Contamination microbienne des produits laitiers

La contamination microbienne diffère des contaminations chimiques et physique qui est souvent perçu par les consommateurs comme un risque minimal, pourtant elle est la cause de nombreux problèmes de santé publique (Gagara, 2010). Les intoxications d’origine alimentaire font partie des maladies qui affectent le plus grand nombre d’individus et causent le plus de décès (Gagara, 2010). Le lait se contamine par des germes exogènes provenant des fèces et téguments de l’animal (entérobactéries pathogènes, Clostridium, Salmonella), du sol (Streptomyces, Listeria, bactéries sporulées, spores fongiques) de la litière et aliments (Clostridium butyriques) de l’air et l’eau, des équipements de la traite et de stockage (levure, flores diverses, bactéries sporulées), des manipulateurs (germes de contamination fécale et les staphylocoques) et de divers vecteurs (flore de contamination fécale). Si l’animal est malade, le lait peut contenir des germes d’infection générale: Salmonella, Brucella, et exceptionnellement Listéria monocytogènes, de mycobactéries, de Bacillus anthracis et quelques virus (Guiraud, 2003).

2.2.Les toxi-infections alimentaires

Une toxi-infection alimentaire collective (TIAC) est définie par l’incidence de deux cas ou plus, maladie similaire, à symptomatologie gastro-intestinale le plus souvent, dont la cause peut être rapportée à un même produit alimentaire (Mouloudi, 2013).

Si la charge des maladies d’origine alimentaire constitue un problème de santé publique à l’échelle mondiale, les Régions OMS de l’Afrique et de l’Asie du Sud-Est ont les incidences et les taux de mortalité les plus élevés. Selon les estimations, c’est la Région africaine qui est confrontée à la plus forte charge de maladies d’origine alimentaire. On estime chaque année à plus de 91 millions le nombre de cas et à 137 000 celui des décès (OMS, 2015). Les activités pathogéniques des agents responsables des TIAC sont diverses. Nous distinguons essentiellement quatre principaux mécanismes à savoir :

2.2.1. Les intoxications

Les espèces microbiennes (Tableau 1) agissent par la transformation du substrat qu’elles rendent toxiques et produisent des intoxications.

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Tableau 1: Récapitulatif de quelques principaux germes pathogènes à l’origine de toxi-infections alimentaires, leur durée d’incubation, leurs symptômes et les denrées alimentaires contenant les produits laitiers (Sossa-Minou, 2018).

Microorganismes ou toxines

Durée

d’incubation Symptômes Produits à risque

Salmonella 6-48 heures à

Volailles, préparations à base d’œufs crus, Viande porcine produits laitiers, chocolats

Campylobacter jejuni et

coli 1 à 5jours

Crampes à l’estomac, diarrhée abondante et Aqueuse (parfois sanglante) douleurs musculaires, céphalée, fièvre, nausées.

Durée : 7 à 10 jours

Volaille, viande porcine, lait cru

Listéria monocytogènes 3 à 70 jours

Etat grippal (Fièvre et céphalée), diarrhée, septicémie, méningite, avortement

Fromage à base de lait cru, saumon cru et fumé

Charcuterie fine : pâté, jambon, crème glacée

E. coli vérotoxinogène

(VTEC ou STEC) 3 à 9 jours

Symptômes se prolongeant au-delà d’une semaine HC- Colite hémorragique : diarrhée d’abord aqueuse, ensuite sanglante SHU : Syndrome hémolytique et urémique, diarrhée sanglante, insuffisance rénale, décès

Viande de porc, hachis de porc, lait, eau

Bacillus cereus 8-16 heures Diarrhée et crampes Abdominales

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2.2.2. Les Infections

Ce sont des intoxications alimentaires causées par la consommation d’aliments contaminés par l’agent infectieux qui agit par envahissement de l’hôte. Elles résultent de l’envahissement de la muqueuse intestinale de l’hôte par les microorganismes (Sossa-Minou, 2018).

2.2.3. Les intoxinations

Ce sont des accidents causés par la consommation d’aliments contenant une toxine microbienne préformée comme résultat de la croissance de l’agent pathogène. Les symptômes de la maladie sont dus uniquement à l’action de la toxine et sont sans lien avec leurs bactéries productrices qui sont généralement absentes dans ces cas (Bousseboua, 2005).

2.3. Généralités sur les staphylocoques 2.3.1. Définition et historique

Le nom « Staphylocoque » vient du Latin « staphylos » qui signifie grappe de raisin car les cocci sont groupées en amas irréguliers sous forme d’une grappe de raisin. Ensuite en 1884, Rodenbach a obtenu des cultures pures de ces bactéries. En fonction de la couleur des colonies, il a appelé les germes des colonies orange Staphylococcus pyogènes aureus (Ferron, 1994).

2.3.2. Taxonomie et classification

S. aureus fait partie de l’ordre des cocci Gram positif, de la famille des Micrococaceae qui est composée de 5 genres : Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus (rencontré en bactériologie marine), Stomatococcus, et Leuconostoc (Djedji, 2002). Aujourd’hui, 37 espèces et 17 sous-espèces peuvent être identifiées au sein du genre Staphylococcus (Bannerman et al., 2007). Le critère de base de leur classification est la production de coagulase, qui est une protéine extracellulaire (Lamprell et al., 2003). Ainsi, il existe plusieurs espèces de staphylocoques: les staphylocoques à coagulase négative (S. simulans, S. cohnii, S.

xylosus, S. epidermidis etc) et les staphylocoques à coagulase positive (S. aureus, S. delphini, S. intermedius, S. hyicus etc.) (Fomba, 2006; Pyorala et al., 2008).

2.3.3. Ecologie des staphylocoques

Le réservoir essentiel des staphylocoques est l’homme lui-même et les animaux à sang chaud (Ferron, 1994). Mais, il se retrouve aussi dans les aliments et sont à l’origine d’intoxications alimentaires. Les germes du genre Staphylococcus sont ubiquitaires car ils sont très répandus dans la nature (air, eau, sol, aliments, mobilier et matériels) (Ferron, 1994). Ces souches sont

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à l’origine d’auto-infection ou de contamination d’autres individus (Avril et al., 1988). Ainsi la transmission des souches peut être directe: intra ou interhumaine (manu portage) et indirecte à partir de source environnementale ou hospitalière.

2.3.4. Caractères morphologiques

Le Staphylocoque est une bactérie asporulée, non mobile d’environ 0,5µm à 1,5µm de diamètre disposé en amas, diplocoques, en courtes chainettes voir même en grappes typiques.

C'est une bactérie aéro-anaérobie facultative et chimio-organotrophe qui a un métabolisme respiratoire et fermentatif (Kloos et al., 1986). Elle se développe rapidement à 37°C et à un pH de 7,5 sur les milieux usuels. La plupart des souches de staphylocoques en particulier S. aureus ont la capacité de fermenter le mannitol contenu dans le milieu Chapman. Cette fermentation se traduit par le virement du milieu Chapman au jaune. Ce sont des cocci généralement acapsulées ou ayant une faible capacité de synthèse de capsule (Novick, 1990).

2.3.5. Substances secrétées

Les staphylocoques sont naturellement dotés de quelques capacités à secréter certaines substances (les enzymes et les toxines) qui permettent de la différencier des autres espèces.

De plus, au fur et à mesure que S. aureus devient pathogène, elle acquiert d’autres capacités de sécrétion de nombreuses toxines. Ces toxines sont secrétées en fonction de la pathologie créée par les staphylocoques (Avril et al., 1988).

2.3.5.1. Les enzymes

Les staphylocoques produisent des enzymes qui ont des intérêts pathogéniques et/ou diagnostics importants. Nous pouvons citer :

 La coagulase libre : S. aureus et d’autres souches sont capables de produire une substance provoquant la coagulation du plasma humain et de lapin. La coagulase libre est synthétisée pendant la phase de croissance du germe. La formation du coagulum nécessite la présence d’une globine (coagulase – reacting - factor) voisine de la prothrombine (Avril et al., 1988);

 La coagulase liée : à la surface des germes agit directement sur le fibrinogène, c’est le

« clumping factor » qui est responsable de l’agglutination sur une lame (Carbonelle et al., 1987) ;

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 La fibrinolyse ou la staphylokinase : cette enzyme est mise en évidence sur la gélose contenant de la fibrine et se traduit par une zone claire. Elle est thermolabile et antigénique (Avril et al., 1988);

 L’hyaluronidase : cette enzyme est thermolabile et hydrolyse l’acide hyaluronique.

Elle peut être recherchée par viscométrie ;

 La nucléase (D Nase) ou thermonucléase: elle est thermostable et est mise en évidence sur un milieu à base d’ADN avec du bleu de toluidine (halo rose) ou de l’acide chlorhydrique normal ;

 Il y a aussi d’autres activités telles que la lipasique, l’estérasique, la protéasique et la phosphatasique qui peuvent être mises en évidence sur le milieu à l’oeuf de Baird Parker (Avril et al., 1988).

2.3.5.2. Facteurs de virulence : toxines

La pathogénicité des staphylocoques est liée à l’expression de facteurs de virulence. S. aureus a la capacité de produire plusieurs toxines ayant pour cible les membranes cellulaires. Ces toxines se fixent à des cellules cibles et provoquent la formation de canaux membranaires laissant passer les ions (pore-formingtoxins). Ces toxines sont composées de deux protéines agissant en synergie pour créer des pores dans les membranes cellulaires de différentes cellules eucaryotes (Prévost, 2004; Schmidt et al., 2004). Les différentes toxines sécrétées par S. aureus et les plus souvent rencontrées sont les hémolysines, les leucotoxines, les entérotoxines, les toxines épidermolytiques ou exfoliatines, et la toxine du syndrome de choc toxique (TSST-1).

2.3.5.2.1. Entérotoxines

Les entérostomies staphylococciques (SEs) sont des protéines solubles, à chaînes linéaires de faibles masses moléculaires (27000 à 30000 Da) (Duquenne, 2010). Ces toxines sont des métabolites de la croissance de certaines souches de staphylocoques à coagulase positive, en particulier S. aureus, et de certaines espèces de staphylocoques à coagulase négative (Palmer, 1998). Les entérotoxines produites par S. aureus possèdent des similarités de conformation dans leurs séquences de nucléotides et d'acides aminés (Papageorgiou et al., 2000 ; Orwin et al., 2001). Les SEs sont résistantes aux protéases gastro-intestinales, telles que la pepsine, aussi bien qu’à la chaleur (Balaban et Rasooly, 2000). La stabilité thermique de ces toxines semble être dépendante du pH, de la concentration en NaCl, des protéines, etc, du milieu dans lequel elles se trouvent (Balaban et Rasooly, 2000). Elles ont toutes des activités biologiques similaires (Su et Wong, 1997).

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2.3.5.2.2. Les épidermolysines

Elles sont produites par environ 5% de S. aureus. Chez l’homme, trois types antigéniques sont actuellement décrits (ETA, ETB et ETD). L’exfoliatine D a été décrite récemment à partir d’une souche isolée dans une plaie cutanée et pas dans un cadre d’exfoliation généralisée ni d’impétigo bulleux (Avril et al, 1988). De plus, elle semble largement être représentée au sein des souches de S. aureus. Son rôle pathologique reste donc à confirmer par de nouvelles études (Avril et al., 1988).

2.3.5.2.3. Leucotoxines

La figure 1 montre la distribution des composants exprimant les leucotoxines. Le thème « leucotoxine » rassemble l’α-toxine et les toxines à deux composés formant des pores produites par S. aureus, à savoir la leucocidine de Panton et Valentine, les gamma-hémolysines, LukM-PV+LukF-PV, LukE+LukD, et LukS-I+LukF-I produites par Staphylococcus intermedius. Ce nom leur a été donné, car leurs cibles cellulaires majeures sont les polynucléaires neutrophiles, les monocytes et les macrophages ou les lymphocytes (Prévost, 2005).

Figure 1 : Schéma des différentes combinaisons des gènes chromosomiques codants et leur fréquence (Baba-Moussa et al., 2006).

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 La Leucocidine de Panton et Valentine (LPV) est la première leucotoxine à être purifiée et caractérisée. Elle est formée de deux composés S et F : LukF-PV et Luk S- PV (Prévost et al., 1995). Elle a pour cible les polynucléaires, les monocytes et les macrophages (Prévost et al., 2005). La LPV a une action leucotoxique et dermonécrotique, mais n’est pas hémolytique. L’effet toxique sur les leucocytes serait dû à une modification cationique. La LPV à deux constituants F et S agissant en synergie. Ces protéines différentes, de classe S (31 kDa) et de classe F (34 kDa) sont nécessaires pour former un pore actif. Cette dénomination vient de leur comportement en chromatographie échangeuse de cations : les protéines de classe F sont « fasteluted » et les protéines de classe S sont « Slow eluted » (Woodin, spectre d’activité alors que HlgC-HlgB ne lyse pas les lymphocytes T et est moins actif sur les érythrocytes humains (Gauduchon et al., 2001).

 La LukE-LukD est isolée chez plus de 75 % des souches de S. aureus responsable d’impétigo bulleux, elles-mêmes productrices d’épidermolysines A ou B (Gravet et al., 2001). Elle est aussi isolée de 93,6 % des souches de S. aureus associées à une diarrhée post-antibiothérapie; elles-mêmes productrices d’entérotoxine (>80 % pour l’entérotoxine A) (Gravet et al., 2001).

2.3.5.3.Mode d’action des leucotoxines à deux composés

L’activation synergique des deux composés individualisés conduit à la formation d’un pore actif. Ainsi, le composé de classe S se fixe en premier à la membrane de la cellule cible, permettant la fixation du composé de classe F (Figure 2). Il y a ensuite oligomérisation puis la formation du poreoctamérique (Prévost et al., 2004 ; Joubert et al., 2006). Il en résulte une lyse cellulaire due à la libération des ions. La figure 3 montre la disposition des composants Luk-S et Luk-F pour la formation de pores et leur mode d’action sur la membrane cellulaire.

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Figure 2: Mode d’action des leucotoxines à deux composés (Vincenota et al., 2008).

2.3.6. Les biofilms

La découverte du biofilm remonte au début des années 40 depuis les travaux de Henrici 1933 et Zobell 1943. Le terme « biofilm » a été utilisé pour la première fois par Zobell en 1943. Les biofilms sont un ensemble de micro colonies, entourées d’une matrice hautement hydratée, anionique et constituée d’exopolysaccharides (EPS). Christensen et al. (1982) ont été les premiers à observer la formation d’un biofilm chez une souche de S. epidermidis isolée d’un cathéter. Ils ont noté la formation d’un film gluant, filamenteux sur des tubes de cultures, puis ils ont visualisé cette substance extracellulaire par une coloration au bleu alcian en microscopie électronique à balayage. Ces auteurs ont noté que la plupart des souches avaient une production variable de cette substance qui dépendait du milieu et de la supplémentassions en glucose. Ils ont suggéré que la formation de biofilm était un facteur critique dans la pathogénèse de S. epidermidis. Ces faits ont été confirmés la même année par Peters et al.

(1982) qui ont montré une corrélation entre la capacité de colonisation du matériel médical par S. epidermidis et les infections nosocomiales (Planchon, 2006). Le biofilm est une communauté structurée de micro-organismes, se fixant à une surface inerte ou vivante et réunis au sein d’une matrice d’exo-polysaccharides (Jain et al., 2011) adhésive et protectrice qu’ils secrètent. C’est une structure très organisée avec de nombreuses communications

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intercellulaires pour assurer un équilibre et un mode de vie coopératif (Boutaleb, 2007 ; Salaun, 2009). Un biofilm peut être constitué d’une ou plusieurs espèces de microorganismes (Behlau et Gilmore, 2008). Dans l'industrie alimentaire, il est important de connaître les conditions dans lesquelles S. aureus est capable de survivre, adhérer aux surfaces et former des biofilms (FutagawaSaito et al., 2006), conduisant à la contamination des produits alimentaires surface (Fratamico et al., 2009).

2.3.7. Familles d’antibiotiques et leur mode d’action

Un antibiotique est une substance antibactérienne d'origine biologique, c'est-à-dire produite par des microorganismes (champignons microscopiques et bactéries) ou de synthèse chimique et qui est capable d'inhiber la multiplication ou de détruire d'autres microorganismes (Yala et al., 2001).

2.3.7.1. Classification des antibiotiques et modes d’actions

La classification repose sur leur structure chimique et leur mécanisme d'action, lesquels conditionnent leur spectre d'activité car ils agissent spécifiquement sur une étape essentielle du métabolisme des bactéries se manifestant à très faible dose par l’inhibition de certains processus vitaux (Yala et al., 2001).

2.3.7.1.1. Antibiotiques agissant sur la membrane

Certains antibiotiques se fixent sur les membranes bactériennes en particulier la membrane externe des bactéries et les désorganisent en se combinant avec notamment les phospholipides qui les constituent. Il peut s'agir de la membrane externe de la paroi des bactéries à Gram négatif (-) ou de la membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif (+). Parmi ces antibiotiques, nous retrouvons les Polymycines (Colistine) et les Nitrofuranes (nifurzide, nifuroxazide) (Yala et al., 2001).

2.3.7.1.2. Antibiotiques agissant sur la synthèse du peptidoglycane

Le peptidoglycane est un polymère réticulé fait de chaînes polysaccharidiques reliées par des peptides (Nauciel & Vildé, 2005). Lorsque les bactéries sont en phase de croissance, il existe simultanément des phénomènes de synthèse et de destruction du peptidoglycane. L’équilibre entre ces deux phénomènes est rompu par les antibiotiques inhibant la synthèse du peptidoglycane en bloquant la phase finale de la polymérisation. Il en résulte une altération de la paroi ayant un effet létal pour la bactérie. C’est le cas chez les ß-lactamines qui agissent au niveau de la paroi bactérienne en inhibant la dernière étape de la synthèse du peptidoglycane entrainant une lyse bactérienne (Yala et al., 2001).

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2.3.7.1.3. Antibiotiques inhibant la synthèse protéique

Plusieurs familles d’antibiotiques peuvent inhiber, par différents mécanismes, l’élongation de la chaîne polypeptidique chez les bactéries.

 Les Macrolides (Erythromycine, Azithromycine), les Lincosamides (lincomycine, clindamycine), les Streptogramines et les Oxazolidones qui se fixent sur la sous-unité 50S du ribosome ; et enfin les antibiotiques inhibant le facteur d’élongation EF-2 comme l’Acide fusidique (Jehl et al., 2003).

 Les Phénicoles (Chloramphénicol et Thiamphenicol) : Les deux molécules sont bactériostatiques. Elles agissent au niveau de la sous unité 50 S du ribosome. Ceci a pour conséquence une inhibition de la synthèse des protéines.

 Les Tétracyclines : Ils se lient aussi aux protéines de la sous unité 30S mais peuvent aussi se lier en faible proportion aux protéines de la sous unité 50S.

 Les Aminosides : la Sisomycine, la Streptomycine, la Gentamicine, la Kanamycine, la Netilmicine, l’Amykacine et la Tobramycine sont des antibiotiques puissants. Selon Yala et al. (2001), Ils perturbent la synthèse des protéines au niveau de la fraction 30S du ribosome entraînant la destruction bactérienne.

 Acide Fusidique : c’est un antibiotique stéroidien. Il agit sur la synthèse des protéines.

C'est un antibiotique antistaphylococcique majeur. Il est actif sur les staphylocoques Méti S. et Méti R.

2.3.7.1.4. Antibiotiques agissant sur les acides nucléiques

Ce groupe comprend les Sulfamides et le Triméthoprime utilisés souvent en association (cotrimoxazole) inhibant la synthèse des folates et en plus il interagit avec la dihydrofolate réductase pour inhiber la synthèse de l’acide tétrahydrofolique. Les quinolones interfèrent avec l’état topologique de l’ADN bactérien en inhibant les topoisomérases ou ADN-gyrase, enzyme intervenant dans la conformation de l’ADN (acide nalidixique, ofloxacine, ciprofloxacine, péfloxacine). A l'image de l'acide nalidixique, ils inhibent la synthèse de l'ADN par blocage de l'activité de la sous unité alpha de l'ADN gyrase.

 Les rifamycines sont constituées d'un grand cycle et d'un cycle aromatique. On distingue trois antibiotiques : La Rifamycine SV (Rifocine®), la Rifamide et, la Rifampicine. Ils inhibent l’ARN polymérase arrêtant la synthèse des ARN messagers au stade d’initiation (Yala et al., 2001).

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 Ils font partir d'une famille complexe agissant aussi bien sur les bactéries que sur les parasites. On distingue le Tinidazole et le Métronidazole. Ils agissent en inhibant la synthèse des acides nucléiques entraînant la mort rapide de la bactérie.

 La novobiocine est un dérivé de la coumarine comportant en outre dans sa formule un phénol substitué et un sucre le Noviose. Elle inhibe la réplication de l'ADN. La novobiocine est un antibiotique antistaphylococcique, actif sur les cocci à Gram négatif, les Hemophilus et les Pasteurelles (Yala et al., 2001).

2.3.7.2. Mécanisme de résistance aux antibiotiques

L’antibiorésistance est la capacité d’un microorganisme (comme des bactéries, des virus et certains parasites) d'empêcher un antimicrobien (tel que des antibiotiques, des antiviraux et des antipaludéens) d'agir contre lui. En conséquence, les traitements standards deviennent inefficaces, les infections persistent et peuvent se propager (OMS, 2017). Deux types de résistances peuvent être distingués : la résistance naturelle et la résistance acquise. La résistance naturelle a pour support génétique le chromosome bactérien et elle permet de définir le spectre d’activité des antibiotiques. Elle est stable, transmise à la descendance et constitue un caractère qui est commun à tous les individus d’une même espèce bactérienne (phénotype sauvage). Ce type de résistance résulte de modifications du génome bactérien. La résistance des bactéries peut être acquise par une mutation et transmise verticalement par sélection aux cellules filles. Plus généralement, la résistance est acquise par transfert horizontal de gènes de résistance entre espèces. L’échange de gènes est possible par transformation, transduction ou conjugaison (Kumar et Varela, 2013 ; Dowling et al., 2017).

Les principaux mécanismes de résistance bactérienne aux agents antimicrobiens sont notamment les suivants :

- l'inactivation enzymatique du médicament ; - la modification de la cible du médicament ; - la réduction de la perméabilité aux médicaments ;

- l’efflux actif des médicaments (MacGowan et Macnaughton, 2017).

Les mécanismes de résistance permettent aux bactéries qui hébergent ces mécanismes de survivre, voire de se développer activement, en présence d'un agent antimicrobien donné.

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CADRE, MATERIEL et METHODES

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3. Cadre, Matériel et Méthodes 3.1. Cadre d’étude

Cette étude s’est faite au Laboratoire de Biologie et de Typage Moléculaire en Microbiologie (LBTMM) qui est un laboratoire de recherche scientifique du département de Biochimie et de Biologie Cellulaire de la Faculté des Sciences et Techniques (FAST) de l’Université d’Abomey-Calavi (UAC). Les échantillons de produits laitiers ont été collectés dans les établissements scolaires secondaires de Cotonou et d’Abomey-Calavi.

3.2. Méthodologie

Les échantillons prélevés sont des produits laitiers fermentés à savoir : yaourt, dèguè mil, dèguè couscous pris dans les établissements scolaires secondaires de Cotonou et d’Abomey-Calavi. L’étude s’est déroulée en deux étapes : une phase d’échantillonnage et une phase d’analyse au laboratoire.

3.2.1. Phase d’échantillonnage

Un total de 180 échantillons a été collecté dont : 60 yaourts, 60 dèguè Mil et 60 dèguè

Un total de 180 échantillons a été collecté dont : 60 yaourts, 60 dèguè Mil et 60 dèguè