THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR
DE MONTPELLIER SUPAGRO
En Sciences agronomique et écologie
École doctorale GAIA – Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau
Portée par l’Université de Montpellier
Unité de recherche AGAP
Présentée par Delphine MIEULET
Le 27 novembre 2017
Sous la direction de Emmanuel GUIDERDONI
Devant le jury composé de
Anne-Marie CHEVRE, DR2, IGEPP INRA -Rennes
Mathilde GRELON, DR2, IJPB INRA-Versailles
Wyatt PAUL, Chercheur, Biogemma-Clermont
Pierre SOURDILLE, DR2, GEDEC INRA-CLermont
Jacques DAVID, Enseignant-chercheur, AGAP-Montpellier
Raphaël MERCIER, DR1, IJPB INRA-Versailles
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Président du jury
Invité
Manipulation de la recombinaison chez une plante
cultivée, le riz.
Remerciements
Avant toute chose, je tiens à remercier les membres du jury qui ont accepté d'évaluer mon travail et de se déplacer jusqu'à Montpellier pour quelques heures. Merci donc aux rapporteurs Anne-Marie Chèvre et Mathilde Grelon et aux examinateurs Wyatt Paul, Pierre Sourdille et Jacques David. Je voudrais également remercier, l'invité de ce jury, Raphaël Mercier, qui m'accompagne sur ce sujet depuis le début et sans lequel il n'y aurait pas eu cette thèse sur la méiose. Je dois également te remercier Raph pour tout le soutien que tu m'as apporté, les coups de fils et les 10 000 mails qui encombrent ta boîte et auxquels tu réponds à vitesse grand V.
Je souhaite évidemment remercier mon chef de toujours, Emmanuel Guiderdoni, qui m'a fait confiance une première fois en 2008 lors de mon recrutement au CIRAD puis, qui a accepté d'être mon directeur de thèse en 2015. Merci aussi à ma direction d'avoir aménagé mon poste de travail afin de me laisser 3 ans pour vivre cette aventure. Avec Manu : Mr Riz, et Raph : Mr Méiose, j'étais super bien partie pour faire de belles choses sur la méiose du Riz. Mille mercis Manu de m'avoir épaulé jusqu'au bout et pour la vision de malade que tu as du sujet. Il me manquait tout de même le petit grain de sel de Brigitte Courtois, ma collègue de bureau et de surcroit sélectionneuse et généticienne. Brigitte m'a appris tout ce que je devais savoir sur la génomique et donné de bons conseils pour conduire ce travail. Merci Bibi aussi pour ton soutien de tous les jours et la relecture du manuscrit.
Merci aussi à Christophe Perin de m'avoir accueilli dans son équipe pour faire ma thèse, ainsi qu'à tous les membres de l'équipe DAR et aux nombreux CDD et thésards que j'ai croisé dans les labos. Merci également à l'équipe de Raphaël qui m'a accueilli plusieurs fois à Versailles et tout appris de la cyto. Merci aussi aux bioinformaticiens de m'avoir aidée à analyser deux trois trucs en un tour de main. Merci surtout aux personnels des plateaux d'Agap, qui chacun à leur tour m'ont guidé. Merci enfin aux serristes sans qui il n'y aurait pas de matériel.
Je voulais aussi remercier tous les chercheurs qui m'ont aidée à financer ce travail, Manu, Christophe, Brigitte, Raph, Nour, Robert, Vincent, Jef ...
Au-delà de l'équipe et de la science, je tiens à remercier tous mes collègues du CIRAD qui m'ont encouragé et surtout mes voisins de bureau qui m'ont fait le café ces derniers temps.
Cette thèse c'est une super aventure ! C'est scientifiquement ce que je voulais faire. C'est psychologiquement ce que je voulais vivre. C'est physiquement aussi dur qu'un marathon mais qu'est-ce que c'est bon quand ça se termine !
Je tiens tout particulièrement à remercier mes sponsors :
ü Mes Amis qui m'amènent régulièrement prendre l'air en montagne ; ü Mes parents qui ont toujours cru en moi ;
ü Mon petit frère qui sait rester discret mais qui m'a bien remis d'aplomb ; ü Et merci à mon beauf et ma belle d'être là dans "la famiglia" ;
Table des matières
Table des figures ...
1
Table des annexes ...
3
Abréviations et nom de gènes ...
4
Contexte et objectifs des travaux de thèse ...
8
PARTIE I : Synthèse bibliographique ... 12
1. Le riz, une céréale essentielle ... 141.1.
Importance alimentaire ... 14
1.2.
Les systèmes de culture rizicoles ... 16
1.3.
La diversité et domestication ... 18
1.3.1.
Structuration du genre Oryza ... 18
1.3.2.
Domestication d'Oryza sativa ... 18
1.3.3.
Diversité d'Oryza sativa ... 19
1.4.
Sélection du riz ... 21
1.4.1.
Méthodes de sélection et apport des biotechnologies et de la génomique ...21
1.4.2.
Hétérosis et hybrides F1 ... 23
1.5.
Ressources et outils disponibles pour l'amélioration variétale ... 24
1.5.1.
Diversité naturelle et induite ... 24
1.5.1.1.
Des milliers de variétés de riz ... 26
1.5.1.2.
La diversité induite : aléatoire ou ciblée ... 26
1.5.2.
Matériel à haute résolution génétique ... 27
1.5.3.
Ressources génomiques et bio-informatiques ... 27
1.5.4.
Les outils d’ingénierie cellulaire et d’édition des génomes ... 28
1.6.
Biologie du riz ... 30
1.6.1.
Phase végétative ... 30
1.6.2.
Phase reproductive ...32
2. Reproduction sexuée et apomixie ... 34
2.1.
La reproduction sexuée et la double fécondation ... 34
2.1.1.
La gamétogenèse mâle et femelle dans la jeune fleur ... 34
2.1.2.
La double fécondation et la formation de grain ... 37
2.2.
La reproduction asexuée clonale par grain : l'apomixie ... 39
2.2.1.
Les différents types d'apomixie ... 39
2.2.1.1.
Apomixie sporophytique ... 39
2.2.1.2.
Apomixie gamétophytique ... 39
2.2.2.
Le contrôle génétique et épigénétique de l'apomixie ... 40
3. Méiose et recombinaison ... 44 3.1.
Déroulement de la méiose ... 46
3.1.1.
La prophase I de méiose, le siège de la recombinaison ... 46
3.1.1.1.
Leptotène : Mise en place des axes chromosomiques ... 48
3.1.1.2.
Recherche des homologues via la formation du bouquet ... 50
3.1.1.3.
Zygotène : Mise en place du complexe synaptonémal ... 51
3.1.1.4.
Pachytène : description et rôle du chiasma ou CO ... 52
3.1.2.
Progression de la méiose et formation des gamètes ... 53
3.2.
Les mécanismes moléculaires de la recombinaison méiotique ... 54
3.2.1.
Formation de la cassure double-brin de l’ADN : l'initiation ... 54
3.2.2.
Localisation et modèle de formation des cassures double-brin ... 58
3.2.3.
Maturation des cassures doubles-brins ... 58
3.2.4.
L'invasion par le simple-brin et la formation d’intermédiaires ... 60
3.2.5.
Les voies de réparation des CDB ... 62
3.2.5.1.
La voie ZMM de formation des COs ... 63
3.2.5.2.
La voie MUS81 de formation des COs ... 64
3.2.5.3.
Les voies de formation des Non Crossing-Overs (NCO) ... 65
3.2.6.
Les voies de régulation des COs : les gènes anti-COs ... 66
3.2.6.1.
L'hélicase FANCM ... 66
3.2.6.2.
L'AAA-ATPase FIGETIN-LIKE1 ... 67
3.2.6.3.
L'hélicase RECQ ... 67
3.3.
Comment détecter les événements de recombinaison ? ... 70
3.3.1.
Techniques de cytogénétique ... 70 3.3.2.
Par établissement de carte génétique dans une descendance ... 70
3.3.3.
Calcul de la fréquence de recombinaison ... 71
3.3.4.
Déséquilibre de liaison et CO ... 73
3.4.
Distribution des évènements de recombinaison ... 75
3.4.1.
Nature et distribution des événements de recombinaison ... 75
3.4.1.1.
Les phénomènes qui régulent le nombre de CO ... 75
3.4.1.2.
Nombre moyen de CO par chromosomes selon les espèces ... 77
3.4.1.3.
Structure du génome et distribution des COs ... 77
Partie II : Abolir la recombinaison ...
83 4. L'apoméiose chez le riz ... . 83 4.1.Introduction ... 83
4.2.
Article : "Turning rice meiosis into mitosis" ... 87
4.3.
Discussion et perspectives ...100
PARTIE III : Augmenter la recombinaison ...
1065. Augmenter le taux de recombinaison chez le riz en utilisant les protéines anti-CO FANCM et RECQl4 ...108 5.1.
Introduction ...108
5.2.
Matériel et Méthodes ...112
5.2.1.
Phylogénie : Recherche d'orthologues ...112
5.2.2.
Matériel génétique ...112
5.2.2.1.
Recherche de mutants d'insertion et génotypage ...112
5.2.2.2.
Caractérisation moléculaire des mutants ADN-T ...113
5.2.2.3.
Développement de populations F2 pour l'étude des gènes anti-CO ...113
5.2.3.
Caractérisation phénotypique des F1 ...116 5.2.3.1.
Méiose mâle : cytogénétique ...116 5.2.3.2.
Fertilité paniculaire (que le simple REC sur F1) ... 117 5.2.4.
Génotypage SNP ... 117 5.2.5.
Construction des cartes génétiques ... 121
5.2.6.
Condition de culture et de croisement de plantes ... 121
5.3.
Résultats ... 124
5.3.1.
Recherche des homologues de AtFANCM et AtRECQA/B chez le riz ... 124 5.3.2.
Identification de mutant perte de fonction ... 124
5.3.2.1.
Détermination de KO dans le gène Os11g07870 (OsFANCM) ... 124
5.3.2.2.
Détermination de KO dans le gène Os04g35420 (OsRECQl4) ... 126 5.3.3.
Cumul des mutations par croisement ... 126
5.3.3.1.
Obtention de population F2 simple mutant RECQ4 ... 126
5.3.3.2.
Obtention de populations F2 simples mutants FANCM ... 127
5.3.3.3.
Obtention de populations F2 double mutants FANCMxRECQ4 ... 127 5.3.4.
Caractérisation phénotypique des hybrides F1 ... 129
5.3.5.
Cartographie des événements de recombinaison ... 129
5.3.5.1.
Dans une population F2 "simple RECQl4" ... 129
5.3.5.2.
Dans une population F2 "simple FANCM" ... 136
5.4.
Discussion et perspectives ...137
PARTIE IV : Inactivation de gènes anti-COs par CRISPR/cas9 ...
.
1456. Introduction ... . .145 7. Création de lignées perte de fonction par CRISPR/Cas9 ...146 7.1.
Matériel et méthodes ...146
7.2.
Résultats et discussion ...150
8. Transformation d'hybrides F1 ... . 151
Discussion générale ...
153
Bibliographie ...
.
159 Annexes...
...
172Table des figures
Figure 1 : Culture et consommation de riz dans le monde. Figure 2 : Diversité des écosystèmes rizicoles.
Figure 3 : Diversité du Genre Oryza (d’après d’après Zhang & Wing, 2013).
Figure 4 : Classification de 3 000 accessions de riz en 2 sous-espèces et 5 groupes variétaux (adaptation de Li et al. 2014).
Figure 5 : Hérédité de la stérilité mâle à contrôle géno-cytoplasmique. Figure 6 : Stades de développement du riz (d’après l’IRRI).
Figure 7 : Panicule de riz et épillet (d’après CGIAR 2013).
Figure 8 : Développement de la fleur de riz au moment de l’anthèse (d’après Hoshikaw, 1989).
Figure 9 : Gamétogenèse mâle, formation du grain de pollen chez le riz (d’après Hoshikaw, 1989).
Figure 10 : Gamétogenèse femelle, formation du sac embryonnaire chez le riz (d’après Hoshikaw, 1989).
Figure 11 : La double fécondation chez le riz (d’après Hoshikaw, 1989).
Figure 12 : Mécanismes de développement de semences par voie sexuée ou apomictique (Hand et al. 2014).
Figure 13 : Déroulement de la méiose (Mercier et al. 2015).
Figure 14 : Rôle de la cohésine REC8 dans la ségrégation correcte des chromosomes homologues en M1 puis des chromatides-sœurs en MII (Sakuno et Wanatabe 2009).
Figure 15 : Prophase I de méiose et mise en place de l’axe chromosomique (adaptation de Lambing et al. 2017).
Figure 16 : Le bouquet, une organisation caractéristique de la méiose (Zickler and Kleckner, 2015).
Figure 17 : Modèle présentant les mécanismes de la recombinaison méiotique (d'après Mercier et al. 2015).
Figure 18 : Rôle de Spp1 dans la formation des CDBs chez la levure (Sommermeyer et al. 2013).
Figure 19 : Formation et maturation des cassures double-brin de l’ADN (d’après Neale et al. 2005).
Figure 20 : Chargement des recombinases et invasion de la molécule homologue (d’après Neale et al. 2005).
Figure 21 : Représentation schématique du déséquilibre (a) et (b) de l’équilibre de liaison entre deux locus (Flint-Garcia et al., 2003 ; Guo et al., 2014).
Figure 23 : L’interférence pendant la recombinaison méiotique (Ziolkowski & Handerson 2017). Figure 24 : Nombre moyen de Crossing-Overs (COs) par chromosome et par méiose chez
différentes espèces eucaryotes et chez le mutant Atrecq4 figl1 (Mercier et al., 2015).
Figure 25 : La structure du génome et la distribution des COs diffère entre A. thaliana, le riz et le maïs (Lambing et al. 2017).
Figure 26 : Connection des chromosomes en méiose et attachement des kinétochores (Talbert 2010).
Figure 27 : Les voies de formation des COs et les protéines anti-CO impliquées (Mercier et al. 2015).
Figure 28 : Compaction de la chromatine et premières données de recombinaisons chez le riz (d'après Cheng et al. 2001 et Wu et al. 2003).
Figure 29 : Schéma de croisement pour l’étude d’un simple mutant anti-CO. Figure 30 : Schéma de croisement pour l’étude d’un double mutant anti-CO. Figure 31 : Position des marqueurs Kasp® sur les chromosomes 1 à 6 du riz. Figure 32 : Position des marqueurs Kasp® sur les chromosomes 7 à 12 du riz.
Figure 33 : Conservation des domaines protéiques entre A. thaliana et Oryza sativa pour FANCM et RECQl4 (Expasy).
Figure 34 : Position des mutations dans les gènes.
Figure 35 : Lignées utilisées dans les croisements en vue de l’obtention des simples et doubles mutants.
Figure 36 : Fertilité paniculaire des hybrides F1 Osreql4 --/-- et des sauvages. Figure 37 : Méiose mâle chez Osrecql4 --/-- (DAPI).
Figure 38 : Cartes génétiques chez le sauvage et le mutant Osrecql4 --/--.
Figure 39 : Distribution des COs sur les 12 chromosomes du riz chez les plantes F2 de Osrecql4 --/-- et OsRECQl4 ++/++.
Figure 40 : Observation de la recombinaison sur différents intervalles en fonction de la position physique de ces intervalles sur le chromosome.
Figure 41 : Distribution des COs sur 5 chromosomes de plantes F2 de Osfancm --/--. Figure 42 : Densité en gènes, en éléments transposables et en SNP sur les 12
chromosomes du riz.
Figure 43 : Relation entre la densité en SNP et la fréquence de recombinaison chez Osrecql4 --/--.
Figure 44 : Stratégie de clonage d’un sgRNA dans le vecteur d’expression pC5300-Cas9. Figure 45 : Analyse des plantes éditées par CRISPR/cas9.
Table des annexes
Annexe 1 : Liste des mutants identifiés dans les gènes FANCM et RECQl4. Annexe 2 : Liste des amorces utilisées pour la Q-RT-PCR.
Annexe 3 : Données d’expression (RiceXPro3.0) pour OsRECQl4 (Os04g35420), et OsFANCM (Os11g07870).
Annexe 4 : Cartes génétiques du sauvage et du mutant Osrecql4 --/--.
Annexe 5 : Position des 92 marqueurs utilisés pour génotyper la descendance F1 Osfancm --/-- et Osfancm ++/++.
Annexe 6 : Densité en gènes et en éléments transposables (TE).
Annexe 7 : Amorces correspondant aux crRNA et nom des construits CRISPR/Cas9 réalisées pour produire des plantes ciblant les gènes anti-CO.
Abréviations et nom de gènes
AGO : Argonaute
ASGR : Apospory Specific Dominant Region At : Arabidopsis thaliana
BBM : Baby Boom
BBMH : Best Blast Mutual Hits BBML : Baby Boom Like BP : Backbone Primer
CDB : Cassures double-brin (ou DSB Double-strand-break) CE : Central element
CENH3 : Centromeric Histone 3 Chr. : chromosome
cM : centiMorgans
CMM : cellule mère de la mégaspore CO : Crossing-Over
CRC1 : Central Region Component1
CRISPR : Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées)
CS : Complexe Synaptonémal D-loop : Displacement loop structure DEXDc : DEAD-like helicases superfamily DJ : Dongjin
djH : double jonction de Holliday DL : déséquilibre de liaison
DMC1 : Disrupted Meiotic cDNA 1 DMC1 : Disrupted Meiotic cDNA1
DSBR : Double-strand break repair (réparation des cassures double-brin) EA = Elément Axial
EC : Element Central FA : voie Fanconi Anemia
FANCM : Fanconi Anemia Complementation groupM FIE : Fertilization Independent Endosperm
FLIP : Fidgetin-like-1 Interacting Protein GC : gène cible
GEM : Genome Elimantion Induced HAP : Haploid initiation
HDR : Homology-Directed Repair He : Hétérozygote
HEI10 : Human Enhancer of Invasion-10 Ho : Homozygote
HRDC : Homologous region RNase D C-terminal Hv : Hordeum vulgare
HW : Hwayoung Jas : Jason KO : Knock Out LP : Left Primer
M1 : Première division de Méiose M2 : Seconde division de Méiose
MEICA 1 : Meiotic Chromosome Association 1 MEL1 : Meiosis arrested at Leptotene 1
MiMe : Meiosis Instead of Meiosis MSI1 : Multicopy of Suppressor of IRA1 MTL : Matrilineal
NB : Nipponbare
NCO : Non Crossing-Over
NGS : Next-Generation Sequencing
NHEJ : Non-Homologous End Joining, (jonction d'extrémité non-homologues) NLD : Not Like Dad (or Matrilineal)
Os : Oryza sativa
OSD1 : Omisson of Second Division 1 PAIR1 : Pairing Aberration in Rice meiosis1 PRC2 : Polycomb Repressive Complex 2 PRD : Putative Recombination Initiation Defect PRD2 : Putative Recombination initiation Defect2 Ps : Pennisetum squamulatum
PS1 : Parallele-Spindel 1 QTL : Quantitative Trait Loci
RAD51 : RADiation-sensitive 51
REC8 : "Meiotic recombination and sister chromatid cohesion" RECQl4 : RecQ like protein 4
RH : Recombinaison Homologue (Homologous Recombination (HR) RMI1: RecQ-mediated genome instability 1
RP : Right Primer RQC : RecQ C-terminal SC : Synaptonemal Complex SD : standard deviation (Ecart type)
SDSA : Synthesis-Dependent Strand Annealing SEC : Second End Capture"
SEI : Single End Invasion
SNP : Single Nucleotide Polymorphism SPO11 : Sporulation11
SWI1/DYAD : Switch1 (or DYAD) T0 : transformant primaire
TAM : Tardy Aynchronous Meiosis TDM1 : Three-Division Mutant 1 TE : Eléments transposables
Tos17 : Transposon of Oryza Sativa 17 UVI4 : UV-B-insensitive 4
WT : wild-type Z11 : Zhonghua 11 Zm : Zea mays
Contexte et objectifs des travaux de thèse
La recombinaison génétique contribue à la diversité des espèces. Le brassage génétique a lieu lors de la reproduction sexuée. Depuis la domestication des plantes, les cultivateurs puis les sélectionneurs ont exploité ce brassage génétique naturel pour sélectionner les meilleures combinaisons d’allèles et améliorer la qualité et la productivité des espèces cultivées.
La méiose est un mécanisme très conservé chez les eucaryotes. Depuis ces 15 dernières années, les scientifiques ont acquis de nombreuses connaissances sur les mécanismes moléculaires de la méiose chez les plantes (Luo et al. 2014; Mercier et al. 2015). Début 2014, 28 gènes impliqués dans la méiose du riz avaient été caractérisés. Aujourd’hui, la fonction de plus de 44 gènes a été publiée. Ces connaissances moléculaires permettent à présent une manipulation de la recombinaison méiotique. Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, les travaux de l'équipe de R. Mercier de l'institut Jean-Pierre Bourgin (UMR1318 INRA-AgroParisTech) ont montré qu'en abolissant la fonction de certains de ces gènes, il était possible d’obtenir des gamètes non réduits possédant le génotype de la plante mère puis, via l’induction d’une parthénogenèse, de réaliser une apomixie artificielle (D’Erfurth et al. 2009; Marimuthu et al. 2011). A l'inverse, ces travaux ont également permis d’augmenter considérablement la recombinaison en augmentant le nombre de crossing-overs (CO) par méiose d'un facteur 3 à 10 (Crismani et al. 2012; Fernandes et al. 2017b).
Pour l'amélioration des plantes cultivées et notamment du riz, ces deux voies de manipulation de la recombinaison sont intéressantes. En effet, abolir la recombinaison permettrait de fixer les variétés hybrides F1, très productives à cause de l'hétérosis, mais dont le coût de production des semences est élevé, et l'achat inaccessible aux paysans du Sud. Manipuler les gènes qui augmentent le brassage génétique, permettrait d'aider les sélectionneurs dans la première phase de leur travail qui consiste à générer de la diversité en favorisant la création de nouvelles combinaisons d’allèles.
L'une des thématiques de l'équipe Développement Adaptatif du Riz (DAR, CIRAD, Montpellier), dans laquelle je travaille depuis 2004, est la manipulation de la recombinaison et le ciblage génique. En 2009, R. Mercier, recherchant des collaborateurs pour reproduire le phénotype MiMe d'A. thaliana chez une plante d'intérêt agronomique, a contacté l’équipe pour travailler sur le riz. L'ANR a accepté de financer ce projet intitulé DiplOSD (Diploid gametes via the inhibition of the OSD1 gene or its orthologs) pour 18 mois et E. Guiderdoni m'a confié la partie Riz du projet. C'est dans le cadre de cette collaboration entre l'IJPB et l'équipe DAR qu'en 2014, la direction de l’Unité AGAP m'a autorisée à mettre entre parenthèses mon rôle de "responsable de plateforme" pour faire une thèse sous la direction d'E. Guiderdoni et avec le soutien de R. Mercier.
Cette thèse intitulée "Manipulation de la recombinaison méiotique chez une plante cultivée, le riz" vise à étudier la conservation de certains mécanismes qui régulent la méiose chez A. thaliana.
La première partie de cette thèse vise à abolir la recombinaison pour permettre la reproduction clonale par grains (apomixie) afin de fixer l'hétérosis des hybrides F1 cultivés. L'apoméiose est la première des deux composantes de l'apomixie. Elle permet d'obtenir des gamètes non réduits identiques à la plante mère. Ce phénotype a été obtenu en cumulant trois mutations chez A. thaliana et a été appelé MiMe pour "Mitosis Instead of Meiosis" (D’Erfurth et al. 2009). La seconde composante de l'apomixie est la parthénogenèse c'est à dire le développement autonome de l'embryon et de l'albumen. Le croisement d'une lignée MiMe avec une lignée capable de déclencher la parthénogenèse, comme la lignée GEN (Genome elimination induced), a permis de produire des grains apomictiques chez A. thaliana (Marimuthu et al. 2011). Le premier objectif de ma thèse est donc de reproduire le phénotype MiMe chez le riz (projet DiplOSD) et ensuite d'étudier les possibilités de déclenchement de la parthénogenèse. Cette étude a fait l'objet d'une publication dans Cell Research en 2016 et est détaillée dans la partie II de ce manuscrit.
S'appuyant toujours sur les travaux conduits à l'IJPB, la seconde partie de ma thèse vise à augmenter globalement la fréquence de recombinaison chez le riz. En effet, chez le riz comme chez 80% des eucaryotes, le nombre de CO est faible (1 à 3) et non homogène le long des chromosomes (Mercier et al. 2015). On observe des régions chaudes et des régions froides de recombinaison ce qui rend très compliqué l'introgression de gènes d'intérêt dans certaines régions froides du génome, en particulier les régions péri-centromériques. Dans le cas de croisement entre deux accessions distantes génétiquement, il est parfois difficile d'obtenir des recombinants à cause du manque d'homologie entre les séquences. Le "linkage drag" dû à ce faible taux de recombinaison est un inconvénient pour les sélectionneurs. Parvenir à casser ces blocs, représente un grand intérêt pour l’amélioration des plantes. Des cribles suppresseurs réalisés chez A. thaliana dans une population de mutants constituée dans un fond génétique zmm ont permis d'identifier des premiers gènes anti-CO (De Muyt et al. 2009), tels que AtFANCM en 2012 puis AtRECQ4 et FIGL1 en 2015 (Crismani et al. 2012; Séguéla-Arnaud et al. 2015). L'inactivation d'un ou plusieurs gènes anti-CO permet d'augmenter jusqu'à 780% le nombre de COs en contexte hybride chez le double mutant Atfigl1 -/- AtrecqA/B -/- par rapport au sauvage (Fernandes et al. 2017b). Tirant avantage de ces découvertes récentes, la seconde partie de cette thèse consiste à évaluer comment l'inactivation des orthologues des gènes anti-CO identifiés chez A. thaliana, peut affecter la fréquence globale et la distribution des COs chez le riz. Le travail vise à caractériser des mutants d’insertion dans ces trois gènes, puis à produire des hybrides F1 bi-alléliques mutants dans un fond génétique polymorphe, afin de permettre la cartographie à l’échelle du génome entier des évènements de recombinaison. L'étude de la distribution des COs dans la descendance des mutants F1
Osrecql4 -/- et Osfancm -/- fait actuellement l'objet de la rédaction d'un article. Les résultats obtenus sur le riz seront associés à ceux obtenus par des collaborateurs de R. Mercier sur le pois (INRA Dijon) et la tomate (INRA Bordeaux) pour une soumission à Nature Communications en fin d'année. Les résultats obtenus sur le riz sont décrits dans la partie III de ce manuscrit. Par ailleurs, nous avons aussi utilisé la technologie CRISPR/Cas9 pour produire de nouveaux allèles mutants. Cette partie du travail est décrite dans la partie résultats complémentaires (Partie IV).
Figure 1 : Culture et consommation de riz dans le monde. A- Lieux de production. Surfaces cultivées et nombre de cultures par an en fonction des régions (Laborte et al. 2017). B- Calories apportées par le riz en fonction des pays (Ahmadi 2017)
A
B
PARTIE I : Synthèse bibliographique
1.
L
E RIZ
,
UNE CEREALE ESSENTIELLE
1.1. Importance alimentaire
Le riz, le blé et le maïs, qui sont les 3 principales cultures vivrières du monde, fournissent plus de 42% des calories consommées par la population humaine. En termes de superficie, le blé avec 225 millions d'hectares représente la première céréale suivie par le maïs et le riz qui couvrent chacun 160 millions d’hectares. Le riz est cultivé sur 11% des terres arables de la planète et 90% de ces surfaces se trouvent en Asie du Sud et du Sud-Est (http://www.fao.org/faosta). Il est cultivé par plus de 144 millions de paysans dans plus d’une centaine de pays (Laborte et al. 2017) (Figure 1).
Au niveau de la production, le riz est la troisième céréale derrière le maïs et le blé (1 054 millions de tonnes pour le maïs, 740 millions de tonnes pour le blé et 504 Mt de riz blanchi en 2017 (FAOstat). Le riz est la première céréale de consommation humaine (IRRI 2017). 90% du riz est produit et consommé en Asie où il représente entre 35% et 75% des apports caloriques pour plus de 3 milliards d’habitants (Zhang and Wing 2013). En Afrique et en Amérique Latine, où 19 et 25 millions de tonnes sont produites respectivement, le riz devient de plus en plus important puisqu’il représente un tiers des apports caloriques pour 1,5 milliards de personnes (Khush 2005). Il reste l’aliment de base des plus démunis et la consommation annuelle mondiale par habitant demeure stable à 54,1 kg/an (IRRI 2017).
La Chine et l’Inde sont de loin les plus gros producteurs de riz, suivis par l’Indonésie et le Bangladesh, le Vietnam, la Birmanie et la Thaïlande (ricepedia.org). Ces 7 pays représentent à eux seul 80% de la production mondiale et sont également les principaux consommateurs. Le riz est une production d’autoconsommation, la majorité du riz étant produite dans de petites exploitations familiales de 0,5 à 3 ha maximum (CGIAR 2013) ; de ce fait seuls 6% de la production sont exportés. Les principaux exportateurs de riz sont l’Inde, la Thaïlande, le Vietnam, le Pakistan et les États-Unis (IRRI 2017). Le rendement varie de 1t/ha à plus de 10 t/ha dans les conditions optimales de culture. Le rendement moyen mondial est de 4,3 tonnes par hectare (IRRI 2017). Ce rendement moyen a plus que doublé en 50 ans permettant de ne pas convertir en zones rizicoles près de 230 millions d’hectares (IRRI 2017).
Les Nations Unies prévoient que la population mondiale devrait atteindre 9,7 milliards en 2050 (United Nations 2015). Pour satisfaire les besoins de cette population grandissante, il sera donc nécessaire d’augmenter la production de riz de plus de 42% d’ici à 2050 (production de
Pluviale
Inondée
Irriguée Eau profonde
Total (ha)
Afrique (%)
38
34
20
8
9,1
Amérique latine (%)
45
55
6,6
Asie (%)
9
28
57
6
136
USA, UE, Aust. (%)
100
4
Total (%)
10
30
55
5
100
Superficies (Mha)
16
48
86
7
157
Rendement (t/ha)
1 à 5
1 à 5
3 à 10
1 à 3
4,2
Figure 2 : Diversité des écosystèmes rizicoles. Les quatre grands types de riziculture en fonction de la gestion de l’eau : pluviale, inondée, irriguée, et flottante (illustrations d’Ahmadi, 2017). Le tableau présente les superficies occupées par chaque type de riziculture et les rendements attendus (FA0 2005).référence année 2008) (Ray et al. 2013). Avec plus de quatre milliards de personnes dans le monde qui se nourrissent de riz chaque jour, le riz est donc un élément essentiel à la sécurité alimentaire et la stabilité politique mondiales (World Rice Statistics, IRRI).
L’enjeu est donc considérable pour les sélectionneurs puisque d’ici 2030 il faudra être capable d’augmenter la production globale de riz de 25% pour supporter la demande croissante (Li et al. 2014). Cette augmentation devra se faire sur des terres arables non extensibles voire en réduction du fait de l’urbanisation ou de la compétition avec d’autres cultures, dans un contexte de raréfaction des ressources (eau, engrais issus de ressources fossiles comme l’azote ou de roches comme le phosphate) et d’instabilité climatique (amenant des extrêmes de température, submersion et salinisation des sols et sécheresse). D’autre part, le riz contribue au réchauffement climatique par la libération de méthane par les rizières. Le riz devra donc devenir "climate proof" et "climate smart" en réduisant son impact sur l’environnement et en tolérant des variations climatiques.
1.2. Les systèmes de culture rizicoles
Deux espèces de riz sont cultivées : une d’origine Asiatique (Oryza sativa) de distribution mondiale et une seconde d’origine Africaine (Oryza glaberrima) dont la diffusion est limitée à l’Afrique de l’Ouest. Le riz est une plante annuelle semi aquatique assez exigeante en eau. On estime qu'il faut 4 000 litres d'eau pour produire un Kg de riz contre 1 500 L pour le maïs et 700 L pour le sorgho. Cependant le riz fait preuve d'une grande plasticité vis à vis de ses besoins en eau. La classification des systèmes de riziculture est d’ailleurs fondée sur le type d’alimentation hydrique.
On distingue quatre grands types de riziculture en fonction de la gestion de l’eau dans les cultures (Courtois 1988) : irriguée, inondée, pluviale et flottante. Cette diversité permet de cultiver le riz dans des milieux très variés couvrant une large gamme d’altitudes et de latitudes (Figure 2). La riziculture irriguée, suppose une maitrise des flux d’eau entrant en sortant. Elle occupe 55 % des surfaces cultivées et représente 75% de la production mondiale. La riziculture inondée est un mode de culture où l’irrigation n’est pas totalement maîtrisée. Elle concerne 30 % des surfaces rizicoles avec des rendements variables du fait de risques importants de submersion et/ou de sécheresse. La riziculture pluviale dont l'alimentation hydrique dépend uniquement de la pluviométrie (riziculture pluviale stricte) ou de la présence d'une nappe éventuelle (riziculture de nappe) représente 10% des surfaces (la majeure partie en Afrique et en Amérique Latine). Enfin, la riziculture flottante, qui suit la crue des grands fleuves, n’occupe que 5 % des surfaces. Les rendements s'améliorent avec la maîtrise de l'eau mais les coûts d'aménagement des rizières augmentent en parallèle (Figure 2). La riziculture irriguée permet une intensification de la culture (jusqu’à 3 cycles de culture par an) et une diminution appréciable des aléas hydrologiques garantissant des rendements élevés (3 t/ha
Figure 3 : Diversité du Genre Oryza (d’après d’après Zhang & Wing, 2013). A- Arbre phylogénétique du genre Oryza.
B- Plantes de 12 espèces représentatives du genre Oryza.
A
en saison des pluies et jusqu'à 10 t/ha en saison sèche). Les variétés très productives et les riz hybrides F1 sont privilégiés dans ce contexte. La culture pluviale, en revanche, ne demande aucun aménagement particulier mais comporte plus de risques, notamment de sécheresse. Il ne peut y avoir qu’un seul cycle de culture et les rendements sont plus faibles et plus variables (de 1 à 5 t/ha) (Figure 2). Afin de pouvoir économiser l’eau dans les systèmes avec maîtrise de l’eau, des itinéraires techniques d’inondation et d’assecs successifs (alternate water and drying system) ou totalement aérobies sont en cours de développement. Les variétés utilisées dans ces nouveaux contextes devront faire preuve d’une plasticité morphologique et physiologique comme par exemple un système racinaire réactif allant capturer l'eau et les nutriments en profondeur dans un sol.
1.3. La diversité et domestication
1.3.1. Structuration du genre Oryza
Le genre Oryza est apparu il y a environ 14 millions d’années (CGIAR 2013). Outre les 2 espèces cultivées O. sativa et O. glaberrima, le genre Oryza comprend 25 espèces sauvages connues à ce jour (CGIAR 2013).La plupart de ces espèces ont été classées en 4 complexes en fonction de leur facilité de croisement permettant de transférer des gènes entre espèces sauvages et espèces cultivées et des observations cytologiques (appariement des chromosomes homéologues chez l’hybride). Mais deux espèces, trop distantes des autres, ont été classées dans une section propre : O. australiensis (génome EE) et O. brachyantha (génome FF) (Figure 3).
Le complexe O. sativa compte les 2 espèces cultivées et 6 espèces sauvages qui ont toutes le génome A d’O. sativa (2n = 24). Ces espèces sont diploïdes compatibles entre elles et leurs chromosomes montrent un appariement normal des homologues en situation hybride. A l’intérieur de ce complexe O. sativa, les croisements entre espèces sont possibles bien que qu'il soit nécessaire dans certain cas de faire du sauvetage d'embryon (exemple de croisement O. sativa x O. longistaminata). Les hybrides présentent des niveaux très variables de fertilité. L’ensemble des espèces sauvages constitue un vaste réservoir de gènes, pour la résistance aux stress biotiques et aux contraintes abiotiques, et l’amélioration des variétés de riz de manière plus générale.
1.3.2. Domestication d'Oryza sativa
Les traces de la culture d'Oryza sativa sont très anciennes et sa domestication remonte à environ 10 000 ans avant J-C. Bien que de nouvelles données génétiques et archéologiques soient disponibles (Gross and Zhao 2014), le processus de domestication de l’espèce Oryza sativa n’est toujours pas clair. La première hypothèse est qu'O. sativa aurait été domestiquée
deux fois de manière indépendante au sud de la Chine dans la vallée du fleuve Yangtsé et au nord-est de l’Inde dans l’Uttar Pradesh à partir de formes annuelles de l'espèce O. rufipogon 8 000 et 5 000 ans avant J-C respectivement. Ces deux domestications indépendantes auraient donné naissance respectivement aux sous espèces japonica et indica. Des données plus récentes issues du séquençage, de l’identification des gènes intervenant dans le syndrome de domestication et de l’analyse des polymorphismes fonctionnels sélectionnés à ces loci conduisent à l'hypothèse d'une première domestication à partir d’une population spécifique d'O. rufipogon autour de la zone médiane de la rivière des Perles (ZHU JIANG) dans le sud de la Chine donnant la sous-espèce japonica. La sous-espèce indica aurait ensuite été domestiquée à partir des croisements entre des riz japonica et des riz sauvages locaux alors que les cultivars initiaux se répandaient dans l'Asie du Sud-Est et l'Asie du Sud (Huang et al. 2012). Une troisième théorie prenant en compte les différents groupes variétaux actuels milite pour une triple domestication, la troisième aurait donné naissance au groupe des riz aus séparé phyllogénétiquement des indica et des japonica tropicaux et tempérés, et présentant des caractères d’adaptation singuliers (Civáň et al. 2015).
1.3.3. Diversité d'Oryza sativa
La structuration de la diversité de l’espèce O. sativa est forte et particulière. C'est une espèce fortement bipolaire avec 2 sous-espèces, les indicas et les japonicas, clairement distingués sur la base de caractéristiques agro-morphologiques, de comportement en croisement, et de marqueurs biochimiques et moléculaires. Si l’obtention de grains hybrides ne pose pas de problème, les plantes F1 issues de ces croisements distants peuvent être sujettes à une stérilité pollinique et paniculaire plus ou moins importante selon les combinaisons. Cette stérilité partielle tend à décroître lors des générations suivantes mais peut s’accompagner d’un retour aux formes parentales et d'un déficit de recombinants. Cette limitation à la recombinaison peut être liée à la méiose (régions d’hétérologies structurales, polymorphisme important) mais également à l’action post-méiotique d’interactions entre gènes de développement sporophytique ou gamétophytique (Ouyang et al. 2010a).
La classification des riz basée sur des critères agro-morphologiques comportait de nombreuses incohérences et ne reflétait pas les observations des sélectionneurs. Par exemple, beaucoup de variétés de type japonica tropicaux avaient été initialement classifiés comme indica du fait du format de leur grain. Les marqueurs biochimiques ont été utilisés pour y mettre de l’ordre. Les premiers travaux conduits avec un échantillon de 1 688 variétés asiatiques à l’aide de 16 marqueurs isoenzymatiques, ont mis en évidence l’existence de six groupes variétaux (Glaszmann 1987). Cette classification n’a pas été démentie avec le développement des marqueurs moléculaires et du séquençage haut débit de 3000 génomes, mais seulement affinée. Le nombre de groupe a été réduit à 5 : les variétés qui, en 1987, constituaient les deux groupes de cette classification les moins nombreux et les plus atypiques
Figure 4 : Classification de 3 000 accessions de riz en 2 sous-espèces
et 5 groupes variétaux (adaptation de Li et al. 2014).
Japonica
Indica
(groupe III des Badhoia et groupe IV des Rayadas) ne font plus partie du panel d’accessions utilisé pour les études modernes de diversité et le groupe des japonica a été séparé en deux, les japonica tropicaux et les japonica tempérés. Cinq groupes variétaux – indica, aus/boro, basmati/sadri (ou aromatiques), japonica tropicaux et japonica tempérés – sont reconnus (Li et al. 2014) (Figure 4). Ces 5 groupes variétaux constituent deux espèces, la sous-espèce Indica au sens large qui regroupe les indica et les aus/boro et la sous-sous-espèce Japonica au sens large qui regroupe les japonica tempérés, les japonica tropicaux et les aromatiques (McCouch et al. 2016).
1.4. Sélection du riz
1.4.1. Méthodes de sélection et apport des biotechnologies et de la
génomique
Les efforts des premiers cultivateurs ont permis de transformer les espèces sauvages en cultivars (Sang and Ge 2013) et cette domestication est à présent si poussée que les espèces domestiquées comme Oryza sativa ne sont plus capables de survivre à l’état sauvage (CGIAR 2013).
A la fin du 19e siècle, l'homme réalise les premiers croisements de parents choisis. L'avancée des connaissances et les progrès technologiques ont depuis permis l'évolution des techniques de sélection. Les connaissances en génomique ont ensuite permis d'accélérer le travail d’amélioration marqué par les débuts de la sélection assistée par marqueur. Les premières stations d’amélioration variétale du riz ont vu le jour en Chine, en Inde et au Japon au début du XXème siècle (Khush 1987).
Les années 60 sont marquées par la révolution verte qui va favoriser la mécanisation, l’irrigation contrôlée, l’utilisation d'engrais et de pesticides et l'utilisation de semences améliorées. La révolution verte a permis une augmentation spectaculaire du rendement, symbolisée par la vulgarisation en 1966 par l’IRRI (International Rice Research Institute) d'une variété semi-naine (semidwarf) appelée IR8 (Khush 1987). Le rendement moyen mondial du riz en 1960 était d'environ 2 t / ha. Étonnamment, en seulement 40 ans, à mesure que les variétés et les techniques issues de la révolution verte se sont répandues, le rendement moyen a doublé, atteignant 4 t / ha en l’an 2000. En conditions irriguées intensives et en saison sèche, le rendement du riz peut atteindre jusqu'à 10 t/ha. Intensification et culture mono-variétale exposant les variétés à de nombreuses parasites et maladies, et donc d’avoir recours à des pesticides et des fongicides pour protéger les cultures, les années 70-80 ont été consacrées à l’intégration dans les nouvelles variétés de résistances génétiques, pouvant parfois avoir comme source des espèces sauvages apparentées. Les variétés emblématiques issues de ces travaux sont IR36, IR64 et IR72 que l’on a baptisées « méga-variétés » du fait qu’elles ont
Figure 5 : Hérédité de la stérilité mâle à contrôle géno-cytoplasmique.
Utilisation du système CMS (pour Cytoplasmic Male Sterility) dans les schémas de production d’hybrides F1. Ce système utilise 3 lignées distinctes : A, B et R. La lignée A est la lignée CMS. Elle porte les gènes de stérilité mâle géno-cytoplasmique c’est à dire qu’au niveau de l’ADN mitochondrial, elle porte des gènes responsables de la stérilité mâle (cytoplasme S pour stérilisant) et au niveau du noyau, elle porte les gènes récessifs de restauration de la fertilité (rr). Les plantes CMS et donc la lignée A ne produisent pas de pollen. La lignée B est aussi appelée lignée maintenese. Elle a un cytoplasme normal (N), du pollen fertile et possède les gènes récessifs de restauration de la fertilité pour maintenir le CMS (rr). Enfin la lignée R ou lignée restauratrice est la lignée qui possède les gènes dominant de restauration de la fertilité (RR) et un cytoplasme normal (N). La lignée R, lorsqu’elle est croisée avec la lignée A, permet de produire des grains hybrides (Rr) fertiles qui ont un cytoplasme stérilisant (S) .
couvert à elles-seules plusieurs dizaines de millions d’hectares en Asie. Depuis une quinzaine d’années, l’IRRI réalise un travail d'amélioration génétique plus amont laissant aux programmes nationaux le soin de développer des cultivars mieux adaptés à leurs contextes agro-environnementaux spécifiques.
Plus récemment, les biotechnologies ont été intégrées dans les programmes de sélection. Ce sont des outils supplémentaires à la disposition du sélectionneur pour repousser certaines limites rencontrées lors de l'utilisation des méthodes classiques d'amélioration des plantes.
1.4.2. Hétérosis et hybrides F1
Les deux espèces cultivées étant autogames, les variétés modernes sont en général des lignées pures. La sélection se fait par méthode généalogique après une phase de création de variabilité (hybridation dirigée, rétrocroisements, sélection récurrente ...). Dans les années 70, les sélectionneurs ont cherché d'autres pistes pour augmenter le rendement et se sont intéressés à l'hétérosis qui peut conduire à une augmentation du rendement de 20 à 30% chez le riz. Les Chinois ont été les premiers à développer et vulgariser des riz hybrides F1 après la découverte en 1973 d’un premier système de stérilité mâle géno-cytoplasmique (CMS : cytoplasmic male sterility), reposant sur une interaction entre gènes mitochondriaux et gènes nucléaires. Les lignées males stériles peuvent être divisées en 3 groupes : Wild Abortive (WA), Hong Lian (HL) et BoroII (BT) suivant leurs caractéristiques cytologiques et génétiques. Le système CMS WA a été le plus largement utilisé. Des études récentes suggèrent que le gène mitochondrial WA352 confère la stérilité en interagissant avec la protéine mitochondriale COX11 codée au niveau du noyau. La stérilité induite par WA352 peut être supprimée en utilisant deux gènes restaurateurs de fertilité (Luo et al. 2013a). Le système CMS WA reste le plus utilisé car il est stable quelque soient les environnements.
Le système CMS comprend un jeu de trois types de lignées pour multiplier la lignée mâle stérile puis restaurer la fertilité dans l’hybride F1 (Figure 5). La lignée A est la lignée mâle stérile. Elle est donc utilisée comme femelle. C'est elle qui a le cytoplasme qui confère la stérilité mâle ([S]) lorsque le noyau porte le gène de stérilité. La lignée B est la lignée mainteneuse. Elle a un cytoplasme normal ([N]) et un noyau identique à celui de la lignée A. En croisement avec la lignée A, la lignée B permet de multiplier la lignée A et B s'entretient par autofécondation. Enfin, la lignée R est la lignée mâle restauratrice. Elle a un cytoplasme normal ([N]) et son noyau contient un ensemble de gènes qui permettent la restauration de la fertilité. Le plus connu de ces gènes est rf3 mais il y en a d'autres et leur mécanisme d’action reste encore à élucider (Figure 5).
Des systèmes de stérilité mâle géniques induits par la température ou la photopériode ont également été développés : TGMS (for: temperature genetic male sterility) ou PGMS (for :
photoperiod genetic male sterility). Ils présentent l'avantage de ne nécessiter que deux parents au lieu de trois mais sont très sensibles aux conditions environnementales.
O. sativa ayant la biologie florale d’une plante autogame, son aptitude à l’allogamie est limitée : il faut donc faciliter la fécondation croisée entre la lignée male stérile et la lignée restauratrice pour produire des semences F1 en quantités suffisantes pour que le système soit économiquement viable. Cette production est assurée au champ en intercalant les deux types de lignées et en procédant à une pollinisation assistée (secouage en Chine). Le coût en main d’oeuvre reste très important, même si des méthodes plus mécanisées pour le semis et la récolte ont été mises au point. Le coût des semences reste donc élevé, et le rachat de semences F1 à chaque récolte rend cette innovation peu accessible aux riziculteurs de subsistance, en dehors des pays où l'achat des semences est subventionné.
D’autre part, le développement des 3 lignées A, B et R prend du temps. Pour accélérer la sortie variétale sur le long terme, l’amélioration de populations parentales pour leur aptitude à la combinaison a été conduit par le Cirad et l’Embrapa (Entreprise brésilienne de recherche pour l’agriculture et l’élevage) en Amérique Latine : L’hybride BRSCIRAD 302 est le premier lancé par une entreprise publique sur ce continent. Cet hybride, fruit d’une longue coopération entre le Cirad et l’Embrapa, résulte du croisement entre deux lignées spécifiquement sélectionnées pour former des hybrides. Ce nouveau riz hybride présente, outre un rendement élevé caractéristique, une qualité de grain égale à celle des meilleures variétés du marché brésilien.
Un système innovant de production des semences, totalement mécanisé pour le semis et la récolte, a aussi été développé. Les semences de BRSCIRAD 302, bien que destinées à la culture irriguée, sont produites en conditions pluviales. Cela permet une diminution des coûts de production des semences et évite toute contamination par les riz rouges adventices très fréquents au Brésil. Des semences de BRSCIRAD 302 sont en phase de commercialisation dans l’état du Rio Grande Do Sul, le plus grand producteur de riz au Brésil.
1.5. Ressources et outils disponibles pour l'amélioration variétale
1.5.1. Diversité naturelle et induite
La diversité est essentielle pour la création de nouvelles variétés. Cette diversité peut provenir soit de la variation allélique naturelle, soit être induite par des agents mutagènes de façon ciblée ou aléatoire. Alors que la diversité naturelle s'est enrichie pas à pas au cours de l'histoire évolutive des espèces puis de la domestication, la mutagenèse par agent chimique ou physique puis les biotechnologies (variation somaclonale, insertion au hasard d’élément transposable ou d’ADN-T pouvant être porteur d’étiquette d’activation) ont ensuite permis de créer de la diversité toujours de façon aléatoire. Depuis 2012, une mutagenèse dirigée par
l’homologie avec un ADN de réparation devient possible grâce à l'utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 qui permet l’induction de coupures double brin à une haute fréquence à un site déterminé du génome (Jinek et al. 2012).
1.5.1.1. Des milliers de variétés de riz
La diversité génétique du riz est considérable avec plus de 150 000 variétés cultivées dans le monde. L’IRRI (International Rice Research Institue) entretient une collection de 130 000 accessions de riz cultivés (variétés modernes, traditionnelles et anciennes) et 5000 accessions d'espèces sauvages apparentées (International-rice-genebank, IRRI) (De Guzman 2016). Cette diversité provient de croisements naturels d'O. sativa avec des formes sauvages ou adventices d'O. rufipogon ou de croisements intra-sativa combinés à la sélection naturelle et humaine depuis la domestication (Khush 1987).
1.5.1.2. La diversité induite : aléatoire ou ciblée
Conjointement au séquençage de Nipponbare, le génome de référence d'O. sativa, un collectif international de chercheurs a développé des collections de mutants à la fin des années 1990 pour relever un autre défi, celui de découvrir la fonction des 39 000 gènes prédits chez Nipponbare (Hirochika et al. 2004; Kawahara et al. 2013). Pour étudier la fonction d’un gène, le moyen le plus direct est d’inactiver son expression et d’observer l’altération du phénotype. Chez le riz, on peut soit inactiver l’expression d’un gène cible par « gene silencing » ou « gene targeting » soit induire des mutations au hasard dans le génome en faisant de la mutagenèse chimique, physique ou insertionnelle. Ainsi, au cours des 20 dernières années, de nombreuses populations de mutants ont été créées (Tableau 1). Les collections de mutants d’insertion permettent aujourd'hui de disposer d’au moins un insert (ADN-T, Ac/Ds, En/Spm ou Tos17) dans 72% des gènes et jusqu’à trois inserts pour 22% d’entre eux (Droc et al. 2013). Des collections de RNAi ou de surexpression systématique de cDNA ont également été créées. Des collections de mutants obtenus par traitement chimique de semences à l’EMS ont notamment été produites : Chaque lignée possédant un grand nombre de lésions (une lésion chaque 300 pb), l’identification de mutants possédant une lésion dans le gène recherché se fait par TILLING ou plus récemment par séquençage de la région souhaitée à partir de pools d’ADN (Till et al. 2007). Ces collections de mutants peuvent également être utilisées pour faire de la génétique directe en réalisant des pools de descendances de mutants d’intérêt qui seront séquencés à haut débit. Le polymorphisme responsable de la mutation sera identifié parmi les autres car il sera commun au bulk de descendants présentant le phénotype, permettant l’isolement du gène causatif (Abe et al. 2012). Cette méthode dite MUTMAP a déjà permis d’identifier un nouveau gène de résistance à la pyriculariose et un gène de tolérance à la salinité(Takagi et al. 2013, 2015). Récemment, deux équipes ont rapporté la création de collections de lignées KO CRISPR/Cas9 (Knock Out) à l’échelle du génome chez le riz,
ouvrant de nouvelles perspectives pour la découverte de la fonction des gènes (Lu et al. 2017; Meng et al. 2017) .
1.5.2. Matériel à haute résolution génétique
Si la détection de QTL a longtemps utilisé des populations F2 ou des lignées recombinantes fixées (RILs) comme matériel, une façon plus rapide de localiser les QTLs a été de développer à partir de parents bien caractérisés des lignées de substitution ne possédant chacune qu’une petite région du génome d’un parent introgressé dans le fond génétique de l’autre parent (CSSLs ou chromosome segment substitution lines) : de nombreuses populations de CSSLs ont été développées notamment au Japon à partir des parents Nipponbare, Koshihiraki et Kasalath et ont permis d’accélérer la découverte et l’isolement de gènes (Miura et al. 2011). Des populations à haute résolution génétique comme les MAGICs (croisements pyramidaux successifs d’un groupe de parents au génome séquencés maximisant la recombinaison) ou les NAMs (croisements d’un groupe de parents avec un seul parent récurrent, tous génotypés à haut débit ou séquencés) permettent à la fois d’accélérer la cartographie de gènes d’intérêt et de dériver du matériel utilisable en pre-breeding (Fragoso et al. 2017; Raghavan et al. 2017).
1.5.3. Ressources génomiques et bio-informatiques
Le riz possède un génome diploïde simple (2n=24) de petite taille (390 Mb ; 0,9 pg ; 37 000 gènes) colinéaire avec celui des autres graminées (Devos and Gale 1997). C’est pourquoi en 1997, les chercheurs ont choisi le riz comme espèce "modèle" pour les monocotylédones (Sasaki and Burr 2000).
En 2002, une première version des séquences génomiques de deux accessions des deux sous espèces japonica (Nipponbare) et. indica (93–11) ont été publiées simultanément (Goff et al. 2002; Yu et al. 2002). Par la suite, en 2005, le consortium international pour le séquençage du génome du riz (IRGSP) a publié une séquence de haute qualité du génome du cultivar Nipponbare (Sequencing Project 2005) qui a été annotée par une communauté de spécialistes des familles de gènes ou d’éléments transposables (RAPDB). Cette séquence demeure encore aujourd’hui la plus aboutie au sein de l'espèce O. sativa et parmi les plantes cultivées.
Dans le même temps, le « Rice Full-Length cDNA Consortium » a séquencé en 2003 plus de 28000 cDNA de Nipponbare et assigné une fonction à 76% des cDNA par recherche d’homologie de séquence. 64% de ces séquences ont des protéines homologues chez Arabidopsis (Kikuchi et al. 2003).
Ces travaux sur le génome ont non seulement permis une avancée considérable en génomique fonctionnelle mais ont aussi fourni un génome de référence de haute qualité indispensable aux nouvelles technologies de re-séquençage NGS (Next-Generation Sequencing) qui permettent de séquencer à bas coût des génomes entiers de riz (Guo et al.
2014). Aujourd’hui, le séquençage d'une variété est devenu accessible ce qui représente une nouvelle révolution pour l’amélioration des plantes. En 2014, 3 000 accessions de riz provenant de 89 pays ont été séquencés à une profondeur moyenne de séquençage de 14x (Li et al. 2014) et les SNPs découverts mis à disposition sur le web (http://snp-seek.irri.org). Une puce haute densité comportant 700 000 SNP a également été développée à l’Université de Cornell (McCouch et al. 2016). Les travaux de séquençage variétal dans les ressources génétiques du riz ont rapidement montré que se référer à un seul génome était insuffisant pour comprendre la diversité allélique et la variation naturelle. Des gènes d’intérêt agronomique comme les gènes sub1, pstol1 (pup1) ou snorkle étaient absents de la séquence de Nipponbare. Les génomes d'accessions représentatives des autres groupes variétaux ont donc été séquencés et assemblés de novo. Les séquences de la variété indica IR64 et de la variété aus DJ128 ont ainsi été publiées (Schatz et al. 2014).
Le génome de l'espèce cultivée africaine O. glaberrima a été séquencé par plusieurs groupes, ce qui a permis de mettre en évidence que des variations naturelles dans les mêmes gènes de domestication que chez O. sativa proviennent de l’action de la sélection humaine.
Dans le cadre du projet I-OMAP, 18 génomes sauvages comprenant les 9 espèces appartenant au génome A et 9 autres espèces représentatives des 9 types de génomes (BB, CC, BBCC, CCDEE, FF, GG, KKLL, et HHJJ) ont été séquencés. Treize de ces séquences ont aujourd'hui été assemblées (Wing communication personnelle) (Figure 3).
1.5.4. Les outils d’ingénierie cellulaire et d’édition des génomes
Le riz a été transformé successivement par traitement chimique ou physique de protoplastes isolés, par suspensions cellulaires (Toriyama et al. 1988) par bombardement de microprojectiles sur des embryons immatures ou des cals dérivés d’embryons de grains matures (Christou et al. 1991), puis par co-culture de cals de grains matures ou d’embryons immatures avec Agrobacterium tumefaciens (Hiei et al. 1994). Cette dernière méthode est largement adoptée par les laboratoires car le transfert biologique de l’ADN-T est très efficace et conduit à des intégrations simples par rapport aux méthodes de transfert direct. Le riz de type japonica tempéré demeure la céréale chez laquelle l’efficacité de transformation est la plus élevée (5 événements de transformation par cal co-cultivé pour le génotype modèle Nipponbare). Des progrès significatifs ont été réalisés sur les riz de type indica comme IR64 (20% des embryons co-cultivés forment une plante transgénique). Cette efficacité a permis au riz d’être la seule plante à fleur chez laquelle des événements de ciblage génique ont été obtenus de façon répétée (Terada et al. 2002). Comme nous l’avons vu, cet outil permet le transfert de constructions de surexpression, d’inactivation, de localisation tissulaire ou subcellulaire et aujourd’hui de ciblage par les technologies d’édition du génome (méganucléases, Zinc Finger Nucléases, TALE nucléase, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1).
La technologie d’édition du génome CRISPR/Cas9 est aujourd’hui largement adoptée comme en témoigne le nombre exponentiel de publications y faisant référence, y compris sur le riz. Les mécanismes biologiques de CRISPR/Cas9 ont été révélés en 2012 par Jennifer Doudna de l'Université de Californie et Emmanuelle Charpentier de l'Institut Max Planck à Berlin (Jinek et al. 2012). L’équipe de Zhang F. (Broad Institute, MIT) a de son côté montré la possibilité d’utiliser la technologie dans un système eucaryote.
Le mécanisme CRISPR/Cas9 confère à certaines bactéries une « immunité acquise » leur permettant de lutter contre les phages, les virus ou plasmides exogènes. Après une attaque virale, la bactérie va stocker des fragments de cet ADN viral invasif sous forme de "spacers" intercalés entre de petites séquences répétées sur son chromosome. Longtemps considérés comme du « junk DNA », les loci CRISPR ("Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats") contiennent donc une alternance de courtes séquences identiques répétées et de séquences "spacers" spécifiques provenant des agresseurs qui sont, en fait, une « bibliothèque » de leurs signatures moléculaires. Si la bactérie est de nouveau attaquée par ce même virus, elle va transcrire cette région qui va être découpée en fragments, les petites séquences répétées étant reconnues par un tracrRNA bactérien transcrit simultanément, qui est va être reconnu par la nucléase Cas9. La partie spécifique (signature moléculaire) ou crRNA va ensuite guider la Cas9 jusqu'au nouvel ADN viral complémentaire, s’y apparier et le couper. Pour que le découpage de l’ADN viral commence, il faut que le site reconnu par le CRISPR possède en amont un motif particulier, le Protospacer Adjacent Motif (PAM) -NGG pour la Cas9. La protéine Cas9 se fixe alors sur l'ADN cible et effectue une coupure double brin de l'ADN. Le découpage de l'ADN viral entraine sa dégradation. La protéine Cas9 fait partie de la famille des nucléases, et les chercheurs ont découvert que cette protéine peut également couper toute séquence d'ADN à un lieu précis (cible) reposant sur la complémentarité des bases entre l'ARN guide et de l'ADN cible. Il suffit donc d'un ARN guide pour que le système CRISPR/Cas9 coupe l'ADN cible à condition qu'il y ait un site PAM en amont de la cible. La CDB d'ADN est ensuite généralement réparée par ligation des extrémités (NHEJ) mais la Cas9 continue à couper tant que le site de reconnaissance n'est pas muté. La réparation aboutit en général à des insertions de nucléotides A/T ou des délétions de nucléotides (de quelques paires de bases à une dizaine si la réparation procède par recherche de micro-homologies sur la séquence -MMEJ) qui modifient le cadre de lecture. L'expression de la protéine correspondante est abolie. En fournissant une matrice de réparation et en sélectionnant les évènements de RH, cette méthode permet de faire également de la réelle édition du génome, allant du changement d'un nucléotide, jusqu'au remplacement de larges régions du génome(Zhou et al. 2014).
La technologie d'édition du génome est à présent basée sur l'utilisation d'une cassette exprimant un ARN guide (gRNA), qui va comporter à la fois la partie spécifique à la cible et la partie constante reconnue par la Cas9. La mise en œuvre est très simple. La seconde cassette
va être conçue pour exprimer une version de l'enzyme Cas9 spécifique de l'espèce. Sur le riz, la mutagenèse ciblée par CRISPR/Cas9 est opérationnelle depuis 2013. Des exemples de multiplexage ont été publiés (Miao et al. 2013b) ainsi que l’utilisation d’une nucléase alternative Cpf1 qui a des propriétés particulières, notamment de reconnaître un PAM différent de la Cas9 riche en T (TTN ou lieu de NGG) (Yin et al. 2017).
Ces nouvelles technologies d'édition du génome ont déjà permis d'améliorer la qualité aromatique du riz (KO de Osbadh2) ou le format du grain (KO simultané de 3 gènes).
Des tentatives de remplacement d'allèle sont en cours. Le seul exemple publié reste celui du remplacement de nucléotides sur la séquence du gène d’acétolactate synthase du riz conférant une tolérance à l’herbicide chlorsulfuron, les cellules éditées devenant sélectionnables par l’herbicide. Une autre technologie, basée sur l’utilisation d’une Cas9 nickase (d/nCas9) fusionnée à une cytidine déaminase, permet la correction génique sans induction de CDB (conversion d’une cytidine en uridine permettant le changement de G/C vers A/T). Cette technologie a notamment été utilisée sur le riz pour convertir l’allèle japonica du transporteur de nitrate NRT1.1b en allèle indica, qui améliore l’efficacité d’utilisation de l’azote .
La technologie CRISPR/Cas9 qui remplace d’ores et déjà l'utilisation des mutants d'insertion pour les études d’analyse fonctionnelle des gènes sera sans doute utilisée dans le futur dans les programmes d'amélioration des plantes, où elle permettra de remplacer n'importe quel allèle ou combinaison d’allèles par un/une autre plus favorable.
1.6. Biologie du riz
Le riz cultivé est une plante annuelle. Le cycle de biologie du riz, à l’instar de celui des autres céréales s'opère en trois phases essentielles : 1) une phase végétative, allant de la germination à l'initiation des primordiaux floraux ; 2) une phase reproductive, qui va de cette initiation paniculaire à la pollinisation ; et 3) une phase de maturation du grain (Figure 6).
1.6.1. Phase végétative
Il convient de noter que la durée de la phase végétative varie significativement selon les variétés. Les variétés sont d'ailleurs parfois classées selon leur degré de précocité c’est à dire en fonction de la longueur du cycle végétatif car la phase reproductrice, elle, varie très peu (8-10j). On parle alors de variétés très précoces lorsque le cycle complet est compris entre 90 et 100 jours (cas des aus), puis de variétés précoces, semi-précoces, moyennes (120 à 150 jours), tardives et très tardives si le cycles est supérieur à 210 jours (Nona bokra). Ce mode de classement, qui est pratiqué d'un point de vue agronomique, n'a cependant aucune valeur taxonomique.
