Profils toxinogénique et de résistance aux antibiotiques des souches de Staphylocoques isolées des produits laitiers artisanaux fermentés vendus dans les établissements secondaires de Cotonou et d’Abomey-Calavi au Bénin.

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MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (MESRS)

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UNIVERSITE D'ABOMEY–CALAVI (UAC)

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MASTER INTER-FACULTAIRE EN NORMES ET CONTRÔLE DE QUALITE DES PRODUITS AGRO-ALIMENTAIRES (NCQPA)

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LABORATOIRE DE BIOLOGIE ET DE TYPAGE MOLECULAIRE EN MICROBIOLOGIE (LBTMM)

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Mémoire de fin de formation

THEME :

Présenté et soutenu le 31décembre 2019 par : Mme. Akoua Tania Laurelle AZA-GNANDJI

Devant le jury composé de :

Président du jury : Prof. Issaka ABDOU KARIM YOUSSAO Enseignant-Chercheur à l’EPAC

1^er Examinateur : Dr. Philippe SESSOU

(MA), Enseignant-Chercheur à l’EPAC

2^e Examinateur : Dr. Gabriel Assouan BONOU

Enseignant-Chercheur à l’EPAC Superviseur et rapporteur : Dr. Abdel Haziz SINA OROU

(MC), Enseignant-Chercheur à la FAST

Co-superviseur : Dr. Mamadou WELE

(MA), Enseignant à l’USTTB (Mali)

ANNEE ACADEMIQUE: 2018 – 2019

Profils toxinogénique et de résistance aux antibiotiques des

souches de Staphylocoques isolées des produits laitiers

artisanaux fermentés vendus dans les établissements

secondaires de Cotonou et d’Abomey-Calavi au Bénin.

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i Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

IN MEMORIUM

Feue CAKPO Irène épouse AZA-GNANDJI Sylvestre,

Reçois à travers cette plume qui laisse ses traces en route vers ce dont tu as toujours voulu de nous et proféré même aux derniers instants avant ta disparition, toute la paix de l’au-delà promise par l’Eternel aux personnes ayant laissé derrière elles, des souvenirs intenses te soient accordée.

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ii Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

DEDICACES

A :

 Mon père, pour m’avoir donné la vie. Tu veux le meilleur pour moi et tu es toujours là à m’encourager dans mes choix. Puisse le Seigneur t’accorder longue vie.

 Mon époux et mes enfants, maintenant, c’est un nouveau chapitre de notre vie qui va commencer et j’espère vous avoir toujours à mes côtés pour réaliser et affronter tout ce que la vie nous réserve désormais.

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iii Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

REMERCIEMENTS

Au terme de cette étude, il nous revient de remercier vivement tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réussite de ce travail. Nous remercions avant tout le Père céleste pour ces multitudes grâces dans nos vies.

Nos sincères remerciements vont :

 Au Dr. Abdel-Haziz SINA OROU, Maitre de Conférences (CAMES) en Biochimie, Biologie Moléculaire et Microbiologie au Département de Biochimie et de Biologie Cellulaire à la Faculté des Sciences et Techniques (FAST) de l’Université d’Abomey- Calavi (UAC), pour avoir accepté de diriger ce mémoire malgré ses multiples occupations scientifiques et administratives. Que Dieu, le Tout Puissant vous accompagne également dans votre mission.

 Au Dr. Mamadou WELE, Maitre-Assistant (CAMES) en Biochimie à l’Institut de Sciences Appliquées de l’Université des Sciences des Techniques et des Technologie de Bamako (Mali), pour avoir accepté de codiriger ce mémoire malgré vos multiples occupations scientifiques et administratives. Que Dieu vous bénisse.

 Au Prof. Lamine Saïd BABA MOUSSA, Professeur Titulaire des Universités en Biochimie, Microbiologie et Biologie Moléculaire, Directeur du Laboratoire de Biologie et de Typage Moléculaire en Microbiologie (LBTMM) de la Faculté des Sciences et Techniques (FAST), qui nous a accueillis dans son laboratoire comme un père afin que nous menions à bien nos recherches. Que Dieu vous bénisse et vous prête longue vie.

 Au corps professoral de Normes Contrôle Qualité des produits agroalimentaires (NCQPA) sans oublier tout le personnel administratif. Nous vous exprimons toute notre gratitude.

 Au Dr. Wassiyath Agnikè MOUSSE, merci d’avoir partagé avec nous votre savoir- faire. Vous avez été si patiente et si attentive en répondant à nos multiples préoccupations, merci pour tout. Que Dieu vous bénisse.

 A Mme Majoie Géroxie TOHOYESSOU, merci pour cette ambiance fraternelle et pour votre disponibilité malgré la rédaction votre thèse.

Nos remerciements vont également à l’endroit de l’équipe du LBTMM pour leur fructueuse collaboration et pour cette ambiance conviviale de travail, en particulier :

 Aux Docteurs : Durand DAH-NOUVLESSOUNON, Martial NOUNAGNON, Hafiz SALAMI, Christine N’TCHA, Nadège AGBODJATO.

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iv Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

 Aux Doctorants : Akim SOCOHOU, Bawa BOYA, Sylvestre ASSOGBA, Farid BADE, Halfane LEHMANE, Ricardos AGUEGUE, Olaréwadjou AMOGOU.

 Aux Mastorants et stagiaires : Olga QUENUM, Rodrigue TOLLO, Irène WINSOU, Marlène TCHANOU, Astride YEHOUENOU, Ulrich LEGBA, Scylax Barbara AZATASSOU.

 Au Président du Jury, nous vous disons de tout cœur merci d’avoir accepté cette lourde tâche qui est d’assurer la présidence de ce jury malgré vos multiples occupations. Recevez ici nos sentiments de profonde gratitude.

 Aux Membres du Jury, Merci pour l’honneur que vous nous faites en acceptant de juger ce travail en dépit de vos nombreuses tâches.

 A mes frères et sœurs pour votre soutien qui ne m’a jamais fait défaut, j’ai de la chance de vous avoir. Que ce travail soit l’expression de ma reconnaissance.

 A mes amis en particulier Emmanuella GANIERO et Etienne AFFOHOUNDE, merci pour tout.

Nos sincères remerciements vont à tous ceux qui n’ont pas été cités mais qui de près ou de loin ont contribué par divers moyens à l’aboutissement de ce travail.

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v Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

ABBREVIATIONS

CASFM : Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie ; ETA, ETB : Epidermolysine A et Epidermolysine B ;

FAO : Organisation des Nations Unies pour L'Alimentation et l'Agriculture ; LPV : Leucocidine de Panton et Valentine ;

MH : Muller Hinton ;

OMS : Organisation Mondiale de la Santé ; PBS: Phosphate Buffered Saline ;

pH : Potentiel Hydrogène ;

TIAC : Toxi-infection Alimentaire Collective ;

TSST : Toxine du syndrome de choc toxique staphylococcique ; YCP: Yeast Casamino-acid Pyruvate.

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vi Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Schéma des différentes combinaisons des gènes chromosomiques codants et leur

fréquence ... 10

Figure 2: Mode d’action des leucotoxines à deux composés . ... 12

Figure 3: Schéma illustrant la dilution décimale. ... 17

Figure 4 : Aspect des colonies de staphylocoques sur du Baird Parker enrichie au jaune d’œuf et au Tellurite de potassium. ... 18

Figure 5 : Aspect des tubes de staphylocogulase positive et négative. ... 20

Figure 6 : Aspect d’une galerie APIStaph après 18h d’incubation. ... 21

Figure 7 : Technique d’immunoprécipipitation radiale ou méthode d’OUCHTERLONY... 22

Figure 8 : Aspect d’une plaque de lecture des biofilms. ... 23

Figure 9: Présentation d'une boîte d'antibiogramme. ... 24

Figure 10: Environnement de vente des certains vendeurs fixes de yaourts, dèguè mil et couscous. ... 26

Figure 11 : Taux des différentes espèces de staphylocoques retrouvées. ... 28

Figure 12 : Répartition des souches de staphylocoques en fonction des villes. ... 30

Figure 13 : Répartition des souches de staphylocoques en fonction du moment de prélèvement. ... 30

Figure 14 : Taux de production de la biofilm en fonction des différentes espèces. ... 31

Figure 155 : Taux de production de toxines par les souches de staphylocoques. ... 31

Figure 16 : Taux de résistance des souches staphylocoques isolées aux antibiotiques. ... 32

Figure 17 : Profil d’antibiorésistance des souches de staphylocoques à coagulase négative isolées des produits laitiers. ... 32

Figure 18 : Taux de résistance aux antibiotiques des souches de S. aureus isolées. ... 33 Figure 19 : Diagramme de fabrication du yaourt. ... a Figure 20 : Diagramme de fabrication du dèguè. ... b

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vii Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

LISTES DES TABLEAUX

Tableau 1: Récapitulatif de quelques principaux germes pathogènes à l’origine de toxi- infections alimentaires, leur durée d’incubation, leurs symptômes et les denrées alimentaires contenant les produits laitiers. ... 6 Tableau 2: Normes utilisées pour la classification. ... 19 Tableau 3: Charge bactérienne en coliformes totaux et staphylocoques des échantillons collectées à Cotonou et à Abomey-Calavi. ... 27 Tableau 4 : Répartition des souches de staphylocoques en fonction des produits laitiers fermentés. ... 28

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viii Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

TABLE DES MATIERES

... 1

IN MEMORIUM ... i

DEDICACES ...ii

REMERCIEMENTS ... iii

ABBREVIATIONS ... v

LISTE DES FIGURES ... vi

LISTES DES TABLEAUX ... vii

TABLE DES MATIERES ... viii

RESUME ... xi

ABSTRACT ... xii

1. Introduction ... 1

2. Synthèse bibliographique ... 4

2.1. Les produits laitiers ... 4

2.1.1. Définition ... 4

2.1.2. Quelques produits fermentés artisanaux dérivés du lait... 4

2.1.2.1. Yaourt ... 4

2.1.2.2. Dèguè ... 4

2.1.3. Contamination microbienne des produits laitiers ... 5

2.2. Les toxi-infections alimentaires ... 5

2.2.1. Les intoxications ... 5

2.2.2. Les Infections ... 7

2.2.3. Les intoxinations ... 7

2.3. Généralités sur les staphylocoques ... 7

2.3.1. Définition et historique... 7

2.3.2. Taxonomie et classification ... 7

2.3.3. Ecologie des staphylocoques ... 7

2.3.4. Caractères morphologiques ... 8

2.3.5. Substances secrétées ... 8

2.3.5.1. Les enzymes ... 8

2.3.5.2. Facteurs de virulence : toxines ... 9

2.3.5.2.1. Entérotoxines ... 9

2.3.5.2.2. Les épidermolysines... 10

2.3.5.2.3. Leucotoxines ... 10

2.3.6. Les biofilms ... 12

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ix Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

2.3.7. Familles d’antibiotiques et leur mode d’action ... 13

2.3.7.1. Classification des antibiotiques et modes d’actions ... 13

2.3.7.1.1. Antibiotiques agissant sur la membrane ... 13

2.3.7.1.2. Antibiotiques agissant sur la synthèse du peptidoglycane ... 13

2.3.7.1.3. Antibiotiques inhibant la synthèse protéique ... 14

2.3.7.1.4. Antibiotiques agissant sur les acides nucléiques ... 14

3. Cadre, Matériel et Méthodes ... 16

3.1. Cadre d’étude ... 16

3.2. Méthodologie ... 16

3.2.1. Phase d’échantillonnage ... 16

3.2.2. Analyses microbiologiques des échantillons ... 16

3.2.2.1. Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales ... 17

3.2.2.2. Recherche des coliformes totaux et fécaux ... 17

3.2.2.3. Recherche des staphylocoques ... 17

3.2.2.4. Dénombrement des colonies ... 18

3.2.2.5. Isolement et identification des souches de staphylocoques ... 19

3.2.2.5.1. Coloration de Gram ... 19

3.2.2.5.2. Recherche de la staphylocoagulase libre ... 19

3.2.2.5.3. Recherche de la D-Nase ... 20

3.2.2.5.4. La galerie API® STAPH ... 21

3.2.2.6. Recherche des facteurs de virulence produits par les souches de staphylocoques (Leucotoxines et épidermolysines) ... 21

3.2.2.7. Formation de Biofilm ... 22

3.2.2.8. Antibiogramme des souches de staphylocoques isolées ... 23

3.2.3. Analyses des données ... 24

4. Résultats ... 26

4.1. Environnement des lieux de vente des produits laitiers fermentés ... 26

4.2. Qualité microbiologique des produits laitiers fermentés ... 27

4.2.1. Dénombrement des germes de staphylocoques et des Coliformes totaux dans les produits laitiers fermentés analysés ... 27

4.2.2. Différentes espèces de staphylocoques retrouvées dans les produits laitiers fermentés analysés ... 27

4.2.3. Répartition des souches de staphylocoques isolées en fonction des produits laitiers fermentés analysés ... 28

4.2.3. Répartition des souches de staphylocoques isolées en fonction des villes ... 29

4.2.4. Répartition des souches de staphylocoques isolées en fonction du moment de prélèvement ... 30

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x Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

4.3. Répartition de la formation de biofilm en fonction des espèces de staphylocoques isolées 30

4.4. Répartition de la production de toxines par les souches de staphylocoques isolées ... 31

4.5. Susceptibilité aux antibiotiques des souches de staphylocoques isolées ... 32

4.7. Susceptibilité aux antibiotiques des souches de Staphylococcus aureus isolées ... 33

5. Discussion ... 34

6. Conclusion et Perspectives ... 38

7. Références Bibliographiques ... 40 8.Annexes ... Erreur ! Signet non défini.

8.1. Diagrammes de fabrication du yaourt et du dèguè ... a 8.2. Composition et préparation des milieux de cultures ... c 8.3. Réactifs pour coloration du gel d’agarose ... e

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xi Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

RESUME

Les produits laitiers sont des aliments très nutritifs pour l’homme, mais les pratiques nécessaires à leur préparation, leur conditionnement et leur stockage favorisent parfois une contamination microbienne. L’objectif du présent travail était d’évaluer les profils toxinogénique et de susceptibilité aux antibiotiques des souches de staphylocoques isolées de trois types de produits laitiers fermentés artisanaux dans les villes de Cotonou et d’Abomey- Calavi.

Un total de 180 échantillons de yaourt, de dèguè-Couscous et de dèguè-Mil a été prélevé pour des analyses microbiologiques auprès de quinze vendeuses à raison de deux échantillons par jour (matin et soir) chez chacune d’elles deux fois dans la semaine. L’identification des souches de staphylocoques a été faite par la galerie ApiStaph. Les tests de recherche de staphylocoagulase et de DNase ont été faits sur les souches de staphylocoques isolées. La capacité de production des toxines (LukE/D, LukS/F et LPV) a été recherchée par la méthode d’OUCHTERLONY. La susceptibilité aux 15 antibiotiques testés a été réalisée par la méthode de Kirby Bauer. Enfin, la capacité des souches isolées à produire de biofilms a été évaluée.

Les résultats obtenus ont révélé que les échantillons étaient contaminés à 42,77% par des souches de staphylocoques. Les échantillons de yaourt et de dèguè-mil prélevés le soir étaient plus contaminés que ceux du matin. Les souches de S. aureus, S. capitis et de S. xylosus étaient les plus présentent. S. aureus était la seule espèce à coagulase positive identifié dans nos échantillons. Les souches de S. aureus étaient les plus formatrices de biofilm avec une proportion de 27,6% suivies des souches S. capitis et S. xylosus. L’épidermolysine B (ETB) était la plus produite (32,14 %) suivie de l’ETA (7,4 %), de Luk-S/F ou LPV (7,4%). Les souches ont montré une susceptibilité variable en fonction des 15 antibiotiques testés. Ainsi, la forte résistance a été observée avec la Pénicilline (100 %) indépendamment de la nature du prélèvement. Les souches de S. aureus étaient résistantes à la Céfoxitine à 71,4%. La Ciprofloxacine était l’antibiotique qui a eu fort effet inhibiteur sur les souches de staphylocoques.

Vu la place qu’occupent les produits laitiers dans l’alimentation et aux vus des taux élevés de contamination par les staphylocoques, il est donc nécessaire de former les vendeurs et vendeuses sur les bonnes pratiques d’hygiène des aliments lors de leur production et de leur distribution pour l’amélioration de la qualité des produits laitiers fermentés mis à la disposition des consommateurs.

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xii Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

Mots clés : Produits laitiers fermentés, staphylocoques, Toxines, Antibiotiques, Bénin.

ABSTRACT

Dairy products are very nutritious foods for humans, but the practices necessary for their preparation, packaging and storage sometimes favor microbial contamination. The objective of this work was to assess the toxinogenic and antibiotic susceptibility profiles of strains of Staphylococcus spp isolated from three types of fermented dairy products in the cities of Cotonou and Abomey-Calavi.

180 samples of yogurt, Couscous dèguè and Mil dèguè were taken for microbiological analyzes from fifteen sellers, two samples per day (morning and evening / afternoon) from each of them twice per week. This study consisted of counting total coliforms and Staphylococci. The identification of Staphylococcus spp strains were made by the ApiStaph gallery. Staphylocoagulase and DNase tests were carried out on the strains of Staphylococcus spp strains isolated. We also researched toxins: LukE/D, LukS/F and LPV using the OUCHTERLONY method, and researched biofilms. The susceptibility at 15 antibiotics tested was achieved by Kirby Bauer's method.

It emerges from this methodology that the samples were 42.77% contaminated with of Staphylococcus spp strains. The yoghourt and degue millet samples taken in the evening were more contaminated than those taken the morning were. The strains of S. aureus, S. capitis and S. xylosus were the most present. S. aureus was the only coagulase positive species identified in our samples. The S. aureus strains were the most biofilm-forming with a proportion of 27.6% followed by the S. capitis and S. xylosus strains. Epidermolysin B (ETB) was the most produced (32.14%) followed by ETA (7.4%), Luk-S/F or LPV (7.4%) The strains showed variable susceptibility depending on the 15 antibiotics tested. Thus, the high resistance was observed with Penicillin (100%) regardless of the nature of the sample. The strains of S.

aureus were 71.4% resistant to Cefoxitin. Ciprofloxacin was the antibiotic that had a strong inhibitory effect on Staphylococcus strains.

Given the place occupied by dairy products in the diet and in view of the high rates of contamination by Staphylococci, it is therefore necessary to train salespeople on good hygiene practices for food during their production and their distribution to improve the quality of fermented milk products made available to consumers.

Keywords: Fermented milk products, Staphylococcus spp strains, Toxins, Antibiotics, Benin.

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Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

INTRODUCTION

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1 Réalisé par Mme. AZA-GNANDJI Akoua Tania Laurelle

1. Introduction

Selon le congrès de Genève de 1910, le lait est le produit intégral de la traite totale et ininterrompue d’une femelle laitière bien portante, bien nourrie et non surmenée (FAO, 2012).

Au Bénin, la production laitière est de 112302 tonnes (FAOSTAT, 2017) contre un taux d’importation de 8247351,16 Kg en 2017, le lait et les produits laitiers constituent des denrées alimentaires d’origine animale de très grande valeur nutritive en raison de leur richesse en protéines, en calcium et en vitamines (Abate et al., 2015). La transformation du lait, qu’elle soit sur le lait naturel ou sur de la poudre de lait importé, requiert le respect d’une hygiène stricte tout au long de la chaine de production et de distribution. Selon (Namegni, 2006), le lait est un produit particulièrement nutritif et favorable au développement de microorganismes pouvant entrainer des toxi-infections alimentaires et des infections. Aussi, est-il un produit très périssable ce qui requiert des techniques de conservation telle que la transformation par la fermentation. L’un des produits issus des différentes transformations du lait est le yaourt (Namegni, 2006). D’après le Codex Alimentarius, le yaourt est un produit laitier coagulé obtenu par fermentation lactique grâce à l’action de Lactobacillus delbrueckii sous-espèce bulgaricus (L. bulgaricus) et de Streptococcus salivarius, sous-espèce thermophilus (S.

thermophilus) à partir du lait frais ainsi que du lait pasteurisé (ou concentré, partiellement écrémé, enrichi en extrait sec) avec ou sans addition de substances (lait en poudre, poudre de lait écrémé, les protéines lactosériques concentrées ou non, la caséine alimentaire etc.) (Tchekessi et al., 2014). Le mélange du lait avec du mil ou du lait avec du couscous après la fermentation du lait aboutit à des aliments de meilleure qualité nutritionnelle et fonctionnelle.

Ce mélange permet d’obtenir le Dèguè.

Le dèguè est un dessert préparé et vendu, tous les jours, à l’état frais aux abords des voies, dans les restaurants, dans les milieux scolaires par des petites unités de transformation (Hama et al., 2009). Ces produits sont fortement appréciés par les élèves qui en consomment énormément. Mais les conditions peu hygiéniques de préparation de ces aliments font courir des risques aboutissant parfois à leur contamination microbienne (Baba Moussa et al., 2006).

En effet, les matériels de préparation, l’environnement de production, les matières premières, l’hygiène individuelle et la salubrité de l’habitation sont autant de facteurs de risques de contamination des produits qui peuvent influer négativement sur la qualité microbiologique des boissons vendues en milieu scolaire. La conséquence est l’intoxication alimentaire fréquente, avec des effets parfois difficilement gérables (Banque mondiale, 1993). Dans les pays en voie de développement, les infections alimentaires demeurent un gros problème de

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santé publique puisqu’elles peuvent atteindre une population très importante (Malvy et Djossou, 2009). Il s’agit dans ce cas d’une toxi-infection alimentaire collective (TIAC). Les microorganismes pouvant causer des intoxications alimentaires sont les virus et les bactéries.

On peut retenir entre autres, Clostridium botulinum; Clostridium perfringens; Campylobacter;

Escherichia coli; Salmonella et les staphylocoques (Staphylococcus aureus notamment) (Bezzar, 2014; Garas et al., 2017). Staphylococcus aureus est un agent pathogène majeur dans les denrées en raison de la capacité alimentaire de certaines souches de produire des entérotoxines staphylococciques thermorésistantes qui une fois ingérées peuvent entrainer des troubles gastro-intestinaux tels que vomissements, nausées et crampes abdominales (Gabriella Nogueira Viçosa et al., 2018). Plus de 90% des toxi-infections d’origine alimentaire dont le déterminisme est connu sont dues à des bactéries. Parmi celles-ci, S. aureus représente 75%

des cas rapportés (China, 2002). Au Bénin la majorité des intoxications alimentaires d’origine microbienne sont liées principalement aux staphylocoques, Escherichia Coli, Salmonella spp (Baba moussa et al., 2006 ;Ahoyo et al.,2010 ). Ainsi, pour le traitement des infections d’origine bactérienne, l’emploi abusif et souvent incontrôlé des antibiotiques par l’automédication a fait apparaître un phénomène de résistance chez la plupart des bactéries.

Cette résistance rend difficile voire complexe le traitement des infections bactériennes par l’emploi des antibiotiques conventionnels (Adejuwon et al., 2011). En effet, de nombreux cas de bactéries multi-résistantes sont rapportés au Bénin (Sina et al., 2011), en Côte d’Ivoire (Benbachir et al., 2001; Akoua Koffi et al., 2004) et d’autres pays de l’Afrique subsaharienne (Akinyemi et al., 2005). De même, l’ensemble des antibiotiques connus à ce jour sont confrontés au phénomène de résistance de souches bactériennes (Atefeibu, 2002). Les toxiinfections alimentaires sont très fréquentes et sont en rapport avec la consommation de nombreux aliments dont les boissons vendues en restauration collective et contaminés par certaines bactéries ou leurs toxines (OMS, 2015). Elles sont de plus en plus rencontrées au Bénin où la restauration collective qui est devenue un phénomène des sociétés modernes de par son importance nutritionnelle et socioéconomique, a considérablement augmenté au cours des dernières années (Ahoyo et al., 2010). Au regard des études menées sur la contamination et les risques sanitaires liées à S. aureus, de l’émergence des souches de S. aureus résistantes à la Méthicilline (SARM) et sur la variabilité des toxines produites par les souches de S.

aureus issues des produits alimentaires fabriqués et vendus au Bénin ( Baba-Moussa et al., 2006 ; Ahoyo et al.,2010 ; Sina Orou et al.,2011 ; Mousse et al., 2016) il s’avère nécessaire que des recherches soient menées afin de prévenir les risques sanitaires liés à la

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consommation des produits laitiers fermentés vendus dans les établissements secondaires de Cotonou et d’Abomey-Calavi.

C’est dans cette optique que nous avions initié cette étude dont l’objectif général était de rechercher les profils toxinogénique et de susceptibilité aux antibiotiques des souches de staphylocoques isolées de trois types de produits laitiers fermentés (yaourt, dèguè-Couscous, dèguè-mil) artisanaux vendus dans les établissements scolaires de Cotonou et Abomey-Calavi pour assurer la sécurité sanitaire des consommateurs. Pour atteindre cet objectif, il a été spécifiquement question de :

 Identifier des souches de Staphylococcus spp des produits laitiers fermentés vendus dans des établissements secondaires de Cotonou et Abomey-Calavi ;

 Rechercher la production de biofilms et les toxines (LPV, LukE/D, ETA et ETB) produites par les souches de staphylocoques isolées ;

 Etablir le profil de résistance aux antibiotiques des souches de staphylocoques isolées.

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SYNTHESE

BIBLIOGRAPHIQUE

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2. Synthèse bibliographique 2.1.Les produits laitiers 2.1.1. Définition

Les produits laitiers sont par définition des aliments transformés ou obtenus simplement à partir du lait. Parmi les laits utilisés, le principal est de loin le lait de vache mais aussi on utilise également le lait de chèvre etc (Cayot et Lorient., 1998). Ils sont essentiellement utilisés dans l’alimentation humaine, soit directement soit comme ingrédients dans la pâtisserie, la biscuiterie, la charcuterie en fromagerie, mais aussi dans l’alimentation humaine (lait en poudre pour les veaux, lactosérum pour les porcs). Les produits laitiers sont en général, des denrées périssables. Ainsi, la chaine de froid doit être respectée du producteur au consommateur de manière que ces produits restent comestibles (Cayot et Lorient., 1998).

2.1.2. Quelques produits fermentés artisanaux dérivés du lait 2.1.2.1. Yaourt

Le yaourt se classe dans la catégorie des laits fermentés obtenus par action de bactéries lactiques thermophiles. Il est obtenu, selon la Fédération Internationale Laitière (FIL), par le développement des seules bactéries lactiques Lactobacillus delbrueckii sous espèce bulgaricus et Streptococcus thermophilus. En fonction de la technologie de fabrication, les yaourts sont divisés en deux groupes : les Yaourts fermes dont la fermentation a lieu en pots, sont généralement des yaourts nature ou aromatisés et les Yaourt brassés dont la fermentation a lieu en cuves avant le conditionnement, sont généralement des yaourts brassés nature ou aux fruits (Lannabi, 2015).

2.1.2.2.Dèguè

Le « Dèguè » est une boisson lactée fermentée à base de lait et de farine de céréales. Le dèguè était fabriqué à partir de lait et de farine de mil, mais de nos jours d’autres céréales sont également utilisées. Il existe quatre types de « Dèguè » à base de farines de maïs, de sorgho, de mil et de blé, appelés respectivement : maïs « Dèguè », sorgho « Dèguè » et mil « Dèguè » (Tchekessi et al., 2014) sans oublier le « Dèguè » Couscous. Cet aliment lacté à base de mil est très répandu au Burkina Faso, au Bénin, au Mali, en Côte d’Ivoire et au Sénégal où il est appelé Tiakry.

Il est fortement consommé par toutes les couches de la population et est reconnu par ses propriétés probiotiques (Tankoano et al., 2017). Notons que le « Dèguè », bien qu’étant un aliment fermenté, la fermentation au cours de la production, se déroule uniquement sur le lait auquel sont ajoutés les grumeaux de farine de mil ou de couscous précuits. Généralement, le

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lait de vache fermenté ou de la poudre de lait reconstitué et fermenté est utilisé pour obtenir le produit lacté. Au Bénin, le dèguè est préparé et vendu, tous les jours dans : les marchés, les écoles, les universités et boutiques (Hama et al., 2009 ; Tankoano et al., 2017).

2.1.3. Contamination microbienne des produits laitiers

La contamination microbienne diffère des contaminations chimiques et physique qui est souvent perçu par les consommateurs comme un risque minimal, pourtant elle est la cause de nombreux problèmes de santé publique (Gagara, 2010). Les intoxications d’origine alimentaire font partie des maladies qui affectent le plus grand nombre d’individus et causent le plus de décès (Gagara, 2010). Le lait se contamine par des germes exogènes provenant des fèces et téguments de l’animal (entérobactéries pathogènes, Clostridium, Salmonella), du sol (Streptomyces, Listeria, bactéries sporulées, spores fongiques) de la litière et aliments (Clostridium butyriques) de l’air et l’eau, des équipements de la traite et de stockage (levure, flores diverses, bactéries sporulées), des manipulateurs (germes de contamination fécale et les staphylocoques) et de divers vecteurs (flore de contamination fécale). Si l’animal est malade, le lait peut contenir des germes d’infection générale: Salmonella, Brucella, et exceptionnellement Listéria monocytogènes, de mycobactéries, de Bacillus anthracis et quelques virus (Guiraud, 2003).

2.2.Les toxi-infections alimentaires

Une toxi-infection alimentaire collective (TIAC) est définie par l’incidence de deux cas ou plus, maladie similaire, à symptomatologie gastro-intestinale le plus souvent, dont la cause peut être rapportée à un même produit alimentaire (Mouloudi, 2013).

Si la charge des maladies d’origine alimentaire constitue un problème de santé publique à l’échelle mondiale, les Régions OMS de l’Afrique et de l’Asie du Sud-Est ont les incidences et les taux de mortalité les plus élevés. Selon les estimations, c’est la Région africaine qui est confrontée à la plus forte charge de maladies d’origine alimentaire. On estime chaque année à plus de 91 millions le nombre de cas et à 137 000 celui des décès (OMS, 2015). Les activités pathogéniques des agents responsables des TIAC sont diverses. Nous distinguons essentiellement quatre principaux mécanismes à savoir :

2.2.1. Les intoxications

Les espèces microbiennes (Tableau 1) agissent par la transformation du substrat qu’elles rendent toxiques et produisent des intoxications.

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Tableau 1: Récapitulatif de quelques principaux germes pathogènes à l’origine de toxi- infections alimentaires, leur durée d’incubation, leurs symptômes et les denrées alimentaires contenant les produits laitiers (Sossa-Minou, 2018).

Microorganismes ou toxines

Durée

d’incubation Symptômes Produits à risque

Salmonella 6-48 heures à

72heures

Diarrhée, fièvre élevée, frissons,

céphalée, Crampes

abdominales, vomissements.

Les symptômes durent 2 à 3 jours, parfois plus long- temps

Volailles, préparations à base d’œufs crus, Viande porcine produits laitiers, chocolats

Campylobacter jejuni et

coli 1 à 5jours

Crampes à l’estomac, diarrhée abondante et Aqueuse (parfois sanglante) douleurs musculaires, céphalée, fièvre, nausées.

Durée : 7 à 10 jours

Volaille, viande porcine, lait cru

Listéria monocytogènes 3 à 70 jours

Etat grippal (Fièvre et céphalée), diarrhée, septicémie, méningite, avortement

Fromage à base de lait cru, saumon cru et fumé

Charcuterie fine : pâté, jambon, crème glacée

E. coli vérotoxinogène

(VTEC ou STEC) 3 à 9 jours

Symptômes se prolongeant au- delà d’une semaine HC- Colite hémorragique : diarrhée d’abord aqueuse, ensuite sanglante SHU : Syndrome hémolytique et urémique, diarrhée sanglante, insuffisance rénale, décès

Hachis de bœuf, lait cru, Fromage à base de lait cru, légumes crus

Yersinia enterocolitica 3-7jours

Syndrome de

Gastroentérocolite, Diarrhée aqueuse aiguë, Fièvre, céphalée, pseudoappendicite,

Inflammations Articulaires

Viande de porc, hachis de porc, lait, eau

Toxine de S. aureus 2-4 heures

Nausées, violents

vomissements, chute de tension, absence de fièvre, douleurs abdominales, diarrhée

Lait, fromage, crème glacée, viande, volaille, charcuterie fine, poisson, plats préparés, pâtisseries (denrées alimentaires manipulées par des personnes)

Toxine diarrhéique de

Bacillus cereus 8-16 heures Diarrhée et crampes Abdominales

Produits laitiers, lait en poudre, viande en daube, Herbes aromatiques et aliments fortement épicés (aliments riches en protéines)

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2.2.2. Les Infections

Ce sont des intoxications alimentaires causées par la consommation d’aliments contaminés par l’agent infectieux qui agit par envahissement de l’hôte. Elles résultent de l’envahissement de la muqueuse intestinale de l’hôte par les microorganismes (Sossa-Minou, 2018).

2.2.3. Les intoxinations

Ce sont des accidents causés par la consommation d’aliments contenant une toxine microbienne préformée comme résultat de la croissance de l’agent pathogène. Les symptômes de la maladie sont dus uniquement à l’action de la toxine et sont sans lien avec leurs bactéries productrices qui sont généralement absentes dans ces cas (Bousseboua, 2005).

2.3. Généralités sur les staphylocoques 2.3.1. Définition et historique

Le nom « Staphylocoque » vient du Latin « staphylos » qui signifie grappe de raisin car les cocci sont groupées en amas irréguliers sous forme d’une grappe de raisin. Ensuite en 1884, Rodenbach a obtenu des cultures pures de ces bactéries. En fonction de la couleur des colonies, il a appelé les germes des colonies orange Staphylococcus pyogènes aureus (Ferron, 1994).

2.3.2. Taxonomie et classification

S. aureus fait partie de l’ordre des cocci Gram positif, de la famille des Micrococaceae qui est composée de 5 genres : Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus (rencontré en bactériologie marine), Stomatococcus, et Leuconostoc (Djedji, 2002). Aujourd’hui, 37 espèces et 17 sous-espèces peuvent être identifiées au sein du genre Staphylococcus (Bannerman et al., 2007). Le critère de base de leur classification est la production de coagulase, qui est une protéine extracellulaire (Lamprell et al., 2003). Ainsi, il existe plusieurs espèces de staphylocoques: les staphylocoques à coagulase négative (S. simulans, S. cohnii, S.

xylosus, S. epidermidis etc) et les staphylocoques à coagulase positive (S. aureus, S. delphini, S. intermedius, S. hyicus etc.) (Fomba, 2006; Pyorala et al., 2008).

2.3.3. Ecologie des staphylocoques

Le réservoir essentiel des staphylocoques est l’homme lui-même et les animaux à sang chaud (Ferron, 1994). Mais, il se retrouve aussi dans les aliments et sont à l’origine d’intoxications alimentaires. Les germes du genre Staphylococcus sont ubiquitaires car ils sont très répandus dans la nature (air, eau, sol, aliments, mobilier et matériels) (Ferron, 1994). Ces souches sont

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à l’origine d’auto-infection ou de contamination d’autres individus (Avril et al., 1988). Ainsi la transmission des souches peut être directe: intra ou interhumaine (manu portage) et indirecte à partir de source environnementale ou hospitalière.

2.3.4. Caractères morphologiques

Le Staphylocoque est une bactérie asporulée, non mobile d’environ 0,5µm à 1,5µm de diamètre disposé en amas, diplocoques, en courtes chainettes voir même en grappes typiques.

C'est une bactérie aéro-anaérobie facultative et chimio-organotrophe qui a un métabolisme respiratoire et fermentatif (Kloos et al., 1986). Elle se développe rapidement à 37°C et à un pH de 7,5 sur les milieux usuels. La plupart des souches de staphylocoques en particulier S. aureus ont la capacité de fermenter le mannitol contenu dans le milieu Chapman. Cette fermentation se traduit par le virement du milieu Chapman au jaune. Ce sont des cocci généralement acapsulées ou ayant une faible capacité de synthèse de capsule (Novick, 1990).

2.3.5. Substances secrétées

Les staphylocoques sont naturellement dotés de quelques capacités à secréter certaines substances (les enzymes et les toxines) qui permettent de la différencier des autres espèces.

De plus, au fur et à mesure que S. aureus devient pathogène, elle acquiert d’autres capacités de sécrétion de nombreuses toxines. Ces toxines sont secrétées en fonction de la pathologie créée par les staphylocoques (Avril et al., 1988).

2.3.5.1. Les enzymes

Les staphylocoques produisent des enzymes qui ont des intérêts pathogéniques et/ou diagnostics importants. Nous pouvons citer :

 La coagulase libre : S. aureus et d’autres souches sont capables de produire une substance provoquant la coagulation du plasma humain et de lapin. La coagulase libre est synthétisée pendant la phase de croissance du germe. La formation du coagulum nécessite la présence d’une globine (coagulase – reacting - factor) voisine de la prothrombine (Avril et al., 1988);

 La coagulase liée : à la surface des germes agit directement sur le fibrinogène, c’est le

« clumping factor » qui est responsable de l’agglutination sur une lame (Carbonelle et al., 1987) ;

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 La fibrinolyse ou la staphylokinase : cette enzyme est mise en évidence sur la gélose contenant de la fibrine et se traduit par une zone claire. Elle est thermolabile et antigénique (Avril et al., 1988);

 L’hyaluronidase : cette enzyme est thermolabile et hydrolyse l’acide hyaluronique.

Elle peut être recherchée par viscométrie ;

 La nucléase (D Nase) ou thermonucléase: elle est thermostable et est mise en évidence sur un milieu à base d’ADN avec du bleu de toluidine (halo rose) ou de l’acide chlorhydrique normal ;

 Il y a aussi d’autres activités telles que la lipasique, l’estérasique, la protéasique et la phosphatasique qui peuvent être mises en évidence sur le milieu à l’oeuf de Baird Parker (Avril et al., 1988).

2.3.5.2. Facteurs de virulence : toxines

La pathogénicité des staphylocoques est liée à l’expression de facteurs de virulence. S. aureus a la capacité de produire plusieurs toxines ayant pour cible les membranes cellulaires. Ces toxines se fixent à des cellules cibles et provoquent la formation de canaux membranaires laissant passer les ions (pore-formingtoxins). Ces toxines sont composées de deux protéines agissant en synergie pour créer des pores dans les membranes cellulaires de différentes cellules eucaryotes (Prévost, 2004; Schmidt et al., 2004). Les différentes toxines sécrétées par S. aureus et les plus souvent rencontrées sont les hémolysines, les leucotoxines, les entérotoxines, les toxines épidermolytiques ou exfoliatines, et la toxine du syndrome de choc toxique (TSST-1).

2.3.5.2.1. Entérotoxines

Les entérostomies staphylococciques (SEs) sont des protéines solubles, à chaînes linéaires de faibles masses moléculaires (27000 à 30000 Da) (Duquenne, 2010). Ces toxines sont des métabolites de la croissance de certaines souches de staphylocoques à coagulase positive, en particulier S. aureus, et de certaines espèces de staphylocoques à coagulase négative (Palmer, 1998). Les entérotoxines produites par S. aureus possèdent des similarités de conformation dans leurs séquences de nucléotides et d'acides aminés (Papageorgiou et al., 2000 ; Orwin et al., 2001). Les SEs sont résistantes aux protéases gastro-intestinales, telles que la pepsine, aussi bien qu’à la chaleur (Balaban et Rasooly, 2000). La stabilité thermique de ces toxines semble être dépendante du pH, de la concentration en NaCl, des protéines, etc, du milieu dans lequel elles se trouvent (Balaban et Rasooly, 2000). Elles ont toutes des activités biologiques similaires (Su et Wong, 1997).

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2.3.5.2.2. Les épidermolysines

Elles sont produites par environ 5% de S. aureus. Chez l’homme, trois types antigéniques sont actuellement décrits (ETA, ETB et ETD). L’exfoliatine D a été décrite récemment à partir d’une souche isolée dans une plaie cutanée et pas dans un cadre d’exfoliation généralisée ni d’impétigo bulleux (Avril et al, 1988). De plus, elle semble largement être représentée au sein des souches de S. aureus. Son rôle pathologique reste donc à confirmer par de nouvelles études (Avril et al., 1988).

2.3.5.2.3. Leucotoxines

La figure 1 montre la distribution des composants exprimant les leucotoxines. Le thème « leucotoxine » rassemble l’α-toxine et les toxines à deux composés formant des pores produites par S. aureus, à savoir la leucocidine de Panton et Valentine, les gamma- hémolysines, LukM-PV+LukF-PV, LukE+LukD, et LukS-I+LukF-I produites par Staphylococcus intermedius. Ce nom leur a été donné, car leurs cibles cellulaires majeures sont les polynucléaires neutrophiles, les monocytes et les macrophages ou les lymphocytes (Prévost, 2005).

Figure 1 : Schéma des différentes combinaisons des gènes chromosomiques codants et leur fréquence (Baba-Moussa et al., 2006).

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 La Leucocidine de Panton et Valentine (LPV) est la première leucotoxine à être purifiée et caractérisée. Elle est formée de deux composés S et F : LukF-PV et Luk S- PV (Prévost et al., 1995). Elle a pour cible les polynucléaires, les monocytes et les macrophages (Prévost et al., 2005). La LPV a une action leucotoxique et dermonécrotique, mais n’est pas hémolytique. L’effet toxique sur les leucocytes serait dû à une modification cationique. La LPV à deux constituants F et S agissant en synergie. Ces protéines différentes, de classe S (31 kDa) et de classe F (34 kDa) sont nécessaires pour former un pore actif. Cette dénomination vient de leur comportement en chromatographie échangeuse de cations : les protéines de classe F sont « fasteluted » et les protéines de classe S sont « Slow eluted » (Woodin, 1960). Les souches productrices de la LPV sont classiquement associées à des infections cutanées primitives, notamment les furoncles (Couppié et al., 1994 ; Durupt et al., 2007).

 La Gamma-hémolysine rassemble deux toxines distinctes : HlgA-HlgB et HlgC- HlgB (Kamio et al., 1993; Prévost et al., 1995). Les deux composés de classe S sont HlgA et HlgC et le composé de classe F est HlgB. HlgA-HlgB a un large spectre d’activité alors que HlgC-HlgB ne lyse pas les lymphocytes T et est moins actif sur les érythrocytes humains (Gauduchon et al., 2001).

 La LukE-LukD est isolée chez plus de 75 % des souches de S. aureus responsable d’impétigo bulleux, elles-mêmes productrices d’épidermolysines A ou B (Gravet et al., 2001). Elle est aussi isolée de 93,6 % des souches de S. aureus associées à une diarrhée post-antibiothérapie; elles-mêmes productrices d’entérotoxine (>80 % pour l’entérotoxine A) (Gravet et al., 2001).

2.3.5.3.Mode d’action des leucotoxines à deux composés

L’activation synergique des deux composés individualisés conduit à la formation d’un pore actif. Ainsi, le composé de classe S se fixe en premier à la membrane de la cellule cible, permettant la fixation du composé de classe F (Figure 2). Il y a ensuite oligomérisation puis la formation du poreoctamérique (Prévost et al., 2004 ; Joubert et al., 2006). Il en résulte une lyse cellulaire due à la libération des ions. La figure 3 montre la disposition des composants Luk-S et Luk-F pour la formation de pores et leur mode d’action sur la membrane cellulaire.

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Figure 2: Mode d’action des leucotoxines à deux composés (Vincenota et al., 2008).

2.3.6. Les biofilms

La découverte du biofilm remonte au début des années 40 depuis les travaux de Henrici 1933 et Zobell 1943. Le terme « biofilm » a été utilisé pour la première fois par Zobell en 1943. Les biofilms sont un ensemble de micro colonies, entourées d’une matrice hautement hydratée, anionique et constituée d’exopolysaccharides (EPS). Christensen et al. (1982) ont été les premiers à observer la formation d’un biofilm chez une souche de S. epidermidis isolée d’un cathéter. Ils ont noté la formation d’un film gluant, filamenteux sur des tubes de cultures, puis ils ont visualisé cette substance extracellulaire par une coloration au bleu alcian en microscopie électronique à balayage. Ces auteurs ont noté que la plupart des souches avaient une production variable de cette substance qui dépendait du milieu et de la supplémentassions en glucose. Ils ont suggéré que la formation de biofilm était un facteur critique dans la pathogénèse de S. epidermidis. Ces faits ont été confirmés la même année par Peters et al.

(1982) qui ont montré une corrélation entre la capacité de colonisation du matériel médical par S. epidermidis et les infections nosocomiales (Planchon, 2006). Le biofilm est une communauté structurée de micro-organismes, se fixant à une surface inerte ou vivante et réunis au sein d’une matrice d’exo-polysaccharides (Jain et al., 2011) adhésive et protectrice qu’ils secrètent. C’est une structure très organisée avec de nombreuses communications

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intercellulaires pour assurer un équilibre et un mode de vie coopératif (Boutaleb, 2007 ; Salaun, 2009). Un biofilm peut être constitué d’une ou plusieurs espèces de microorganismes (Behlau et Gilmore, 2008). Dans l'industrie alimentaire, il est important de connaître les conditions dans lesquelles S. aureus est capable de survivre, adhérer aux surfaces et former des biofilms (FutagawaSaito et al., 2006), conduisant à la contamination des produits alimentaires surface (Fratamico et al., 2009).

2.3.7. Familles d’antibiotiques et leur mode d’action

Un antibiotique est une substance antibactérienne d'origine biologique, c'est-à-dire produite par des microorganismes (champignons microscopiques et bactéries) ou de synthèse chimique et qui est capable d'inhiber la multiplication ou de détruire d'autres microorganismes (Yala et al., 2001).

2.3.7.1. Classification des antibiotiques et modes d’actions

La classification repose sur leur structure chimique et leur mécanisme d'action, lesquels conditionnent leur spectre d'activité car ils agissent spécifiquement sur une étape essentielle du métabolisme des bactéries se manifestant à très faible dose par l’inhibition de certains processus vitaux (Yala et al., 2001).

2.3.7.1.1. Antibiotiques agissant sur la membrane

Certains antibiotiques se fixent sur les membranes bactériennes en particulier la membrane externe des bactéries et les désorganisent en se combinant avec notamment les phospholipides qui les constituent. Il peut s'agir de la membrane externe de la paroi des bactéries à Gram négatif (-) ou de la membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif (+). Parmi ces antibiotiques, nous retrouvons les Polymycines (Colistine) et les Nitrofuranes (nifurzide, nifuroxazide) (Yala et al., 2001).

2.3.7.1.2. Antibiotiques agissant sur la synthèse du peptidoglycane

Le peptidoglycane est un polymère réticulé fait de chaînes polysaccharidiques reliées par des peptides (Nauciel & Vildé, 2005). Lorsque les bactéries sont en phase de croissance, il existe simultanément des phénomènes de synthèse et de destruction du peptidoglycane. L’équilibre entre ces deux phénomènes est rompu par les antibiotiques inhibant la synthèse du peptidoglycane en bloquant la phase finale de la polymérisation. Il en résulte une altération de la paroi ayant un effet létal pour la bactérie. C’est le cas chez les ß-lactamines qui agissent au niveau de la paroi bactérienne en inhibant la dernière étape de la synthèse du peptidoglycane entrainant une lyse bactérienne (Yala et al., 2001).

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2.3.7.1.3. Antibiotiques inhibant la synthèse protéique

Plusieurs familles d’antibiotiques peuvent inhiber, par différents mécanismes, l’élongation de la chaîne polypeptidique chez les bactéries.

 Les Macrolides (Erythromycine, Azithromycine), les Lincosamides (lincomycine, clindamycine), les Streptogramines et les Oxazolidones qui se fixent sur la sous-unité 50S du ribosome ; et enfin les antibiotiques inhibant le facteur d’élongation EF-2 comme l’Acide fusidique (Jehl et al., 2003).

 Les Phénicoles (Chloramphénicol et Thiamphenicol) : Les deux molécules sont bactériostatiques. Elles agissent au niveau de la sous unité 50 S du ribosome. Ceci a pour conséquence une inhibition de la synthèse des protéines.

 Les Tétracyclines : Ils se lient aussi aux protéines de la sous unité 30S mais peuvent aussi se lier en faible proportion aux protéines de la sous unité 50S.

 Les Aminosides : la Sisomycine, la Streptomycine, la Gentamicine, la Kanamycine, la Netilmicine, l’Amykacine et la Tobramycine sont des antibiotiques puissants. Selon Yala et al. (2001), Ils perturbent la synthèse des protéines au niveau de la fraction 30S du ribosome entraînant la destruction bactérienne.

 Acide Fusidique : c’est un antibiotique stéroidien. Il agit sur la synthèse des protéines.

C'est un antibiotique antistaphylococcique majeur. Il est actif sur les staphylocoques Méti S. et Méti R.

2.3.7.1.4. Antibiotiques agissant sur les acides nucléiques

Ce groupe comprend les Sulfamides et le Triméthoprime utilisés souvent en association (cotrimoxazole) inhibant la synthèse des folates et en plus il interagit avec la dihydrofolate réductase pour inhiber la synthèse de l’acide tétrahydrofolique. Les quinolones interfèrent avec l’état topologique de l’ADN bactérien en inhibant les topoisomérases ou ADN-gyrase, enzyme intervenant dans la conformation de l’ADN (acide nalidixique, ofloxacine, ciprofloxacine, péfloxacine). A l'image de l'acide nalidixique, ils inhibent la synthèse de l'ADN par blocage de l'activité de la sous unité alpha de l'ADN gyrase.

 Les rifamycines sont constituées d'un grand cycle et d'un cycle aromatique. On distingue trois antibiotiques : La Rifamycine SV (Rifocine®), la Rifamide et, la Rifampicine. Ils inhibent l’ARN polymérase arrêtant la synthèse des ARN messagers au stade d’initiation (Yala et al., 2001).

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 Ils font partir d'une famille complexe agissant aussi bien sur les bactéries que sur les parasites. On distingue le Tinidazole et le Métronidazole. Ils agissent en inhibant la synthèse des acides nucléiques entraînant la mort rapide de la bactérie.

 La novobiocine est un dérivé de la coumarine comportant en outre dans sa formule un phénol substitué et un sucre le Noviose. Elle inhibe la réplication de l'ADN. La novobiocine est un antibiotique antistaphylococcique, actif sur les cocci à Gram négatif, les Hemophilus et les Pasteurelles (Yala et al., 2001).

2.3.7.2. Mécanisme de résistance aux antibiotiques

L’antibiorésistance est la capacité d’un microorganisme (comme des bactéries, des virus et certains parasites) d'empêcher un antimicrobien (tel que des antibiotiques, des antiviraux et des antipaludéens) d'agir contre lui. En conséquence, les traitements standards deviennent inefficaces, les infections persistent et peuvent se propager (OMS, 2017). Deux types de résistances peuvent être distingués : la résistance naturelle et la résistance acquise. La résistance naturelle a pour support génétique le chromosome bactérien et elle permet de définir le spectre d’activité des antibiotiques. Elle est stable, transmise à la descendance et constitue un caractère qui est commun à tous les individus d’une même espèce bactérienne (phénotype sauvage). Ce type de résistance résulte de modifications du génome bactérien. La résistance des bactéries peut être acquise par une mutation et transmise verticalement par sélection aux cellules filles. Plus généralement, la résistance est acquise par transfert horizontal de gènes de résistance entre espèces. L’échange de gènes est possible par transformation, transduction ou conjugaison (Kumar et Varela, 2013 ; Dowling et al., 2017).

Les principaux mécanismes de résistance bactérienne aux agents antimicrobiens sont notamment les suivants :

- l'inactivation enzymatique du médicament ; - la modification de la cible du médicament ; - la réduction de la perméabilité aux médicaments ;

- l’efflux actif des médicaments (MacGowan et Macnaughton, 2017).

Les mécanismes de résistance permettent aux bactéries qui hébergent ces mécanismes de survivre, voire de se développer activement, en présence d'un agent antimicrobien donné.

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CADRE, MATERIEL et METHODES

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3. Cadre, Matériel et Méthodes 3.1. Cadre d’étude

Cette étude s’est faite au Laboratoire de Biologie et de Typage Moléculaire en Microbiologie (LBTMM) qui est un laboratoire de recherche scientifique du département de Biochimie et de Biologie Cellulaire de la Faculté des Sciences et Techniques (FAST) de l’Université d’Abomey-Calavi (UAC). Les échantillons de produits laitiers ont été collectés dans les établissements scolaires secondaires de Cotonou et d’Abomey-Calavi.

3.2. Méthodologie

Les échantillons prélevés sont des produits laitiers fermentés à savoir : yaourt, dèguè mil, dèguè couscous pris dans les établissements scolaires secondaires de Cotonou et d’Abomey- Calavi. L’étude s’est déroulée en deux étapes : une phase d’échantillonnage et une phase d’analyse au laboratoire.

3.2.1. Phase d’échantillonnage

Un total de 180 échantillons a été collecté dont : 60 yaourts, 60 dèguè Mil et 60 dèguè couscous. Les vendeuses qui ont été considérées pendant cette étude sont des vendeuses fixes qui vendent les trois types de produits laitiers fermentés dans 15 différents établissements secondaires fréquentés par beaucoup d’élèves dans les villes de Cotonou et d’Abomey-Calavi.

Les échantillons ont été prélevés le matin et l’après-midi ou le soir deux fois par semaine avec un écart d’une journée. La première collecte s’est faite le matin au début de la vente pendant que les produits sont fraichement sortis du réfrigérateur pour la vente et la seconde dans l’après-midi ou le soir quand la vente est presque terminée. Ceci dans le but de déterminer le moment où a lieu les éventuelles contaminations. Les échantillons collectés sont mis dans des sachets Stomacher stériles déposés dans des glacières contenant des accumulateurs thermiques et acheminés directement au laboratoire pour les analyses.

3.2.2. Analyses microbiologiques des échantillons

Les méthodes d’analyse sont basées sur les recommandations de la norme ISO 7218, 1996.

Toutes les manipulations ont été faites sous une hotte à flux laminaire et en présence d’un bec Bunsen. Les échantillons prélevés dans la journée ont toujours été ensemencés dans un délai de vingt-quatre heures au plus. Les échantillons ont été conservés dans le réfrigérateur pour la préparation des dilutions et l’ensemencement des boîtes de Pétri.

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3.2.2.1. Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales

Pour la préparation de la suspension mère, 10 g de chaque échantillon ont été prélevé respectivement dans des erlenmeyers auquel on ajoute 90 ml de bouillon Tryptone Sel (TS).

L’ensemble est homogénéisé à l’aide du vortex La suspension mère ainsi obtenue, correspond à une dilution à 10 ^-1. Les différentes dilutions décimales sont réalisées à partir de la solution mère et conformément à la norme ISO 6887-2 (2004). Un volume de 1 ml de la suspension mère est prélevé et mis dans un tube contenant 9 ml de TS stérile (Figure 3). L’ensemble est homogénéisé à l’aide du vortex. La dilution ainsi obtenue est la dilution 10^-2. Un volume de 1 ml de la dilution 10 ^-2 est prélevé et mis dans un tube contenant 9 ml de TS stérile puis l’ensemble est homogénéisé au vortex.

Figure 3: Schéma illustrant la dilution décimale.

3.2.2.2. Dénombrement des coliformes totaux et fécaux

Les coliformes fécaux sont des bactéries produisant du gaz à partir du lactose à 44°C. Leur dénombrement s’est fait sur le milieu (Violet Red Bile Lactose Agar) (VRBL). Nous avions procédé par un ensemencement en double couche. Il a été prélevé 1 ml des dilutions 10^-1,10^-2 et 10^-3 à l’aide de cônes stériles dans différentes boites de Pétri. Ensuite, 15 ml du milieu VRBL ont été coulés et homogénéisés puis laisser solidifier. Une seconde couche d’environ 5 ml a été coulée. Après séchage, les boites ont été incubées à 30°C pendant 24 heures pour les coliformes totaux et à 44°C pendant 24 heures pour les coliformes fécaux.

3.2.2.3. Dénombrement des staphylocoques

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Elle a été faite sur la gélose Baird Parker enrichie au jaune d’oeuf et au Tellurite de potassium. De façon pratique, environ 15 ml de la gélose Baird Parker ont été coulé dans des boîtes de Pétri. Après séchage, 0,1 ml des dilutions 10^-1, 10^-2 et 10^-3 y ont été versés à l’aide de cônes stériles puis ensemencer à l’aide d’un étaleur sur la surface de la gélose. Après 48 heures d’incubation à 37°C, les colonies de staphylocoques sont noires, lisses ou bombées à contour régulier avec ou sans un halo (Figure 4).

Figure 4 : Aspect des colonies de staphylocoques sur du Baird Parker enrichie au jaune d’œuf et au tellurite de potassium.

3.2.2.4. Dénombrement des colonies

Après les périodes d’incubation mentionnées dans le mode opératoire spécifique à chaque germe, nous avons observé une croissance bactérienne et procédé au comptage des colonies.

Le dénombrement consiste donc à compter le nombre de colonies bactériennes observées à l’intérieur des boites de Pétri après incubation et le résultat s’exprime en Unité Formant Colonie (UFC). Seules les boîtes contenant 30 à 300 colonies sont considérés.

Le nombre de germe par gramme d’échantillon (N) a été déterminé par la formule suivante :

𝑁 = ^{Ʃ 𝐶𝑛}

(𝑛1×𝑣1)𝑑1+ (𝑛2×𝑣2)𝑑2+⋯+(𝑛𝑛×𝑣𝑛)𝑑𝑛

Cn: nombre de colonies comptées sur les boites retenues

n: nombre de boites retenues de la n-ième dilution vn: volume de l’inoculum de la n-ième dilution dn: valeur de la n-ième dilution

 Critères microbiologiques du lait caillé et du yaourt

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Les normes microbiologiques d’appréciation pour les yaourts.

Tableau 2: Normes utilisées pour la classification.

Principaux microorganismes Valeurs

Coliformes totaux à 30°C 10germes/g

Coliformes fécaux 1germe/g

Staphylococcus aureus Moins de 100germes/g

Source : Normes AFNOR citées par BEERENS et LUQUET, 1897 3.2.2.5. Isolement et identification des souches de staphylocoques

Le dénombrement des staphylococoques sur le milieu Baird Parker enrichi au jaune d’œuf et au tellurite de potassium a été suivi d’une culture des colonies caractéristiques sur le milieu Chapman (Cat 106200). Ce milieu a viré au jaune, après 24h d’incubation à 37°C. En cas de présence de souches staphylocoques, ces souches ont la capacité de fermenter le mannitol. Les tests suivants ont été effectués pour l’identification des souches de staphylocoques notamment la coloration de Gram, la staphylocoagulase, la DNase et la galerie API®STAPH.

3.2.2.5.1. Coloration de Gram

La coloration Gram est la méthode de coloration la plus utilisée en bactériologie; elle permet de colorer les bactéries et de les distinguer à l’examen direct par leur aptitude à fixer le violet de gentiane (Gram +) ou la fuchsine (Gram -). Elle a été réalisée comme décrit précédemment par Riegel et al., (2006). La souche présumée est d’abord fixée sur une lame (frottis). Elle a été ensuite recouverte de violet de gentiane. Après 1 minute, la lame a été rincée à l’eau de robinet pour éliminer l’excédent de colorant. Elle a été ensuite recouverte de la solution de lugol. Après 30 secondes, la lame a été rincée à l’eau de robinet pour éliminer l’excédent de lugol. Ensuite, quelques gouttes d’alcool ont été versées sur le frottis tenu verticalement pendant 30 secondes puis la lame a été rincée à l’eau de robinet. La lame a été recolorée par la solution de fuchsine et laissée pendant 20 secondes puis rincée. Enfin, la lame a été séchée puis observée au microscope optique à l’objectif x100 avec ajout de l’huile à immersion. Les bactéries Gram positif apparaissent en violet (Riegel et al., 2006).

3.2.2.5.2. Recherche de la staphylocoagulase libre

La confirmation de la présence de S. aureus repose sur une réaction fortement positive au test de la coagulase libre (en tube). A l’aide d’une anse stérile, une partie de chaque colonie suspectée a été mise en suspension dans un tube contenant 5 mL de bouillon coeur-cervelle