UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Institut de Pharmacie

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Institut de Pharmacie

Laboratoire de Chimie Biologique et de la Nutrition Promoteur : Professeur Christine Delporte

Laboratoire de Physiologie et de Pharmacologie Co-Promoteur : Professeur Jeanine Fontaine

ETUDE DE L’EXPRESSION, DE LA PRODUCTION ET DE LA DEGRADATION DE LA GHRELINE

Carine De Vriese

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Pharmaceutiques

Année académique 2005-2006

La ghréline est un peptide de 28 acides aminés, produit principalement par l’estomac et caractérisé par la présence d’un groupement octanoyl sur la sérine en position 3 (Kojima et al. 1999). La ghréline stimule la libération de l’hormone de croissance (GH) et régule la prise alimentaire et le métabolisme énergétique (Gualillo et al. 2003). Ces activités biologiques sont principalement médiées par le « growth hormone secretagogue receptor » (GHS-R).

Deux sous-types de GHS-R, produits par épissage alternatif d’un même gène, ont été clonés : le GHS-R 1a, dont l’activation entraîne une libération de calcium via la formation d’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP

), et le GHS-R 1b, qui ne semble pas lié à une activité biologique (Howard et al. 1996).

La première partie de mon travail de thèse consistait en l’étude de la dégradation de la ghréline. La ghréline circule dans le sang principalement sous forme de des-acyl ghréline, une forme de ghréline dépourvue du groupement octanoyl qui ne se lie pas au GHS-R 1a. Peu d’études ont été réalisées sur le catabolisme de la ghréline. Les enzymes impliquées dans la dégradation de la ghréline étant des régulateurs importants de son activité biologique, le but de cette étude était d’identifier les sites de clivage et les enzymes impliquées dans la dégradation de la ghréline par du sérum, des sous-fractions plasmatiques et des homogénats de tissus. Nous avons montré qu’au contact de sérum humain et de rat, la ghréline est désoctanoylée, sans protéolyse. Dans le sérum humain, nous avons montré que la butyrylcholinestérase et la « platelet-activating factor acetylhydrolase » (PAF-AH), une phospholipase associée aux lipoprotéines de basse densité (LDL), sont impliquées dans ce phénomène (articles n°1 et n°2). En parallèle, nous avons montré que la ghréline peut être transportée dans la circulation sanguine par les lipoprotéines riches en triglycérides (TRL), les LDL, et les lipoprotéines de haute et de très haute densité (HDL et VHDL) (article n°2). Dans le sérum de rat, la désoctanoylation de la ghréline implique une carboxylestérase (article n°1).

Au contact d’homogénats de tissus, la ghréline est dégradée à la fois par désoctanoylation et

protéolyse N-terminale, suggérant la participation d’estérases et d’aminopeptidases. Nous avons identifié cinq sites de clivage dans la ghréline : entre les résidus Ser

-(acyl)Ser

(dans l’estomac et le foie), (acyl ?)Ser

-Phe

(dans l’estomac, le foie et le rein), Phe

-Leu

(dans l’estomac et le rein), Leu

-Ser

et Pro

-Glu

(dans le rein) (article n°1).

La deuxième partie de mon travail de thèse consistait à étudier l’expression et la

production de ghréline par différentes lignées leucémiques (HEL, HL-60, THP-1, SupT1), par

des leucocytes poly- et mononucléés et par des plaquettes sanguines, et à étudier l’effet de la

ghréline sur la prolifération cellulaire. Pour cela, nous avons mis au point des dosages

radioimmunologiques (RIA) permettant de quantifier et de distinguer les formes octanoylées

et non octanoylées de la ghréline, et nous avons caractérisé en détail les anticorps SB801 et

SB969 obtenus. Par HPLC en phase inverse suivie des RIAs, nous avons mis en évidence la

présence de ghrélines octanoylée et non octanoylée dans chaque population de cellules. Plus

de 80 % de la ghréline produite est octanoylée dans les cellules HEL, les leucocytes et les

plaquettes. Nous avons montré que la ghréline endogène stimule la prolifération des cellules

HEL de façon autocrine impliquant un récepteur encore non identifié, distinct du GHS-R 1a

(article n°3). La ghréline et la des-acyl ghréline inhibent la prolifération des leucocytes

mononucléés mais sont dépourvues d’effet sur les cellules HL-60, THP-1 et SupT1. Malgré la

présence du GHS-R 1a dans les leucocytes mononucléés, cet effet pourrait être médié par un

récepteur différent puisque la des-acyl ghréline exerce le même effet que la ghréline sur la

prolifération (article n°4).