2. Les gènes Rep et Cap sont encadrés par les ITR palindromiques. Les différents transcrits Rep et Cap sont produits à partir de leurs promoteurs respectifs (p5, p19, p40). L’étoile indique le codon start alternatif (ACG) utilisé pour la production de VP3.

L’expression des protéines des AAV est contrôlée par trois promoteurs appelés p5, p19 et p40 en fonction de leur position sur une échelle graduée de un à cent et représentant le génome AAV complet. On a aussi montré que les ITR possèdent des éléments promoteurs/enhancer susceptibles de contribuer à l’expression des gènes viraux ^{525, 526}. Les transcrits produits à partir des promoteurs p5, p19 et p40 possèdent un intron commun ⁴⁹⁶ et utilisent la même séquence de polyadénylation. Les promoteurs p5 et p 19 contrôlent l’expression des protéines régulatrices Rep78, Rep 68, Rep52 et Rep 40, d’après leur masse moléculaire approximative exprimée en kiloDalton (kDa) ⁴⁹⁶. Les plus grandes des protéines Rep (Rep78 et Rep68) sont produites à partir du promoteur p5 alors que les petites protéines Rep52 et Rep40 sont produites à partir du promoteur p19. Rep78 et Rep 68 sont synthétisées à partir de transcrits respectivement non-épissés et épissés et sont des protéines régulatrices

importantes qui agissent en trans durant toutes les phases du cycle biologique de l’AAV. Ces protéines régulent positivement et négativement l’expression des gènes AAV respectivement en présence ou absence de virus assistant et sont impliquées dans la réplication de génome ⁵²⁷. Les protéines Rep52 et Rep40 produites à partir de transcrits respectivement non-épissés et épissés et sont impliquées dans l’accumulation de génomes viraux simple-brin utilisés pour l’encapsidation ⁵²⁸. Les quatre protéines Rep possèdent une activité hélicase et ATPase. Les deux protéines Rep78 et Rep68 possèdent en plus une activité brin et site spécifique de liaison à l’ADN (sur le RBE) et brin et site spécifique d’endonucléase (nicking au TRS) ^{529, 530}.

L’ORF de droite contient le gène Cap qui code pour les trois protéines de capside VP1, VP2, et VP3. Un épissage alternatif permet de produire deux transcrits à partir du promoteur p40. Le plus grand transcrit (non épissé) produit la protéine VP1 (87kDa). L’autre transcrit est épissé et produit les protéines VP2 (72kDa) et VP3 (62kDa). VP1 est traduite à partir d’un codon start ACG non conventionnel, alors que VP3 utilise le codon AUG conventionnel situé en aval.

Figure 6 : Structure secondaire de l’ITR de l’AAV2. Les ITR servent d’origine de réplication aux AAV et peuvent se présenter sous deux conformations : flip et flop. Les formes flip (représentées ici) et flop présentent respectivement les palindromes B-B’ et C-C’ plus proche de l’extrémité 3’. Le motif encadré correspond au Rep binding site (RBS). Le motif ombré représente un motif RBS alternatif (RBS’) servant à stabiliser le complexe ITR-protéines Rep. La séquence soulignée correspond au site de résolution terminale, site de clivage spécifique médié par les protéines Rep et étape-cléf de la réplication du génome viral. Adapté de « Adeno-associated virus : from defective virus to effective vector », Gonçalves M. A. F. V., virology journal, 2005.

Figure 7 : Modèle de la réplication du génome d’AAV. (a) les ITR encadrant le génome prennent spontanément une conformation en épingle à cheveux. (b) La réplication du génome débute par la génération d’une molécule d’ADN double brin par l’extension du palindrome à l’extrémité 3’ qui sert d’amorce à la synthèse de l’ADN, l’élongation déplaçant l’ITR 5’. Il en résulte une molécule d’ADN double brin soudé en 3’ appelée réplication form 1 (RF1). (c) La protéine Rep 78/68 se lie au RBS et coupe l’ADN sur le TRS sur le brin parental. (d) Cette coupure permet la finalisation de la copie du brin parental. (e) Les palindromes à l’extrémité du génome se reploient en épingle à cheveux. (f) Par un mécanisme dit "de synthèse par déplacement" du génome d’AAV néosynthétisé, la polymérisation à partir de l’extrémité 3’OH de l’épingle permet de copier, à nouveau, le brin parental d’AAV. Cette étape permet de générer la molécule intermédiaire RF1 ainsi qu’une molécule d’ADN simple brin encadrée par deux palindromes prête à être encapsidée en une nouvelle progéniture de virions d’AAV. Extrait de « Biology of adeno-associated virus », Berns K. I., Curr. Top Microbiol. Immunol., 1996.

Les 125 premières bases des ITR présentent une séquence palindromique et se reploient spontanément en épingle à cheveux (fig. 6) ^{531, 532}. Les vingt bases suivantes ne sont pas appariées et sont appelées « séquence D ». Les ITR présentent deux motifs indispensables à leur fonction : un motif de liaison pour les protéines Rep78/68 appelé RBS (Rep binding site) et un site de clivage spécifique pour les protéines Rep78/68 appelé TRS (terminal resolution site) ⁵³³. La séquence RBS est utilisée

pour positionner la protéine Rep correctement en vue du clivage spécifique de l’ADN au niveau du TRS. Ce clivage est une étape indispensable pour la réplication du génome viral (fig. 7) ⁵³³. La structure en épingle à cheveux des ITR permet au génome simple-brin de présenter une amorce permettant l’initiation de la réplication de l’ADN viral, servant d’origine de réplication au cours du cycle viral. Par ailleurs, les ITR sont les seules séquences nécessaires en cis pour la réplication et l’encapsidation du génome AAV mais aussi pour son intégration dans le génome de la cellule hôte ainsi que pour son excision à partir d’un plasmide ou du génome cellulaire 534. Cette caractéristique permet la génération de virus recombinants car on peut remplacer la totalité du génome viral par une cassette d’expression à la condition de conserver la taille du génome et la présence des ITR ⁵³⁵.