Article pp.137-158 du Vol.24 n°2 (2004)

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ARTICLE ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Traitement d’ovoproduits en continu par champs électriques pulsés

R. Jeantet*¹, J. Ripoll Mc Keag², J. Carballeira Fernández², N. Grosset¹, F. Baron¹, J. Korolczuk³

SUMMARY

Pulsed electric field continuous treatment of egg products

A new, continuous (0 – 25 l.h^-1) equipment for pulsed electric fields (PEF) treatment of liquids has been tested with model solutions and egg white products, seeded beforehand to 10⁷ cfu·ml^-1 of Salmonella Enteritidis. The electric field is ranging between 30 and 80 kV·cm^-1, the pulse width between 50 ns and 3 µs and the frequency between 10 and 815 Hz.

The equipment tested delivers electrical pulses of about trapezoidal shape, with an increasing phase lasting about 16 ns, a flat phase of 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 or 3000 ns and the decay phase lasting between 29 ns for a pulse of 50 ns and 478 ns for 3 µs impulses. The flat phase delivers between 75 and 95% of the total energy.

Up to 4 decimal reductions of microbial contamination was achieved for a model solution of 28 mM sodium sulfate and glucose and up to only 2 decimal reductions for egg products. The decimal reduction was linearly related to the energy input: 30 to 40 kJ·kg^-1 was needed to achieve one decimal reduction of Salmonella Enteritidis in a solution of 28 mM sodium sulfate, egg white ultrafiltration permeate at pH 6, and egg white ultrafiltration permeate at pH 9 with 0.45% of lysosyme added. The energy of decimal reduction was ranging between 120 to 150 kJ·kg^-1 for the egg white, egg white mucine free, and the egg white ultrafiltration permeate at pH 9. For the same energy input, an increase of the electric field by 40 kV.cm^-1 adds one decimal reduction of the contamination. On the other hand, an increase of the electric current by 294 A reduces the decontamination efficiency by one Log.

1. École Nationale Supérieure Agronomique de Rennes ; Département Agroalimentaire 65, rue de Saint- Brieuc, 35042 Rennes cedex.

2. Aula de Productos Lácteos, Avda. Fábrica da Luz, s/n. Recinto Ferial, 27004 Lugo, Espagne.

3. INRA, UMR 1055, 65, rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes cedex.

* Correspondance jeantet@agrorennes.educagri.fr.

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Electric arc formation is a limiting factor for the PEF treatment. The probability of electric arcs appearance is a power law function of the electric field strength and the treatment time. The upper limit of the energy input with 50% probability of arc formation is about 350 kJ.kg^-1 for the 28 mM sodium sulfate solution, 250 kJ·kg^-1 for the white eggs permeate, 150 kJ·kg^-1 for the eggs white mucine free and only 30 kJ·kg^-1 for the whole eggs white.

Then, the PEF treatment doesn’t seem to offer the possibility to decontami- nate satisfactorily egg products: in itself, it couldn’t constitute an alternative to heat treatment. A solution could consist in combining PEF and heat treat- ments in order to guarantee the hygienic quality of industrial egg products Key words

Pulsed electric fields, egg products, Salmonella Enteritidis, pasteurization.

RÉSUMÉ

Le traitement par champs électriques pulsés (CEP) en continu d’ovoproduits liquides, préalablement ensemencés avec une souche de Salmonella Enteritidis à 10⁷ ufc.ml^-1, a été étudié. Au cours de ces essais, le champ électrique, la durée d’impulsion et la fréquence variaient de 30 à 80 kV·cm^-1, de 50 ns à 3 µs et de 10 à 815 Hz, respectivement. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus avec une solution modèle de sulfate de sodium (28mM) et de glucose (28 mM).

La destruction de S. Enteritidis est au maximum de 2 réductions décimales pour les ovo produits, contre 4 pour la solution modèle. On observe une relation linéaire entre la quantité d’énergie apportée au produit et le taux de décontami- nation. L’énergie de réduction décimale varie entre 30 et 40 kJ·kg^-1 pour la solution modèle, l’ultrafiltrat de blanc d’œuf à pH 6 et l’ultrafiltrat de blanc d’œuf additionné de lysozyme ; elle est comprise entre 120 et 150 kJ·kg^-1 pour le blanc d’œuf, le blanc d’œuf démuciné, et l’ultrafiltrat de blanc d’œuf à pH 9. Les CEP n’offrent donc pas la possibilité de décontaminer les ovoproduits de manière satisfaisante, et ne peuvent constituer à eux seuls une alternative aux traitements thermiques.

Mots clés

Champs électriques pulsés, ovoproduits, Salmonella Enteritidis, pasteurisa- tion.

1 – INTRODUCTION

La production d’ovoproduits a connu de 1990 à 1999 une progression de 77 % en France (MAGDELAINE et MIRABITO, 2000), qui est aujourd’hui leader européen de cette filière. La valorisation croissante des propriétés fonctionnelles (pouvoir liant, moussant, gélifiant) du blanc, du jaune ou de l’entier dans la fabrication de nombreux produits alimentaires (plats cuisinés, sauces ou pâtis- series) impose que leur qualité hygiénique soit satisfaisante.

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Dans le même temps, les œufs et ovoproduits étaient mis en cause dans 52 % des toxi-infections alimentaires collectives à salmonelle survenues en 1998 en France (HAEGHEBAERTet al., 2001). Le traitement thermique du blanc d’œuf (57 ˚C pendant 2 à 5 minutes), modéré du fait de la thermosensibilité de ses protéines, ne permet qu’une destruction limitée de Salmonella Enteritidis.

Le temps de réduction décimale à 53 ˚C et le z (augmentation de température nécessaire pour diviser par 10 le temps de réduction décimale) de cette espèce bactérienne dans le blanc d’œuf étant respectivement égaux à 12,6 minutes et 5,1 ˚C (DENIS et al., 1995), un tel traitement ne permet en effet qu’une réduction de 1 à 2,5 Log de la population de S. Enteritidis. La maîtrise de la qualité hygié- nique des ovoproduits constitue donc un frein au développement de ce secteur.

Afin d’atteindre cet objectif en préservant les propriétés fonctionnelles de ces produits, différents procédés d’épuration microbienne à effet thermique limité peuvent être envisagés. Cependant, leur application aux ovoproduits se heurte à des difficultés d’ordre technologique (microfiltration, hautes pressions), régle- mentaire (UV) ou d’acceptation par les consommateurs (ionisation).

Depuis quelques années, on observe un intérêt grandissant pour le procédé de champs électriques pulsés (CEP), qui semble constituer l’une des alternati- ves les plus sérieuses à la décontamination d’aliments par traitements thermiques. Ce procédé consiste à appliquer des champs électriques d’amplitude comprise entre 5 et 50 kV.cm^-1 sur des durées de 2 µs à 1 ms dans le but d’inactiver les microorganismes à température non létale et inférieure à 50 ˚C (SALE et HAMILTON, 1967 ; JAYARAM et al., 1992 ; KNORR et al., 1994 ; ZHANG et al., 1994 ; QIN et al., 1995 ; VEGA-MERCADO et al., 1997 ; BARSOTTI et CHEFTEL, 1999 ; JEYAMKONDAN et al., 1999). Des destructions comprises entre 2 et 6 réductions décimales ont été obtenues pour des levures et de nombreuses espèces bactériennes en fonction du milieu considéré, des paramètres électri- ques (amplitude du champ électrique, durée et nombre d’impulsions électriques appliquées) et de la conception de la cellule de traitement (HULSHEGERet al., 1983 ; DUNN et PEARLMAN, 1987 ; GRAHL et al., 1992 ; JAYARAM et al., 1992 ; CASTRO et al., 1993 ; KNORR et al., 1994 ; QIN et al., 1995 ; HO et al., 1995 ; PELEG, 1995 ; ZHANG et al., 1995 ; GRAHL et MÄRKL, 1996 ; QIN et al. 1996 ; LUBICKI et JAYARAM, 1997 ; MARQUEZ et al., 1997 ; VEGA-MERCADO et al., 1997 ; DE JONG et VAN HEESCH, 1998 ; JEANTET et al., 1999 ; JEYAMKONDAN et al., 1999 ; BLISKAet al., 2000 ; WOUTERS et al., 2001 ; HEINZ et al., 2002). L’utilisation de CEP pour la stabilisation d’ovo produits à des températures inférieures à 50 ˚C a fait l’objet d’un nombre d’études limité. Les CEP permettent ainsi d’obtenir 6 réductions décimales d’Escherichia coli à 37 ˚C dans de l’œuf entier (MARTIN- BELLOSO et al., 1997) et 3,5 réductions décimales de S. Enteritidis à 30 ˚C dans du blanc d’œuf traité en discontinu, sans dénaturation protéique apparente (JEANTET et al., 1999). Ce niveau de décontamination, bien que supérieur à celui obtenu par traitement thermique de blanc d’œuf liquide, reste cependant insuf- fisant pour garantir la qualité sanitaire de produits alimentaires, qui est indus- triellement validée pour des destructions supérieures ou égales à 5 réductions décimales.

L’objectif de cette étude est de définir les plages de fonctionnement optimal du procédé appliqué au traitement continu d’ovoproduits, et de blanc d’œuf en particulier, pour la décontamination de S. Enteritidis. Elle a été menée en utili- sant un équipement de CEP dont la conception permet la mesure et le contrôle des facteurs clefs sur une très large étendue.

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2 – MATÉRIEL ET MÉTHODES

2.1 Équipement de CEP

L’équipement de CEP utilisé (figure 1 ; Europulse, Cressensac, France) fait appel à une technologie originale de commutation par éclateur pressurisé (air sec) à taux de répétition élevé associée à une structure de type ligne de formation à constantes localisées et réparties (JEANTET et al., 2003). Un ordinateur permet de programmer la durée des impulsions rectangulaires générées (50 ns à 3 µs), l’amplitude du champ électrique (30 à 80 kV.cm^-1), la fréquence de répétition (1 à 815 Hz), le débit (1 à 10 l.h^-1) et la température maximale du produit atteinte après traitement.

Figure 1

Plate-forme pilote de traitement continu de produits liquides par CEP.

Coffret de commande et d’interface – A : alimentation électrique ; B et C : tiroir de commande et ordinateur ; D et E : moniteur et alimentation haute tension (50 kV, 2 kJ.s^-1); F : éclateur répétitif (0 - 815Hz) ; G : lignes de stockage haute tension (50 ns, 100 ns, 250 ns, 500 ns, 1 µs, 2 µs et 3 µs). Partie hydraulique – 1 : bac de

lancement (12 L), 2 : agitateur magnétique, 3 : pompe péristaltique (0 - 25 l.h^-1), 4 : cellule de traitement, 5 : échangeur de chaleur ; T₁ et T₂ : thermocouples.

Pilot plant for continuous PEF treatment of liquid products. Control panel – A : power supply ; B : programming and control drawer; C : computer, D and E : high voltage

monitor and power supply (50 kV, 2 kJ.s-1); F = spark gap switch (0 – 815 Hz);

G : high voltage energy storage (50ns, 100ns, 250ns, 500ns, 1µs, 2µs, 3µs).

Hydraulic line – 1 : supply tank (12 l); 2 : magnetic stirrer; 3 : peristaltic pump (0 – 25 l.h-1); 4 : PEF treatment cell; 5 : heat exchanger; T1, T2 : thermocouples.

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La cellule est équipée d’un capteur de courant et d’un diviseur résistif permettant la mesure directe du courant et de la tension appliqués par un oscilloscope numérique TDS 3012 (Tektronix, Beaverton, États-Unis).

La partie hydraulique est composée d’une cuve à double parois pour ajuster la température du produit, couplée à une pompe péristaltique à débit variable (0 à 25 l.h^-1), contrôlé par une balance située en queue d’installation. La cellule de traitement se compose de deux électrodes coaxiales distantes de 2 mm.

L’élévation de température due au traitement est mesurée par deux thermocouples disposés en amont et aval de la cellule. Le produit est refroidi par un échangeur de chaleur disposé immédiatement après la cellule et alimenté par de l’eau glycolée.

2.2 Ovoproduits

Le blanc d’œuf (BO) utilisé (3-Vallées, Ambrières-les-Vallées, France) est obtenu à partir d’œufs de poules pondeuses âgées de 24 à 35 semaines d’un seul et même éleveur. Les œufs coquilles sont stockés 8 jours avant cassage, celui-ci étant réalisé au démarrage de la casserie sur circuit propre. Le blanc obtenu est filtré deux fois avant conditionnement, et traité par CEP dans les 2 jours.

Cependant, la conductivité électrique (σ) du blanc d’œuf ne permet pas de se rapprocher de la valeur optimale de résistance électrique (50 Ω) de la cellule de traitement et du système d’alimentation haute tension utilisés. Afin de lever cette difficulté, des essais ont été conduits avec des fractions de blanc d’œuf de conductivité plus faible. Il s’agit de perméat d’ultrafiltration de blanc d’œuf dilué (PER), additionné éventuellement de lysozyme (PERL ; concentration : 0,45 % p:p) ou de protéines de blanc d’œuf démucinées (BOD ; concentration : 9 % p:p).

L’ultrafiltration du blanc d’œuf est réalisée avec un équipement TIA (Bollene, France) équipé d’une membrane spirale PW2540F (Osmonics, Minnetonka, USA) de surface 2,5 m² et de seuil de coupure 10 kg.mol^-1. La pression trans- membranaire moyenne est de 5,0 ± 0,5 bar, et la température inférieure à 20 ˚C.

Le perméat obtenu est dilué deux fois avec de l’eau distillée.

Les protéines démucinées sont obtenues par dilution 1 : 3 (v : v) de blanc d’œuf avec de l’eau distillée. Le pH du mélange est ajusté à pH 6,0 à l’aide d’HCl 2 M, et maintenu 24 h à 4 ˚C pour favoriser la précipitation et la décanta- tion de l’ovomucine. Le surnageant est ajusté à pH 8,0 à l’aide de NaOH 2 M, centrifugé à 25 000 g pendant 20 min à 4 ˚C afin d’éliminer les dernières fractions insolubles, puis lyophilisé.

2.3 Traitement de CEP

Les essais de CEP sont réalisés en continu à un débit de 5 l.h^-1. Le traitement de CEP simple (le liquide traité n’effectue qu’un seul passage dans la cellule) s’effectue selon le protocole suivant :

1/ nettoyage et désinfection de l’ensemble de la ligne avant essai, par pom- page d’eau de Javel à 0,1% de chlore actif à 25 l.h^-1 pendant 1 minute puis à 5 l.h^-1 pendant 4 minutes ;

(6)

2/ rinçage de l’ensemble de la ligne à l’aide d’eau sulfatée stérile de conducti- vité électrique identique à celle du liquide étudié (25 l.h^-1 pendant 2 minutes) ;

3/ début du traitement de CEP sur eau sulfatée stérile ;

4/ après stabilisation des paramètres, passage sur le liquide étudié à l’aide d’une vanne trois voies ;

5/ prélèvement du liquide traité après 5 minutes de traitement, correspondant au temps nécessaire à l’élimination de 3 volumes morts de l’installation. Le liquide traité et refroidi par l’échangeur peut également être collecté à partir de ce moment dans un flacon stérile, en vue d’un traitement de CEP multiple.

6/ retour au point 1.

L’efficacité du cycle nettoyage / désinfection est vérifiée par dénombre- ment des cellules microbiennes dans l’eau de rinçage. Le traitement de CEP multiple correspond à un traitement simple répété deux à trois fois. Dans ce cas, la solution traitée est collectée dans un flacon stérile au premier passage (point 5 ci-dessus). Après désinfection de l’ensemble de la ligne, ce flacon remplace le bac de lancement sur la ligne, et la solution est alors traitée une deuxième fois. Ce protocole peut éventuellement être répété une autre fois, afin de réaliser un traitement triple. L’échauffement ohmique dû aux différents traitements est compensé à chaque passage par l’échangeur de chaleur, qui permet de ramener la température du produit à sa valeur initiale.

2.4 Caractérisation des impulsions électriques

L’évolution de σ en fonction de la température est déterminée avec un conduc- timètre 145A+ (Orion, Cambridge, USA) pour le blanc d’œuf ou les fractions de blanc d’œuf mises en œuvre. Le domaine des possibles est alors établi pour chacun des produits. Il correspond aux traitements d'une durée de 5 minutes, sans arcs électriques et ayant engendré une température inférieure à 50 ˚C, de manière à s’affranchir des effets de décontamination par la chaleur.

L’énergie totale apportée par les impulsions (Q_T) est calculée en sommant les énergies des parties montantes (Q_M), du plateau (ou « crête » – Q_C) et des- cendantes (Q_D), qui s’obtiennent par discrétisation de la puissance électrique instantanée P_i (W) en fonction du temps, la période d’échantillonnage correspondant à celle de l’oscilloscope (0,5 ns). La puissance électrique instantanée se déduit de la relation :

P_i = U_i . I_i [1]

où U_i et I_i sont respectivement la tension (V) et le courant électrique (A) à l’ins- tant i appliqués aux électrodes de la cellule de traitement. La puissance électri- que dissipée au plateau (P_c) peut également être calculée à partir de la relation :

[2]

R_CEL, résistance électrique de la cellule (Ω) peut être calculée à partir de la conductivité du liquide traité σ (S.cm^-1) :

[3]

P U

c = Rc²

R_CEL F Inr r

= ⋅ e

⋅ ⋅

σ π

2 1 2

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avec F = 0,59 facteur de forme de la cellule, r₂= 0,5 cm et r₁= 0,3 cm rayon externe et interne de la cellule et e = 0,2 cm longueur des électrodes. La correspondance entre Q_T calculée et l’échauffement ohmique du milieu mesuré est alors évaluée.

2.5 Microbiologie

Une souche de Salmonella Enteritidis, isolée du blanc d’œuf et identifiée par l’AFSSA (9066.94), est conservée sur des cryobilles (AES, Combourg, France) à – 18 ˚C. Avant chaque expérience, la souche décongelée est incubée 24 h à 37 ˚C dans du bouillon nutritif (Tryptone de soja, Biomérieux, Marcy l’Etoile, France), puis repiquée et incubée à nouveau dans les mêmes conditions. Les cellules obtenues sont lavées dans du perméat d’ultrafiltration de blanc d’œuf dilué (centrifugation à 5 000 g, 10 min, 20 ˚C, trois fois), puis inoculées à 2 % dans le produit à traiter afin d’obtenir une concentration finale de 10⁷ ufc.ml^-1. Les unités formant colonies (ufc) sont dénombrées après incubation des boîtes à 37 ˚C pendant 24 heures, avec une précision de 0,5 Log. Après traitement de CEP, les cellules cultivables sont dénombrées de la même manière.

3 – RÉSULTATS

3.1 Caractérisation des impulsions électriques

Une impulsion électrique, déchargée dans la cellule de traitement, peut être décomposée en trois parties (figure 2) : une partie montante (de 10 à 90 % de l’amplitude maximale) de durée très brève (< 10 ns), un plateau dont la durée est égale à la durée programmée (50 à 3 000 ns) et une partie descendante, qui dure de 30 à 480 ns en fonction de la durée programmée d’une impulsion. Le circuit électronique étant composé des condensateurs, de résistances et de sélénoïdes, le niveau du champ au plateau est légèrement perturbé (± 10 %).

L’essentiel de l’énergie totale dissipée provient du plateau de l’impulsion (75 à 95 % ; figure 3). Les parties montante et descendante représentent respectivement de 0,3 à 9,6 % et de 7 à 19 % de Q_T, en fonction du temps programmé d’une impulsion.

3.2 Conductivité et résistance électrique

La résistance électrique d’un produit dans la cellule de traitement R_CEL est une fonction de sa conductivité électrique σ, qui varie avec la température. La figure 4 montre que pour les ovoproduits étudiés et entre 5 et 50 ˚C, R_CEL est comprise entre 12 et 70 Ω. Sur cette plage de température, on peut notamment observer que R_CEL est plus faible que la résistance optimale de fonctionnement de l’équipement (50 Ω) pour du blanc d’œuf ou du perméat d’ultrafiltration de blanc d’œuf. Les conséquences d’une trop faible résistance électrique sont la limitation de l’amplitude maximale du champ électrique d’une part, et d’autre part l’augmentation du courant et de l’échauffement par effet Joule du produit.

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Figure 2

Évolution de l’amplitude du champ électrique (E) dans la cellule de traitement au cours d’une impulsion, de durée comprise entre 50 ns et 3 µs.

Evolution of the electric field E (kV.cm^-1) in the treatment cell as a function of time for the pulse width in the range between 50 ns to 3 µs.

Figure 3

Répartition de l’énergie totale (Q_T) d’une impulsion entre les parties montante, descendante et le plateau en fonction de la durée programmée d’une impulsion t_P.

Distribution of the total energy (Q_T) of an impulse between increasing, flat and decreasing phases as a function of the programmed pulse width (t_p).

60 50

50 ns 100 ns 250 ns

500 ns 1 µs 2 µs 3 µs

40 30 20 10 0 – 10

– 100 900 1900

Temps (ns) E (kV-cm-1)

2900 3900

100 %

50 100 250

9,6 18,9

16 12,9 10,9 9,2 7,8 7,1

5,3

2,4 1,3 0,7

MONTÉE DESCENTE PLATEAU

0,4 0,3

t_p (ns)

500 1000 2000 3000

80 %

60 %

40 % 20 % 0 %

% QT

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Figure 4

Résistance électrique de la cellule de traitement (R_CEL) en fonction de la température du produit traité : : perméat de blanc d’œuf ; : blanc d’œuf ; x : 28 mM sulfate

de sodium et de glucose ;

+

: perméat de blanc d’œuf dilué deux fois ; : blanc d’œuf démuciné.

Electric resistance of the treatment cell (R_CEL) as a function of the product temperature: : egg white ultrafiltration permeate, : egg white, x : 28 mM sodium

sulfate and glucose,

+

: egg white ultrafiltration permeate diluted twice, : demucinated egg white.

En effet, l’alimentation haute tension utilisée permet de maintenir le niveau demandé du champ électrique au plateau d’une impulsion sur une large gamme de température en prenant en compte les paramètres d’une équation polynomiale de la conductivité en fonction de la température du produit.

Néanmoins, l’amplitude maximale du champ électrique est limitée lorsque la résistance de la cellule est trop faible. Par exemple pour R_CEL = 12 Ω, le champ maximal est 40 kV.cm^-1 et pour R_CEL = 25 Ω, il est limité à 67 kV.cm^-1 (figure 5). Afin de s’affranchir de ses difficultés, il est possible de diluer deux fois le blanc d’œuf ou sa phase soluble (perméat d’ultrafiltration de blanc d’œuf) avec de l’eau distillée.

90 80 70 60 50 40 30 20 10

10 20 30 40 50

0 0 RCEL (Ω)

T (°C)

(10)

Figure 5

Amplitude maximale du champ électrique (E_MAX) en fonction de la résistance électrique du produit dans la cellule de traitement.

Maximal amplitude of the electric field (E_MAX) as a function of the electric resistance of the product in the treatment cell.

3.3 Arcs électriques

Sous certaines conditions d’amplitude de champ électrique E et de durée totale de traitement t, correspondant au produit du nombre et de la durée des impulsions délivrées (t = N.t_P), des arcs électriques apparaissent dans la cellule de traitement. Ce phénomène est un facteur limitant du procédé. Une représen- tation du logarithme de t en fonction du logarithme de E (figure 6) permet de tracer une droite délimitant deux zones et caractérisant la probabilité de 50 % d’apparition d’arcs pendant 5 min de traitement en continu :

Log(t) = A + B . Log(E) [5]

Les coefficients A et B obtenus pour les différents ovoproduits étudiés sont présentés dans le tableau 1. À partir de ces résultats, on peut montrer que le temps de traitement avant l’apparition d’arcs électriques dans du blanc d’œuf est respectivement 4,1, 7,5 et 10,4 fois plus court que dans un blanc d’œuf démuciné, un perméat de blanc d’œuf dilué deux fois et une solution 28 mM du sulfate de sodium / glucose. La durée d’une impulsion n’a pas d’influence sur l’apparition d’arcs électriques (figure 6). Nous avons montré précédemment (JEANTET et al. 2003) que pour une solution 28 mM de sulfate de sodium et de glucose, le temps de traitement t avant l’apparition d’arcs était inversement proportionnel au carré du champ électrique :

[6]

140 120 100 80 60 40 20

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 0

R_CEL (Ω) EMAX (kV-cm-1)

t a b

E

= + ₂

(11)

où a correspond au temps de traitement avant l’apparition d’arcs pour E =

∞

^et ^{b = Q}^{50 %}^{.R, Q}^{50 %} (J) désignant la quantité d’énergie maximale admissible pour la probabilité de 50 % d’apparition d’arcs et R (Ω^{) étant la} résistance électrique de la cellule. L’équation [5] peut être remaniée selon :

[7]

Figure 6

Probabilité d’apparition d’arcs électriques dans la cellule de traitement lors du traitement de blanc d’œuf. Relation entre le logarithme du temps de traitement total t (µs) et le logarithme du champ électrique E (kV.cm^-1). , , : traitement sans formation d’arcs pour t_P respectivement égale à 50, 100 et 250 ns ;

, , : apparition d’arcs moins de 5 minutes après le début du traitement pour t_P respectivement égale à 50, 100 et 250 ns ; : courbe de probabilité de 50 %

d’apparition d’arcs ; nombre d’essais effectués : 137.

Probability of electric arcs formation in the cell during the treatment of the eggs white.

Relation between the logarithm of the treatment time t (µs) and the logarithm of the electric field strength E (kV cm^-1). , , : treatment without formation of

electric arcs during 5 minutes of treatment for pulse width of 50, 100 and 250ns respectively, , , : appearance of the electric arcs in less than 5 minutes of treatment for pulse width of 50, 100 and 250ns respectively, : line separating

the fields of 50% probability of appearing electric arcs during the treatment.

Number of experiments : 137.

Cette relation indique que la formation d’arcs est un phénomène dépendant de la quantité d’énergie reçue par le produit, fonction de la puissance engagée et du temps de traitement. Elle s’applique bien à la solution modèle de

Q t a E

50 R

2

%=( – )⋅

0,8

1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9

0,6 0,4 0,2

– 0,2 – 0,4 – 0,6 – 0,8 0

Log(E, kV/cm)

Log(t, µs)

Log(t) = A + B.Log(E) A_{50 %} = 3,87(± 0,04) B_{50 %} = – 2,38(± 0,08) r²= 0,98 ; ET = 0,04

E R

⎛ 2

⎝⎜⎜ ⎛

⎝⎜ ⎜

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sulfate de sodium et de glucose, pour laquelle le coefficient B de l’équation [4]

est très proche de – 2, et un peu moins bien aux ovoproduits étudiés, pour les- quels ce coefficient s’éloigne significativement de – 2 (tableau 1). À partir de l’équation [6], il est possible de déterminer les valeurs de Q_{50 %} pour chacun des ovoproduits étudiés à différentes valeurs de champ (tableau 1). La quantité d’énergie maximale reçue par le produit avant l’apparition d’arcs et permettant de garantir des conditions stables, est réduite d’un facteur 10 lorsqu’on passe de la solution 28 mM de Na₂SO₄ et de glucose (345 à 381 kJ.kg^-1) au blanc d’œuf (28 à 44 kJ.kg^-1). Les autres produits étudiés se situent entre ces deux extrêmes.

Tableau 1

Résultats des équations [5] et [7] obtenues pour les ovoproduits étudiés.

Table 1

Equation [5] and [7] results for the egg products studied.

3.4 Destruction de Salmonella Enteritidis

3.4.1 Blanc d’œuf

On constate une destruction quasi nulle (< 1 Log) de S. Enteritidis dans le blanc d'œuf (marque blanches – figure 7), c’est à dire proche de la limite d’erreur de l’analyse microbiologique et très loin des destructions obtenues sur solution modèle de sulfate de sodium et de glucose (≤ 4 Log ; marques noires – figure 7). Globalement, on observe une baisse quasi linéaire du logarithme du nombre de colonies avec l’augmentation de la quantité d’énergie délivrée, qu’il s’agisse du blanc d’œuf ou de la solution modèle. Cette tendance peut être exprimée par la relation :

[8]

où Log(ufc₀) correspond au niveau de contamination initial, et Q et Q_D sont respectivement la quantité d’énergie apportée au produit et l’énergie de réduc- tion décimale (kJ.kg^-1). Pour les 105 essais présentés figure 7 portant sur le blanc d’œuf ou la solution modèle (amplitude de champ électrique, courant et

Produit A ±ET B ±ET r² Q_50% (KJ.kg^-1)

25 kV.cm-1 80 kV.cm-1 28 mM Na₂SO₄ / Glucose 4,400 0,004 – 2,086 0,008 0,999 381 345 Perméat du BO dilué 2X 4,376 0,073 – 2,157 0,165 0,961 287 239 Blanc d’œuf démuciné 4,354 0,063 – 2,299 0,095 0,957 173 121 Retentas du BO dilué 2X 4,137 0,112 – 2,429 0,340 0,926 69 42

Blanc d’œuf (BO) 3,869 0,042 – 2,377 0,078 0,976 44 28

Log ufc Log ufc Q Q_D ( )= ( 0)+

(13)

durée d’impulsion variables d’un point à l’autre), la valeur moyenne de Q_D est de 43(± 2) kJ.kg^-1. Cette moyenne masque cependant de grandes différences suivant le produit considéré. En effet, Q_D est égale à 125(± 50) kJ.kg^-1 pour le blanc d’œuf, ce qui est environ quatre fois supérieur à la valeur obtenue pour la solution modèle de sulfate de sodium et de glucose (30(± 2) kJ.kg^-1; JEANTET

et al., 2003). Même si l’écart type de l’estimation de Q_D est très important dans le cas du blanc d’œuf, en raison notamment du faible niveau de l’énergie maximale admissible, la différence entre ces valeurs est significative.

Figure 7

Évolution de la population de S. Enteritidis (Log(ufc)) en fonction de l’énergie délivrée Q (kJ.kg^-1) lors du traitement CEP de blanc d’œuf (BO) et de la solution modèle de sulfate de sodium et de glucose (S). Les différentes marques correspondent aux différentes durées d’impulsion de 50 et 3000 ns ; E : amplitude du champ

électrique (kV.cm^-1) ; I : intensité du courant électrique (A).

Salmonella Enteritidis population (Log(ufc)) as a function of the amount of energy Q (kJ.kg^-1) received by the product during the PEF treatment of egg white (BO) and a

sodium sulphate and glucose model solution (S). The different marker styles correspond to pulse width values within the range between 50 and 3000 ns;

E: electric field strength (kV.cm^-1); I: current (A).

La quantité d’énergie Q apportée au produit est de loin la principale cause de destruction des microorganismes, permettant d’expliquer plus de 72 % de la diminution de la population de S. Enteritidis au cours du traitement (équation du type : log(ufc) = a + b.Q). Cependant, d’autres paramètres influencent le résultat du traitement. L’analyse statistique (figure 7) montre que l’amplitude du champ électrique E (kV.cm^-1) et l’intensité du courant électrique I (A) jouent également un rôle non négligeable. L’amplitude du champ électrique agit dans le même sens que la quantité d’énergie et une augmentation de E de 40(± 8) kV.cm^-1 (coefficient E_D de l’équation, figure 7) permet d’accroître d’une réduction déci- male la destruction de S. Enteritidis, toutes choses égales par ailleurs.

8

Log(ufc) = A + B.Q + C.E + D.I A = 6,80 (±0,13) B = – 0,023 (±0,002) C = – 0,025 (±0,006) D = 0,0034(±0,0008) ET = 0,56 ; r² = 0,77 N = 105

7 6 5 4 3 2

0 20 40 60 80 100 120 140

0

Q (kJ.kg^-1)

Log(ufc)

50-BO 100-BO 250-BO 500-BO 1000-BO

50-S 100-S 250-S 500-S 1000-S 2000-S 3000-S MODEL

(14)

L’intensité du courant électrique agit dans un sens opposé à E et Q. Une augmentation du courant de 294(± 56) A (coefficient I_D de l’équation, figure 7) diminue en effet d’un Log la destruction de S. Enteritidis. L’amplitude maximale de variation du courant étant de 550 A dans nos essais, ceci peut expliquer la perte de deux réductions décimales toutes choses égales par ailleurs. Ce point est particulièrement important dans le cas du blanc d’œuf, qui se caractérise par une très faible résistivité électrique, donc un courant électrique élevé.

L’ajustement du modèle n’est par contre pas amélioré en y incluant la durée d’impulsion (différentes marques de la figure 7), l’effet de ce paramètre étant ici confondu avec celui du couple énergie / champ électrique.

3.4.2 Perméat dilué, blanc d’œuf démuciné et perméat dilué additionné de lysozyme

L’application de CEP à des fractions de blanc d’œuf (PER, PERL, BOD) a été réalisée (traitement simple). Ces fractions présentent une énergie maximale admissible supérieure à celle du blanc d’œuf (tableau 1). Les résultats obtenus montrent cependant que la destruction de S. Enteritidis est négligeable dans du blanc d’œuf démuciné et du perméat dilué, qui sont donc comparables sur ce plan au blanc d’œuf (figure 8). Seul le perméat additionné de lysozyme présente une diminution significative (p = 0,01) de la contamination microbienne en fonction de l’énergie délivrée par le traitement. L’équation [8] permet dans ce cas de déterminer une énergie de réduction décimale de même niveau que pour une solution de sulfate de sodium 28 mM et de glucose 28 mM (Q_D= 30 ± 3 kJ.kg^-1).

3.4.3 Perméat de blanc d’œuf dilué

Afin d’évaluer l’efficacité de traitements de CEP d’apport énergétique supé- rieur à 100 kJ.kg^-1, des essais de traitement triple ont été réalisés avec du per- méat de blanc d’œuf dilué (PER ; pH 9 égal à celui du blanc d’œuf) et la solution modèle de sulfate de sodium et de glucose (SULF ; pH 6 après reconstitution) selon le protocole décrit en Matériel et méthodes. Les niveaux d’énergie atteints finalement sont de 135 kJ.kg^-1 (PER) et de 200 kJ.kg^-1 (SULF ; figure 9).

La figure 9 met en évidence un effet cumulatif mais non linéaire de la destruction microbienne en fonction de l’énergie délivrée. On peut également observer une différence significative (p = 0,01) au plan de l’efficacité de la destruction microbienne dans les deux produits : en effet, celle-ci est quasi nulle dans le perméat au premier passage (< 0,5 Log), et augmente aux deuxième et troisième passages (respectivement 1 et 2 Log). Au contraire, la destruction dans la solution modèle d'eau sulfatée glucosée est plus importante au premier passage (3 Log), et semble tendre vers une limite aux passages suivants (5 Log). L’énergie de réduction décimale (Q_D) au premier passage des produits dans la cellule, est de 145(± 48) kJ.kg^-1 pour le perméat dilué, donc proche de celle obtenue pour le blanc d’œuf, et de 20(± 1) kJ.kg^-1 pour la solution modèle.

Au deuxième et troisième passages, le niveau de Q_D diminue considérablement (43 ± (7) kJ.kg^-1) pour le perméat dilué et augmente (94(± 22) kJ.kg^-1) pour la solution modèle.

(15)

Figure 8

Évolution de la population de S. Enteritidis (Log(ufc)) en fonction de l’énergie délivrée Q (kJ.kg^-1) lors du traitement CEP de perméat de blanc d’œuf dilué (PER), de blanc d’œuf démuciné (BOD), et de perméat de blanc d’œuf dilué additionné

de lysozyme (PERL). Les zones grisées délimitent l’intervalle de confiance pour la probabilité p = 0,01.

Salmonella Enteritidis population (Log(ufc)) as a function of the amount of energy Q (kJ.kg^-1) received by the product during the PEF treatment of egg white permeate

diluted twice (PER), demucinated egg white (BOD) and lysosyme added egg white ultrafiltration permeate (PERL). Shadowed zones demarcate the confidence interval

for the probability p = 0.01.

3.4.4 Effet du pH

Toutefois, ces différences entre perméat de blanc d’œuf dilué (pH 9) et solution modèle d'eau sulfatée glucosée (pH 6) peuvent s’expliquer en partie par les différences de pH de ces deux solutions (figure 10). Lorsque le pH du perméat est ramené à 6 par ajout d’HCl 1N, la destruction de Salmonella Enteritidis est supérieure (Q_D de l’ordre de 32 kJ.kg^-1, contre 54 kJ.kg^-1 à pH 9) et se rappro- che de celle obtenue sur solution modèle. La destruction reste cependant faible au premier passage (< 1 Log).

8

7

6

5

4

0 30 60 90

Q (kJ.kg^-1)

Log(ufc)

BODPER + BOD PERLPER

(16)

Figure 9

Évolution de la population de S. Enteritidis (Log(ufc)) en fonction de l’énergie délivrée Q (kJ.kg^-1) lors du traitement CEP multiple de perméat de blanc d’œuf dilué (PER ; pH 9) et d’une solution modèle de Na₂SO₄ et de glucose à pH 6 (SULF ; pH 6).

Les zones grisées délimitent l’intervalle de confiance pour la probabilité p = 0,01.

Les nombres 1, 2 et 3 correspondent aux différents passages effectués.

Salmonella Enteritidis population (Log(ufc)) as a function of the amount of energy Q (kJ.kg^-1) received by the product during the multiple PEF treatment of egg white ultrafiltration permeate diluted twice (PER; pH 9) and a sodium sulphate

and glucose model solution (SULF; pH 6). Shadowed zones demarcate the confidence interval for the probability p = 0.01.

Numbers 1, 2 and 3 correspond to the different pass implemented.

8 7 6 5 4 3 2 1 0

0 30 60 90 120 150 180 210

PER SULF

Log(ufc)

Q (kJ.kg^-1) 1

2

3

(17)

Figure 10

Évolution de la population de S. Enteritidis (Log(ufc)) en fonction de la quantité d’énergie délivrée Q (kJ.kg^-1) lors du traitement par CEP multiple de perméat de blanc d’œuf dilué (PER) à pH 9 et pH 6 et d’une solution modèle de Na₂SO₄ et de glucose à pH 6 (SULF). Les zones grisées délimitent l’intervalle de confiance

pour la probabilité p = 0.01.

Les nombres 1, 2 et 3 correspondent aux différents passages effectués.

Salmonella Enteritidis population (Log(ufc)) as a function of the amount of energy Q (kJ.kg^-1) received by the product during the multiple PEF treatment of egg white ultrafiltration permeate diluted twice (PER) at pH 9 and pH 6 and a sodium sulphate

and glucose model solution at pH 6 (SULF). Shadowed zones demarcate the confidence interval for the probability p = 0.01.

Numbers 1, 2 and 3 correspond to the different pass implemented.

4 – DISCUSSION

4.1 Arcs électriques

L’évaluation des domaines d’étude compatibles avec les ovoproduits étu- diés, montre que le domaine de fonctionnement, c’est-à-dire l’énergie maximale admissible par le produit sans apparition d’arcs électriques, est dans leur cas beaucoup plus restreint que pour une solution modèle d’eau sulfatée glucosée.

Différents éléments peuvent être avancés pour expliquer ces différences. En premier lieu, la conductivité électrique σ du produit joue ici un rôle crucial. En effet, une diminution de σ se traduit par une augmentation du paramètre A et une diminution du paramètre B de l’équation [4], conduisant à une durée totale

8

0 30 60

Log(ufc) = A + Q / Q_D

Q (kJ/kg)

< 50

> 50

pH 9 1710 (±335)

106 (±13)

pH 6 54 (±1,4) 32 (±0.5)

90 120 150 180

7

6 5 4 3 2

Q (kj.kg^-1)

Log(ufc)

1

2 3

pH 9 PER pH 9 PER pH 6 SULF

(18)

de traitement réduite, à un champ électrique donné. Ce résultat est en accord avec le fait qu’une augmentation de la conductivité (diminution de la résistance) se traduit par une augmentation du courant électrique dans la cellule. Par ailleurs, la présence de particules et d’impuretés dans le blanc d’œuf (chalazes, coquilles, protéines dénaturées), qui agissent comme des points de nucléation d’arcs, peut également expliquer la très grande susceptibilité de ce produit aux arcs électriques. Nous avons constaté une formation de filaments protéiques entre les électrodes après quelques minutes de traitement du blanc d’œuf par CEP aux niveaux d’énergie proches de la ligne 50 %, ainsi qu’une formation d’une couche protéique opaque sur l’électrode centrale, alors que l’augmentation de la température du produit ne dépassait pas 3 ˚C (de 15 à 18 ˚C). Compte tenu de l’écoulement laminaire dans la cellule, il est probable que le produit sta- gnant dans les couches limites à la surface des électrodes accumule une quan- tité d’énergie bien supérieure à la moyenne, conduisant à la gélification thermique des protéines du blanc d’œuf. L’ovomucine, qui a une tendance mar- quée à se dénaturer aux interfaces, est très probablement largement impliquée dans ces phénomènes de dénaturation. En effet, l'énergie maximale admissible est de l’ordre de 4 fois supérieure pour du blanc d’œuf démuciné par rapport au blanc d’œuf. Il faut également souligner que lors de la décharge d’une impulsion dans la cellule de traitement, le gradient d’augmentation de la température est considérable (10⁶ à 10⁷˚C.s^-1). Il est possible que localement, la température soit très supérieure à la moyenne, provocant une libération des gaz occlus et de vapeur d’eau sous forme de bulles. La présence de ces bulles, grandissant à la surface des électrodes (dans la couche limite) avant d’être décrochées par le flux du produit, aurait comme conséquence de favoriser la dénaturation de l’ovomucine à l’interface gaz/liquide et la nucléation d’arcs électriques (DE JONG

et VAN HEESCH, 1998).

4.2 Destruction de S. Enteritidis

Les valeurs moyennes de Q_D obtenues pour le blanc d’œuf et la solution modèle sont du même ordre de grandeur (4 à 170 kJ.kg^-1) que celles rapportées par d’autres auteurs pour différentes bactéries (WOUTERS et al., 2001 ; HEINZ et al. 2002, DE JONG et VAN HEESCH 1998). Néanmoins, la destruction de S. Enteriti- dis est très limitée dans le cas du blanc d’œuf par rapport à la solution de sulfate de sodium et de glucose, comme le montre la différence significative de Q_D entre ces deux liquides (respectivement 125 ± 50 et 30 ± 2 kJ.kg^-1). Ces résultats sont en contradiction avec ceux obtenus précédemment avec du blanc d’œuf (JEANTET et al., 1999), et faisant état de destruction allant jusqu’à 3,5 réductions décimales. Ces niveaux de destructions avaient été obtenus en discontinu, sans qu’il soit possible de mesurer la température du milieu après traitement. Par ailleurs, le blanc d’œuf traité lors de cette étude avait été dia ultrafiltré au préala- ble afin d’abaisser sa conductivité, sa teneur en protéines étant inchangée.

Enfin, compte tenu des paramètres de traitement appliqués, l’échauffement ohmique dû au traitement se traduisait par une augmentation de température de l’ordre de 25 ˚C, conduisant à une température finale comprise entre 55 et 60 ˚C.

La destruction obtenue en discontinu correspondrait par conséquent à un effet couplé des CEP et de la chaleur.

Deux hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la moindre destruction de S. Enteritidis dans le blanc d’œuf. En premier lieu, l’insuffisance de l’énergie

(19)

maximale admissible (de l’ordre de 30 à 40 kJ.kg^-1; tableau 1), due à une conduc- tivité électrique trop élevée et à la présence d’éléments particulaires, limite la por- tée du traitement de blanc d’œuf par CEP : nous avons montré en effet que la destruction de S. Enteritidis, quelque soit le produit, était principalement énergie dépendante. D’autre part, pour une même quantité d’énergie délivrée et comprise entre 5 et 20 kJ.kg^-1, le logarithme de la population cultivable est supérieur de 1,25(± 0,37) dans le blanc d’œuf par rapport à la solution de sulfate de sodium et de glucose. On peut donc présumer l’existence d’un effet de protection des bac- téries par les constituants du blanc d'œuf, qui se traduirait par l’existence d’un seuil énergétique de destruction en deçà duquel le traitement de CEP resterait sans effet. L’existence d’un seuil de champ électrique a d’ores et déjà été démon- trée par plusieurs auteurs pour différents produits (SALE et HAMILTON 1967 ; JAYA- RAMet al., 1992 ; CASTRO et al., 1993 ; KNORR et al., 1994 ; ZHANG et al., 1994, 1995 ; GRAHL et MARKL, 1996 ; DE JONG et VAN HEESCH 1998 ; BARSOTTI et CHEF- TEL, 1999). Les résultats obtenus dans cette étude ne permettent pas d’expliquer comment les différents constituants du blanc d’œuf induisent cet effet de protection. Cependant, l’ensemble des ovoproduits testés, à l’exception du perméat dilué additionné de lysozyme, présentent une destruction de S. Enteritidis non significative (< 1 Log) et se comportent donc sur ce plan de manière identique (figure 8). Ainsi, le perméat dilué présente un effet de protection de même niveau que le blanc d’œuf, malgré l’absence de protéines. Dans ce cas, le seuil énergéti- que de destruction peut être déterminé (figure 9) : il est de l’ordre de 40 (± 9) kJ.kg^-1. Compte tenu de ces éléments, le traitement de blanc d’œuf par CEP semble particulièrement défavorable, car l’insuffisance de l'énergie maximale admissible évoquée précédemment ne permet probablement pas d’atteindre le seuil énergétique de destruction de S. Enteritidis dans ce produit.

Les résultats obtenus sur perméat dilué additionné de lysozyme se différen- cient significativement (au seuil p = 0,01) de ce comportement général. Chez les bactéries Gram négatif, comme S. Enteritidis, la liaison cible du lysozyme (liaison N-acétylmuramique – N-acétylglucosamine du petidoglycane des parois) est protégée par les lipopolysaccharides (LPS) de la membrane externe.

Au vu de nos résultats, il est possible que les LPS soient destructurés par le traitement de CEP et que le lysozyme puisse ainsi avoir accès au peptidogly- cane et lyser les cellules. La destruction obtenue correspondrait par consé- quent à un effet couplé du lysozyme et des CEP. Cette hypothèse devra toutefois être confirmée par d’autres expériences.

Enfin, nous avons montré que l’abaissement du pH du perméat dilué de 9 à 6 permet d’accroître la destruction de S. Enteritidis (diminution de Q_D de 106 à 32 kJ.kg^-1 pour les niveaux d’énergie supérieurs à 50 kJ.kg^-1), sans modifier significativement la valeur du seuil énergétique de destruction (figure 10). Une tendance similaire d’augmentation de la destruction microbienne avec la diminution du pH (de 6,8 à 5,7) a déjà été rapportée pour E. coli (VEGA-MERCADO et al. 1996, BARBOSA-CANOVAS et al. 1999). Ces résultats ne peuvent facilement être expliqués du fait de l’absence de travaux portant sur le comportement des membranes cellulaires à pH 9, le blanc d’œuf étant une exception sur ce plan parmi les produits alimentaires. Cependant, il est probable que le pH du produit, au même titre que la température et la force ionique, joue un rôle essentiel sur le potentiel de destruction des CEP, dans la mesure où il conditionne l’état des membranes cellulaires.

(20)

Plus globalement et sur un plan méthodologique, il est probable que certaines bactéries, après le traitement CEP, ne soient pas tuées mais seulement affaiblies. La présence de cellules viables mais non cultivables pourrait être mise en évidence en modifiant la composition du milieu et le temps d’incubation, ou par des mesures directes au microscope à epifluorescence par exemple. Nous ne pouvons pas non plus exclure une possibilité d’agrégation cellulaire pendant le traitement CEP qui réduirait le nombre d’unités formant colonies. Dans cette étude préliminaire, nous avons testé qu’un nombre de combinaisons limité du champ électrique, de la durée d’impulsion, de la fré- quence et de la température initiale du produit. Il est possible que dans des conditions expérimentales données, le rapport entre les cellules tuées, affaiblies et/ou agrégées puisse être différent. Ceci mérite une étude approfondie en utili- sant d’autres méthodes d’évaluation d’efficacité pasteurisatrice du procédé de CEP.

En conclusion, les CEP n’offrent donc pas la possibilité de décontaminer les ovoproduits de manière satisfaisante, et ne peuvent constituer à eux seuls une alternative aux traitements thermiques. Il semble par contre, au vu des résultats présentés dans cette étude et par comparaison avec des travaux antérieurs, que des synergies existent entre ces deux traitements en termes de décontami- nation. Si ce point était vérifié, la combinaison de CEP et de traitements thermiques modérés (HTST) pourrait constituer une solution intéressante au problème de maîtrise de la qualité hygiénique des ovoproduits.

5 – REMERCIEMENTS

Cette étude fait partie d’un programme Aliment Qualité Sécurité subven- tionné par le Ministère de l’Éducation Nationale, de la Recherche et de la Tech- nologie (décision d’aide n˚ 99P0631). Les auteurs remercient EDF pour le soutien financier apporté à ce programme, et Marie-Françoise Cochet du département agroalimentaire de l’Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Rennes pour son concours technique.

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