Dissection de voies inflammatoires rétiniennes dans les modèles d’uvéités auto-immunes par des vecteurs viraux rapporteurs utilisant des séquences transcriptionnelles spécifiques.
Les uvéites auto-immunes sont des atteintes auto-immunes de l’œil. Elles sont caractérisées par la présence anormale de cellules inflammatoires dans un ou plusieurs des segments de l’œil. L’œil est considéré comme étant un organe immuno-privilégié car il possède différents mécanismes permettant de maintenir sous contrôle les réactions inflammatoires et immunitaires. Néanmoins dans certaines circonstances, des lymphocytes T auto-réactifs activés dans les organes périphériques peuvent passer la barrière hémato-rétinienne. On observe alors des réponses immunitaires associées avec de l’inflammation intra-oculaire et des dommages rétiniens.
On considère que les lymphocytes auto-réactifs CD4+ possédant un phénotype Th1 sont des acteurs critiques dans la pathogenèse des uvéites auto-immunes expérimentales, modèles animaux des maladies auto-immunes oculaires. Les lymphocytes Th1 sont entre autres caractérisés par la production d’interféron γ (INFγ) et d’interleukine 2 (IL-2). Plus récemment un autre phénotype de lymphocyte CD4+ effecteur, Th17, a été impliqué comme un des acteurs majeurs dans la pathogenèse des uvéites auto-immunes. Les lymphocytes Th17 sont caractérisés par la production d’interleukine 17 (IL-17), d’IL-21 et d’IL-22.
La réactivation oculaire des lymphocytes T auto-réactifs est une étape cruciale pour la pathogenèse des uvéites auto-immunes. Pour ce faire, les lymphocytes T nécessitent l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité de type II (MHCII) et de molécules de co-stimulation. On considère que ces stimuli sont apportés par des macrophages et des cellules dendritiques ayant infiltré la rétine. Par ailleurs, certaines cellules résidentes de l’œil dont les cellules de Müller, les astrocytes, les cellules microgliales et les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien possèdent la capacité d’exprimer le MHCII. Néanmoins, en conditions normales, ces cellules résidentes de l’œil n’expriment pas de MHCII. Il est donc probable qu’il existe un dialogue moléculaire entre les lymphocytes infiltrants l’œil et les cellules résidantes de l’œil possédant des capacités de présentation d’antigène.
Si l’activation de voies de transduction du signal par l’interféron γ entraînant l’activation de STAT1 et sa fixation sur les séquences GAS est bien documentée, il est probable que d’autres facteurs de transcription soient aussi activés lors de la liaison de l’interféron γ sur son récepteur. Il est possible d’étudier l’activation de facteurs de transcription dans les extraits nucléaires de cellules soumises à certaines conditions en utilisant la technique de microarray, en effet les facteurs de transcription sont souvent auto-régulés au niveau de leur transcription. On peut confirmer l’activation effective des facteurs de transcription candidats mis en évidence par microarray en utilisant les techniques d’immunoprécipitation de chromatine et par des tests dérivés de la technologie ELISA.
Dans ce projet nous désirons utiliser cette approche pour mettre en évidence dans les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien l’activité de facteurs de transcription à différents moments au cours d’une uvéite auto-immune expérimentale (UAE). L’épithélium pigmentaire rétinien sera disséqué à partir des rétines des animaux traités.
Les facteurs ainsi mis en évidence seront ensuite étudiés pour leur cinétique d’activité durant l’uvéite expérimentale grâce à des vecteurs AAV recombinants exprimant une protéine rapportrice sous le contrôle de la séquence consensus spécifique injectés dans l’oeil. Par exemple, une cassette constituée de séquences liant le facteur NF-κB activé placée en amont de la séquence du gène rapporteur GFP est susceptible d’entraîner l’expression de la GFP si la cellule transduite est exposée au TNFα, à l’IL-1 ou à l’IL-17. Ces outils pourraient nous permettre d’étudier in vivo la cinétique d’activité des facteurs de transcription dans certains types cellulaires par examen fluorescent du fond l’œil.
On a montré que certains sérotypes d’AAV entraînent une expression de leur transgène préférentiellement dans certains types cellulaires résidents de l’œil ; par exemple le rAAV2/1 entraîne l’expression de son transgène dans les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien lorsqu’il est injecté dans l’espace sous rétinien du rat ou le variant ShH10 du sérotype 6 d’AAV entraîne l’expression du transgène majoritairement dans les cellules de Müller après injection intravitréenne.
L’uvéite auto-immune expérimentale peut être induite soit par immunisation contre un antigène rétinien, soit par transfert adoptif de lymphocytes T autoréactifs. Il est possible d’orienter les lymphocytes vers une réponse Th1 ou Th17 avant de procéder au transfert adoptif et donc d’étudier la contribution respective de ces deux populations à la pathologie.
Dans ce projet nous nous proposons de mettre en évidence des facteurs de transcription impliqués dans la réponse des cellules de la barrière hémato-rétinienne aux conditions d’uvéite auto-immune expérimentale, d’utiliser ces connaissances pour mettre au point des vecteurs rAAV rapporteurs répondant à l’activation des facteurs de transcription mis en évidence et d’étudier dans certaines cellules rétiniennes les cinétiques d’activation de ces facteurs de transcription à l’aide des vecteurs rapporteurs développés précédemment.
Ce travail pourrait permettre
i) De mieux définir des cibles thérapeutiques relevantes au sein des voies de transduction impliquées dans l’UAE ;
ii) de sélectionner une ou plusieurs séquences consensus répondant aux facteurs de transcription pour la régulation, par l’évolution de la pathologie elle-même, de transgènes thérapeutiques exprimés dans la rétine à partir de vecteurs rAAV.
L’utilisation d’autres sérotypes présentant une affinité forte pour d’autres types cellulaires de la rétine (astrocytes, photorécepteurs, etc.) peut permettre d’étendre à ces types cellulaires l’étude de l’activation des facteurs de transcription au cours de l’UAE.
Références
Cheung,E. and Kraus,W.L. (2010). Genomic analyses of hormone signaling and gene regulation. Annu. Rev. Physiol 72, 191-218.
Kerr,E.C., Copland,D.A., Dick,A.D., and Nicholson,L.B. (2008). The dynamics of leukocyte infiltration in experimental autoimmune uveoretinitis. Prog. Retin. Eye Res. 27, 527-535. Surace,E.M. and Auricchio,A. (2008). Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Res. 48, 353-359.
RESUMÉ
La maladie de Parkinson se caractérise entre autres par une dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNpc) qui innervent le striatum. Cette dégénération entraîne une baisse de la sécrétion de dopamine dans le striatum qui est responsable de la majorité des symptômes moteurs de la maladie de Parkinson. Plusieurs approches ont été étudiées pour le traitement de la maladie de Parkinson : i) restaurer une synthèse de dopamine dans le striatum par une greffe striatale de neurones dopaminergique ou par un transfert striatal de gènes impliqués dans la synthèse de la dopamine ; ii) protéger et stimuler les neurones dopaminergiques survivants dans la substance noire pars compacta des patients ; iii) corriger les déséquilibres de la boucle motrice engendrés par la baisse de stimulation dopaminergique du striatum ; iv) stimuler et recruter des progéniteurs cérébraux pour les faire se différencier en neurones dopaminergiques dans le striatum. Toutes ces approches thérapeutiques peuvent impliquer des transferts de gènes.
Les vecteurs dérivés des virus adéno-associés (rAAV) constituent des outils de choix pour le transfert de gènes dans les tissus cérébraux. Par ailleurs, de nombreuses applications nécessitent une régulation de l’expression du transgène. Nous disposons au laboratoire d’un vecteur rAAV inductible à la tétracycline (rAAV-TetON).
Nous décrivons dans ce travail :
i) le comportement du vecteur rAAV dérivé du sérotype 1 d’AAV utilisant la cassette d’expression TetON (rAAV2/1-TetON) comparé à celui du rAAV2/1 utilisant un promoteur constitutif pour l’expression du transgène (rAAV2/1-pCMV) dans le striatum et le mésencéphale (contenant la substance noire). A l’aide d’un vecteur rAAV2/1-TetON exprimant le GDNF, nous montrons que nous pouvons moduler le niveau d’expression du transgène dans le striatum par la dose d’inducteur administré aux animaux. Par ailleurs, nous montrons que le rAAV2/1-TetON présente dans le striatum une efficacité de transduction moindre que le rAAV2/1-pCMV mais qu’il présente un profil de biosécurité supérieur au rAAV2/1-pCMV car il limite fortement l’expression du transgène hors du striatum. De plus, le rAAV2/1-TetON n’entraîne pas de recrutement de lymphocytes T ni d’activation de la microglie dans le striatum. Lorsqu’il est injecté dans le mésencéphale, le vecteur rAAV2/1-TetON, contrairement au rAAV2/1-pCMV présente une expression préférentielle dans les neurones dopaminergiques de la SNpc et de l’aire tégmentale ventrale (VTA).
ii) le comportement des vecteurs rAAV2/1-pCMV et scAAV2/1-pCMV (vecteur « self-complémentaire » permettant une expression du transgène indépendamment de la synthèse du second brin du génome viral) dans la région neurogénique de la zone sous-ventriculaire (SVZ). Nous avons montré que les vecteurs rAAV2/1 infectent efficacement la SVZ et s’y expriment rapidement. Les vecteurs scAAV2/1 s’expriment plus rapidement dans la SVZ que les vecteurs rAAV2/1 (expression maximale à 24h et 48h, respectivement). De plus, les vecteurs rAAV2/1 présentent une efficacité de transfection importante pour les progéniteurs neuraux en prolifération (cellules C, transient amplifying progenitors) et les neuroblastes en migration (cellules A) mais pas pour les cellules souches neurales (cellules B). Nous observons, par ailleurs, que les rAAV2/1 induisent une baisse transitoire de la prolifération de la SVZ. Cet effet est indépendant de l’expression du génome et dépend donc probablement de la capside virale de nos vecteurs. De plus, cette baisse de prolifération n’induit pas d’apoptose. A long terme, nous observons des cellules exprimant le transgène dans la zone granulaire du bulbe olfactif, indiquant que la transduction des progéniteurs de la SVZ n’interfère pas avec leurs capacités de migration et de différenciation.
iii) l’efficacité de différents sérotypes de rAAV pour le transfert de gènes dans les cellules progénitrices neurales (NPC) in vitro. Nous avons montré que les rAAV peuvent transduire des NPC mais que l’efficacité spécifique des différents sérotypes testés varie en fonction de la région du cerveau fœtal et de l’espèce dont les NPC sont issues. Par ailleurs, les rAAV induisent une réduction drastique de la prolifération des cultures de NPC dépendante du sérotype de rAAV utilisé mais pas de l’origine fœtale des NPC ou de l’espèce dont elles sont issues.