Matériel génétique

5.2.2.1. Recherche de mutants d'insertion et génotypage

Comme vu dans la première partie (§1.5.1.2), le riz dispose de nombreux outils et en particulier de bases de données de mutants d'insertion ADN-T ou Tos17 accessibles via différents navigateurs génomiques comme OryGenesDB développé par le CIRAD (Droc et al. 2006). Nous avons développé un outil de génotypage ("Genotyping Primer Designer" sur OryGenesDB) qui permet de générer automatiquement un set de 3 amorces permettant de déterminer si l'intégration du transgène est à l'état homozygotes, hétérozygotes ou sauvages dans la descendance analysée. Le génotypage par PCR des lignées se fait en suivant le

Figure 29 : Schéma de croisement pour l’étude d’un simple mutant anti-CO. Pour un gène cible (GC) considéré, on utilise deux mutants. Le mutant 1 porte une mutation au site 1 (S1) et le mutant 2 une mutation au site 2 (S2). La mutation peut être à l’état hérérozygote (+/-) ou homozygote (+/+) pour chaque site considéré. Chaque triangle représente un site d’insertion ADN-T ou une cible pour la CRISPR/Cas9. Chaque allèle est représenté par un + s’il est sauvage ou un – s’il est muté.

GC1 --/-- GC1 ++/++

protocole publié (Mieulet et al. 2013). Les amorces utilisées pour génotyper sont listées en annexe (Annexe 1).

Les mutants utilisés dans cette étude sont les lignées d'insertion ADN-T AQSG07 et A46543 pour OsFANCM (Os11g07870) ainsi que 3A-03503 et AUFG12 pour OsRECQl4 (Os04g35420). Les lignées AQSG07 et AUFG12 sont dans un fond génétique Nipponbare (NB), les deux autres sont dans un fond génétique Dongjin (DJ) (Annexe 1).

5.2.2.2. Caractérisation moléculaire des mutants ADN-T

La base de donnée d'expression, RiceXPro (Sato et al. 2013), indique que le gène Os04g35420 est plus exprimé dans les inflorescences que dans les autres tissus (Annexe 3). Cependant, il n'y a pas de données d'expression pour le gène Os11g07870. Les ARN totaux des lignées 3A-3503, AUFG12, AQSG07 et A46543 ont été extraits (RNAzol®RT, RN190, MRC) à partir de jeunes inflorescences (stade méiocyte) mais aussi à partir de plantules de10 jours. Un lot de 3 plantes homozygotes mutantes (-/-) et 3 plantes sauvages (+/+) par type de mutation soit 6 échantillons par lignée et les témoins variétaux NB et DJ ont été utilisés pour faire l'analyse quantitative. 3µg d'ARN total (dosage BioAnalyser 2100, Agilent) ont été transcrits (Superscript III, Invitrogen). Les ADNc des différents gènes (1µL dilution au 1/10ème) ont été amplifiés en utilisant des amorces dans les exons flanquant le site d'intégration du transgène et en faisant des cycles de PCR de 30 ou 32 cycles (95 °C 20’’; 60 °C 20’’; 70°C 45’’) (KOD Hot Start DNA Polymerase®, Novagen) (Annexe 2). Le gène de ménage OsEF1α a été utilisé comme contrôle endogène pour normaliser les échantillons. Les produits PCR ont ensuite été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% et l'intensité de chaque bande a été quantifiée avec le logiciel ImageJ. Le niveau relatif d'expression des gènes a été comparé entre les descendants homozygotes mutants et sauvages. Nous avons aussi fait de la PCR quantitative avec des amorces positionnées dans la partie 3'UTR des gènes FANCM et RECQl4 puis avec des amorces situées de part et d'autre du transgène. La chimie utilisée était le SYBR green (SYBR green I-Master 2X ®, Roche) sur LightCycler 480 dans un volume réactionnel de 15µL. Pour chaque réaction, 3µL d’ADNc (dilution de 1/10 à 1/100), 7,5µL de 2X SYBR green, 0,75µL de chaque amorce (10µM) et 3µL d'eau ont été utilisés (Annexe 2) (Caldana et al. 2007).

5.2.2.3. Développement de populations F2 pour l'étude des gènes anti-CO

ü Populations F2 permettant d'étudier l'effet d'un gène anti-CO : "simple mutant"

Pour étudier l'impact de la mutation d'un gène anti-CO, nous avons réalisé un croisement entre 2 mutants (mutant 1 et 2) provenant de deux fonds génétiques différents (A ou B) et portant chacun une insertion à l'état hétérozygote dans le gène cible "1" (GC1) (Figure 29). Dans le cas du mutant 1 qui est dans le fond génétique A le GC1 est inactivé par l'intégration d'un ADN-T au site 1 (S1). Dans le cas du mutant 2 le GC1 n'est plus transcrit à cause d'une

Figure 30 : Schéma de croisement pour l’étude d’un double mutant anti-CO. Pour deux gènes cibles (GC), on utilise deux mutants par GC. Les mutant 1 et 2 sont mutés au site 1 (S1) du GC1 ou GC2 respectivement. Les mutants 3 et 4 sont mutés au site 2 (S2) du GC1 ou GC2 respectivement. La mutation peut être à l’état hérérozygote (+/-) ou homozygote (+/+) pour chaque site considéré. Chaque triangle représente un site d’insertion ADN-T ou une cible pour la CRISPR/Cas9. Chaque allèle est représenté par un + s’il est sauvage ou un – s’il est muté.

18

mois

1/16 1/16

GC1xGC2

--/-- ^GC1xGC2 ++/++

mutation (ADN-T ou CRISPR/Cas9) au site 2 (S2). Le croisement ainsi réalisé permet d'obtenir en F1 ¼ de sauvages (S1 +/+ ; S2 +/+) et ¼ d'individus hétérozygote pour le GC1 au S1 et hétérozygote pour le GC1 au S2. Pour simplifier, on utilisera le terme d'homozygote au GC1, même si à chacun des deux sites de mutation l'insertion est hétérozygote (S1 +/- ; S2 +/-), à l'échelle du gène ciblé (S1+S2), l'insertion est sur les deux brins d'ADNs donc on peut considérer qu'elle est homozygote. L'autofécondation de plantes F1 homozygotes (hétéroalléliques) et des F1 sauvages permet d'obtenir deux populations F2 identiques d'un point de vue génétique à l'exception près du gène anti-CO étudié (GC1) (Figure 29).

ü Populations F2 permettant d'étudier l'effet de deux gènes anti-CO : "double mutant"

Nous avons établi un schéma de croisement pour développer des population F2 permettant de mesurer l'effet cumulé de deux gènes anti-CO (GC1 et GC2) sur la recombinaison (Figure 30). Les deux premières étapes de ce schéma consistent à croiser dans le même fond génétique "A" ou "B" deux mutants homozygotes l'un pour le GC1 (GC1 S1-/- et S2+/+ ; GC2 S1+/+ et S2+/+) et l'autre pour le GC2 (GC1 S1+/+ et S2+/+ ; GC2 S1-/- et S2+/+). On obtient ainsi dans chacune des F1 100% d'individus hétérozygotes mutants pour les deux gènes dans un fond génétique A (Hybride F1A) ou dans un fond génétique B (hybride F1B). L'étape 3 est un croisement entre les deux F1 qui permet d'obtenir les super hybrides F1 dans un fond génétique contrasté (super F1A/B). Dans cette population de super F1 A/B nous sélectionnons les 1/16 d'individus double mutants homozygotes (GC1 S1+/- et S2+/- ; GC2 S1+/- et S2+/-) et les sauvages apparentés (GC1 S1+/+ et S2+/+ ; GC2 S1+/+ et S2+/+). Comme précédemment nous considérons les GCs globalement, c'est à dire S1 et S2, c'est pourquoi nous nous permettons de dire que les mutations sont homozygotes hétéroalléliques. Comme pour l'étude du simple mutant, le schéma se poursuit en étape 4 par l'autofécondation de ces deux types de F1. Le génotypage haute densité des populations F2 permet de mesurer l'effet des mutations cumulées des deux gènes anti-CO sur la recombinaison (Figure 30).