UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine
Laboratoire de Recherche sur le Métabolisme des Peptides
NEPHROTOXICITE DES ACIDES ARISTOLOCHIQUES : APPROCHES EXPERIMENTALES DE L’ATTEINTE
TUBULAIRE PROXIMALE
Catherine LEBEAU
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales
Promoteur : Dr. J. Nortier
Co-promoteur : Pr. M. Deschodt-Lanckman
Année académique 2005-2006
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine
Laboratoire de Recherche sur le Métabolisme des Peptides
NEPHROTOXICITE DES ACIDES ARISTOLOCHIQUES : APPROCHES EXPERIMENTALES DE L’ATTEINTE
TUBULAIRE PROXIMALE
Catherine LEBEAU
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales
Promoteur : Dr. J. Nortier
Co-promoteur : Pr. M. Deschodt-Lanckman
COMPOSITION DU JURY
Président : Pr. Ph. Lebrun Secrétaire : Dr. J. Nortier
Membre du jury : Pr. M. Deschodt-Lanckman Membre du jury : Pr. M. Dratwa
Membre du jury : Pr. J-C. Noël Membre du jury : Pr. P. Roger Expert étranger : Pr. G. Friedlander Expert étranger : Pr. C. Isnard Bagnis
CURRICULUM VITAE
Catherine Lebeau, née le 23 novembre 1973 à Uccle, est célibataire et de nationalité Belge.
Etudes secondaires :
Athénée Emile Bockstael de Bruxelles, section latin-sciences (1985 – 1991)
Etudes universitaires :
Licenciée en Sciences chimiques au grade légal obtenu avec grande distinction, Université Libre de Bruxelles (1991 – 1995)
Titre du mémoire: "Clonage et séquençage du gène MEP3 codant pour une protéine homologue aux transporteurs d'ammonium chez Saccharomyces cerevisiae". Laboratoire de Physiologie Cellulaire et de Génétique des Levures, département de Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences, ULB, Pr.
B. André
DEA en Sciences de la santé, Université Libre de Bruxelles (2001)
Activités de Recherche
Echangeur Na/Ca dans les cellules pancréatiques β de rat. Laboratoire de Pharmacodynamie et de thérapeutique, Faculté de Médecine, ULB, Pr. A.
Herchuelz (1996 – 1997)
Transporteurs basolatéraux de chlore dans la maladie rénale polykystique autosomale dominante
Néphrotoxicité des acides aristolochiques : étude in vitro.
Laboratoire de Physiopathologie , Faculté de Médecine, ULB, Pr. R.
Beauwens (1998 – 2002)
Néphrotoxicité des acides aristolochiques : étude in vivo. LRMP, Faculté de Médecine, ULB, Pr. M. Deschodt-Lankman et Service de Néphrologie, Hôpital Erasme, Dr. J. Nortier, (2003-2006)
Prix scientifique
Prix « Takis Anagnostopoulos » de la meilleure communication orale au colloque
“Les cellules rénales et les interactions cellulaires dans les épithéliums: du gène à la physiopathologie”, Faculté de Médecine Necker, Paris, France, 20 et 21 juin 2002.
Publications scientifiques :
Van Eylen F, Lebeau C, et al. Diabetes 47: 1873-1880, 1998 Lebeau C, et al. Kidney Int. 60: 1332-1342, 2001
Lebeau C, et al. Pflügers Archiv – Eur J Physiol. 444: 722-731, 2002 Lebeau C, et al. Nephrol Dial Transplant. 20: 2321-2332, 2005
REMERCIEMENTS
La réalisation de ce travail n’aurait pu aboutir sans les conseils avisés des différents responsables de laboratoire qui m’ont accueillie. Je souhaite tout d’abord remercier le Professeur R. Beauwens du Laboratoire de Physiologie ainsi que le Docteur O. Devuyst de la Division de Néphrologie de la Faculté de Médecine de l’Université Catholique de Louvain pour m’avoir épaulée dans l’élaboration du travail concernant l’approche in vitro. Je remercie également Madame Yvette Cnops, technicienne travaillant dans l’unité du Docteur O. Devuyst, pour m’avoir initiée à la technique des gels d’électrophorèse. Je tiens ensuite à adresser ma plus vive gratitude à Madame le Professeur M. Deschodt-Lanckman du Laboratoire de Recherche sur le Métabolisme des Peptides pour m’avoir témoigné sa confiance et encouragée dans la poursuite de mon travail de thèse avec l’exploration des aspects in vivo.
J’adresse également mes remerciements à Monsieur le Professeur J-L.
Vanherweghem pour son soutien constant et ses avis critiques et constructifs.
Je souhaite exprimer toute ma gratitude à l’égard du Docteur Joëlle Nortier, promoteur de ce travail, pour son soutien à toute épreuve. Au cours des heures passées à travailler ensemble, j’ai eu l’immense plaisir d’apprécier à sa juste valeur ses discussions et remarques constructives, son enthousiasme, sa rigueur et son perfectionnisme.
Mes plus vifs remerciements vont aussi au Docteur Frédéric Debelle pour m’avoir transmis ses connaissances, guidée dans mes premiers pas au laboratoire et familiarisée avec le modèle animal. Un tout grand merci à Monsieur Eric De Prez et Madame Cécile Husson pour leur précieuse aide technique. Merci aussi à Agnieszka Pozdzik ainsi qu’à Claire, Sofia, Aurore, Pascal et Claude (Laboratoire d’Immunologie Expérimentale) pour leurs encouragements.
Je ne manquerai pas de remercier le Professeur V. Arlt pour sa collaboration concernant la détection des adduits d’ADN aux aristolactames, le Professeur I.
Salmon pour ses conseils en histopathologie rénale, le Professeur J-P. Brion et sa technicienne Madame Michelle Authelet pour l’étude en microscopie électronique.
Je remercie également le Fonds Alphonse et Jean Forton, le Fonds de la Recherche Scientifique Médicale ainsi que la Banque Nationale de Belgique pour leur contribution financière à la réalisation de ce travail.
Je ne sais comment remercier mon amie Anne Demols et Gilles Wolles qui ont toujours su trouver les mots justes pour me soutenir et m’encourager tout au long de mon travail de thèse.
Je remercie mes parents de m’avoir permis d’entamer mes études. Je remercie très chaleureusement mon frère, Frédéric, pour son soutien et ses encouragements.
Je ne sais quels mots choisir pour remercier du fond du cœur, Stéphane, pour son aide à résoudre les pannes liées aux mystères de l’informatique ainsi que pour ses précieux encouragements et son soutien au quotidien.
TABLE DES MATIERES
Pages
Liste des abréviations . . . 7
Résumé . . . 9
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION . . . 10
1. Le rein : généralités . . . 10
1.1. Unité anatomique, le néphron . . . 11
1.2. Unité fonctionnelle, le néphron . . . 12
1.2.1. Le glomérule . . . 12
1.2.2. Le tubule rénal . . . 15
1.2.3. La vascularisation rénale . . . 18
2. Le tubule proximal . . . 20
2.1. L’épithélium tubulaire proximal . . . 21
2.2. Réabsorption tubulaire . . . 22
2.2.1. Réabsorption du sodium . . . 22
2.2.2. Réabsorption des nutriments . . . 23
2.3. Sécrétion tubulaire . . . 24
2.3.1. Sécrétion d’hydrogène . . . 24
2.3.2. Sécrétion d’ammonium . . . 25
2.4. Endocytose médiée par récepteur . . . 25
2.4.1. Mégaline et cubiline . . . 27
2.5. Sécrétion et réabsorption tubulaire des drogues et xénobiotiques . . . 37
3. Marqueurs urinaires d’atteinte tubulaire proximale . . . 42
3.1. Atteinte structurelle . . . 43
3.2. Atteinte fonctionnelle . . . 45
4. Cellules de rein d’opossum : modèle d’étude du tubule proximal . . . 51
4.1. Caractérisation de la lignée de cellules OK (opossum kidney) . . . 51
4.2. Endocytose médiée par récepteur . . . 56
5. Toxicité tubulaire des acides aristolochiques . . . 59
5.1. Néphropathie aux plantes chinoises : aperçu clinique . . . 61
5.2. Données expérimentales chez l’animal . . . 64
5.2.1. Toxicité aiguë . . . 64
5.2.2. Toxicité chronique . . . 64
CHAPITRE 2 : BUTS DU TRAVAIL . . . 66
CHAPITRE 3 : METHODOLOGIE . . . 67
1. Etude in vitro : effets des acides aristolochiques sur les cellules rénales d’opossum . . . 67
1.1. Culture des cellules OK . . . 67
1.2. Exposition des cellules OK à différentes substances . . . 67
1.2.1. Acides aristolochiques . . . 67
1.2.2. Cadmium . . . 68
1.2.3. Autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes . . 68
1.3. Réabsorption d’albumine et deβ2-microglobuline . . . 69
1.3.1. Compétition avec d’autres protéines . . . 69
1.4. Tests de cytotoxicité et de viabilité cellulaire . . . 70
1.4.1. Dosage de lactate déshydrogénase . . . 70
1.4.2. Dosage de 3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide (MTT) . . . 70
1.5. Observations en microscopie des cellules OK . . . 71
1.5.1. Microscopie conventionnelle . . . 71
1.5.2. Microscopie confocale . . . 71
1.6. Marquage des protéines à la [35S]L-méthionine . . . 72
1.7. Réabsorption de méthyl-α-D-glucopyranoside (AMG) . . . 73
1.8. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques . . 73
1.9. Analyse de l’expression de la mégaline dans les extraits cellulaires . . 74
1.10. Analyses statistiques . . . 75
2. Etude in vivo : effets de l’intoxication aux acides aristolochiques sur l’épithélium
tubulaire proximal de rat . . . 76
2.1. Conditionnement des rats Wistar . . . 76
2.2. Administration des acides aristolochiques aux rats . . . 76
2.2.1. Modèle initial de la néphropathie aux acides aristolochiques : rats traités pendant 35 jours . . . 77
2.2.2. Protocole court : rats traités pendant 5 jours . . . 77
2.2.3. Protocole destiné à des études histologiques particulières (10 jours)77 2.3. Prélèvement des urines, du sang et des reins . . . 78
2.4. Dosages de la créatinine plasmatique et urinaire . . . 79
2.5. Dosage de l’activité leucine aminopeptidase dans l’urine . . . 79
2.6. Dosage de l’activité endopeptidase neutre dans l’urine . . . 80
2.7. Dosage de l’activité N-acétyl-β-D-glucosaminidase dans l’urine . . . 81
2.8. Dosage et analyse des protéines urinaires . . . 81
2.9. Dosage d’albumine plasmatique et urinaire . . . 82
2.10. Dosage d’alpha-glutathion-S-transférase urinaire . . . 83
2.11. Dosages de sodium, potassium et glucose urinaire et plasmatique . . 83
2.12. Histologie rénale conventionnelle . . . 84
2.13. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre . . . 86
2.14. Immunomarquages de la mégaline et de la cubiline . . . 87
2.15. Microscopie électronique (étude préliminaire) . . . 88
2.16. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques dans le cortex rénal . . . 88
2.17. Analyses statistiques . . . 89
CHAPITRE 4 : RESULTATS . . . 90
1. Etude in vitro : effets des acides aristolochiques sur la lignée cellulaire de rein d’opossum . . . .. . . 90
1.1. Endocytose de protéines médiée par récepteur . . . . .. . . 90
1.1.1. Albumine . . . . .. . . .. . . 90
1.1.2. Autres protéines . . . . .. . . 92
1.1.3. β2-microglobuline . . . . .. . . 92
1.1.4. Compétition entre albumine etβ2-microglobuline . . . 92
1.2. Inhibition de la réabsorption d’albumine et de β2-microglobuline . . . 93
1.2.1. Effets des acides aristolochiques . . . 94
1.2.2. Effets du cadmium . . . 97
1.2.3. Observation de l’inhibition en microscopie confocale . . . 98
1.2.4. Réversibilité de l’inhibition . . . 99
1.3. Viabilité et fonctionnalité des cellules OK . . . 100
1.3.1. Tests de cytotoxicité et de viabilité cellulaire . . . 100
1.3.2. Synthèse des protéines . . . 102
1.3.3. Réabsorption du glucose . . . 103
1.4. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques . . 104
1.5. Expression de la mégaline . . . 106
1.5.1. Colocalisation avec l’albumine . . . 106
1.5.2. Effets des acides aristolochiques . . . 107
1.6. Effets d’autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes . . 108
2. Etude in vivo : effets de l’intoxication aux acides aristolochiques sur l’épithélium tubulaire proximal de rat . . . 109
2.1. Protocole long : rats traités pendant 35 jours . . . 109
2.1.1. Paramètres biologiques . . . 111
2.1.1.1. Créatinine plasmatique . . . 111
2.1.1.2. Protéines et enzymes urinaires . . . 111
2.1.1.3. Relations structure-fonction . . . 116
2.1.2. Observations histologiques . . . 116
2.1.2.1. Histologie conventionnelle . . . 116
2.1.2.2. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre . . . 118
2.1.2.3. Evaluation semi-quantitative des lésions morphologiques 119 2.1.3. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques dans le cortex rénal . . . 120
2.2. Protocole de suivi des paramètres urinaires : rats traités pendant 35 jours 121 2.2.1. Paramètres reflétant l’atteinte fonctionnelle . . . 122
2.2.2. Paramètres reflétant l’atteinte structurelle . . . 122
2.3. Protocole court : rats traités pendant 5 jours . . . 125
2.3.1. Paramètres biologiques . . . 126
2.3.1.1. Créatinine plasmatique . . . 126
2.3.1.2. Protéines et enzymes urinaires . . . 127
2.3.1.3. Relations structure-fonction . . . 130
2.3.2. Observations histologiques . . . 131
2.3.2.1. Histologie conventionnelle . . . 131
2.3.2.2. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre . . . 132
2.3.3. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques dans le cortex rénal . . . 134
2.4. Protocole destiné à des études histologiques particulières : rats traités pendant 10 jours . . . 136
2.4.1. Paramètres biologiques . . . 136
2.4.2. Immunomarquages de la mégaline et de la cubiline . . . 137
2.4.3. Microscopie électronique : résultats préliminaires . . . 138
CHAPITRE 5 : DISCUSSION ET CONCLUSIONS . . . 141
1. Discussion et conclusion de l’approche in vitro . . . 141
2. Discussion et conclusion de l’approche in vivo . . . 147
3. Conclusion générale et perspectives . . . 154
ANNEXE 1 : Sécrétion et réabsorption tubulaires des drogues et xénobiotiques 158 A.1. Transporteurs tubulaires anioniques (OAT) . . . 158
A.2. Transporteurs tubulaires cationiques (OCT) . . . 161
ANNEXE 2 : Effets des acides aristolochiques sur l’expression de protéines impliquées dans l’endocytose médiée par récepteur . . . 165
ARTICLES PUBLIES . . . 166 1. Aristolochic acid impedes endocytosis and induces DNA adducts in proximal tubule
cells. Kidney International 60: 1332-1342, 2001 . . . 166
2. Early proximal tubule injury in experimental aristolochic acid nephropathy: functional and histological studies. Nephrol Dial Transplant 20: 2321-2332, 2005 . . . 178
BIBLIOGRAPHIE . . . 191
THESE ANNEXE . . . 214 L’étude dans les cellules tubulaires proximales humaines en culture de l’effet des
ochratoxines (A, B, C) sur les agents médiateurs de l’apoptose, l’inflammation et la fibrose devrait permettre de caractériser les voies de signalisation des MAP-kinases impliquées dans le développement de la néphropathie tubulo-interstitielle
LISTE DES ABREVIATIONS
AA : Acides aristolochiques
AAI : Acide aristolochique de type I AAIa : Acide aristolochique de type Ia AAII : Acide aristolochique de type II ADN : Acide désoxyribonucléique AMC : 7-amino-4-méthyl-coumarine AMG : Méthyl-α-D-glucopyranoside AMP : Adénosine monophosphate ATP : Adénosine triphosphate BCA : Acide bicinchoninique BSA : Albumine sérique bovine
CHN : Chinese-herb nephropathy, Néphropathie aux plantes chinoises CPM : Coups par minute
CUB : Complement subcomponents C1r/C1s, epidermal growth factor-related sea urchin protein and bone morphogenic protein-1
Cy5 : Cyanine 5
dA-AAI : 7-(déoxyadénosine-N6-yl)aristolactame I dA-AAII : 7-(déoxyadénosine-N6-yl)aristolactame II DAB : 3, 3’-diaminobenzidine
Dab2 : Disabled protein 2
dG-AAI : 7-(déoxyguanosine-N2-yl)aristolactame I DMEM : Milieu Dubbelcco modifié selon Eagle DMSO : Sulfoxide diméthyle
EC : Enzyme Commission numbers ECL : Enhanced chemoluminescence EDTA : Acide tétraacétique éthylènediamine EGF : Epidermal growth factor
ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay FITC : Fluorescéine isothiocyanate
GST : Glutathion-S-transférase
HDL : High density lipoprotein, Lipoprotéine de haute densité HEPES : Acide N-(2-hydroxyéthyl)piperazine-N’-2-éthanesulphonique HPLC : Chromatographie liquide à haute performance (ou pression) HRP : Horseradish peroxidase
IGF-1 : Insulin-like growth factor 1
Km : Constante de Michaelis-Menten LAP : Leucine aminopeptidase
LDH : Lactate déshydrogénase
LDL : Low density lipoprotein, Lipoprotéine de faible densité LRP : Low density lipoprotein receptor related protein
MDR : Multidrug resistance protein
MOPS : Acide morpholinopropanesulphonique MRP : Multidrug resistance-associated proteins
MTT : 3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltétrazolium bromide NAD : Nicotinamide adénine dinucléotide
NAG : N-acétyl-β-D-glucosaminidase NaPi : Co-transporteur sodium/phosphate NEP : Endopeptidase neutre (EC 3.4.24.11) NHE3 : Echangeur sodium/hydrogène de type 3 OAT : Transporteurs d’anions organiques OCT : Transporteurs de cations organiques OK : Opossum kidney, Rein d’opossum PAH : Para-aminohippurate
PAI-1 : Plasminogen activator inhibitor-1 PAP : Pancreatitis associated protein-1 PAS : Acide periodique Schiff
PEG : Polyéthylène glycol PTH : Hormone parathyroïdienne
RAP : Receptor associated protein, Protéine associée au récepteur RBP : Retinol binding protein, protéine de liaison au rétinol
SDS : Dodécyl sulfate de sodium TBS : Tampon Tris salin
TGF-βββ1 : β Transforming growth factor β1 TMB : 3,3’,5,5’ tétraméthylbenzidine
tPA : Tissue plasminogen activator, Activateur tissulaire du plasminogène TRIC : Tétraméthylrhodamine isothiocyanate
VLDL : Very low density lipoprotein, Lipoprotéine de très faible densité Vmax : Vitesse maximale
RESUME
Les acides aristolochiques (AA) présents dans les aristoloches sont impliqués dans le développement d’une insuffisance rénale progressive chez l’homme, appelée néphropathie aux plantes chinoises (CHN). Elle se caractérise par une atrophie tubulaire sévère et une fibrose interstitielle associée à une fréquence élevée de cancers urothéliaux. L’observation en clinique d’une protéinurie tubulaire a suggéré que le tubule proximal était la cible des AA.
Le but des travaux présentés est d’explorer les premières altérations induites par les AA au niveau de la cellule tubulaire proximale.
L’approche in vitro montre que les AA inhibent de manière irréversible la réabsorption d’albumine par les cellules de rein d’opossum (OK). L’altération par les AA du processus d’endocytose médiée par récepteur s’expliquerait en partie par une diminution de l’expression de la mégaline.
L’approche in vivo confirme la survenue précoce d’altérations structurelles et fonctionnelles de l’épithélium tubulaire proximal dans le modèle de rat de la néphropathie aux AA. L’évolution de ces atteintes est biphasique : phase aiguë précoce suivie d’une phase chronique conduisant à une atrophie tubulaire majeure et une fibrose interstitielle. De plus, la diminution de l’expression de la mégaline et de la cubiline indique également que les AA interfèrent in vivo avec le mécanisme d’endocytose médiée par récepteur.
En conclusion, les résultats in vivo confirment les observations in vitro, selon lesquelles les AA induisent des altérations très précoces des cellules tubulaires proximales. Une meilleure compréhension, à l’aide de ces deux approches, des mécanismes physiopathologiques de l’atteinte tubulaire proximale précoce et de son évolution fournirait des informations clés pour comprendre le développement et la progression des maladies rénales aiguës et/ou chroniques.
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION
1. Le rein : généralités
Les reins sont au nombre de deux et situés entre le péritoine pariétal et la paroi postérieure de l’abdomen. Pour un homme adulte, chaque rein pèse entre 115 et 170 g et mesure en moyenne 10 à 12 cm de long, 5 à 7,5 cm de large et 2,5 cm d’épaisseur.
Les reins font partie de l’appareil urinaire : l’urine est excrétée de chaque rein par son uretère et accumulée dans la vessie avant d’être évacuée hors de l’organisme par l’urètre.
Une des fonctions principales du rein est de maintenir l’homéostasie de l’organisme en régulant la composition, le volume et la pression du sang. Pour y parvenir, le rein contrôle, par réabsorption, l’élimination du sel et de l’eau afin de maintenir la constance du volume et de l’osmolalité du compartiment extracellulaire.
Le rein participe également à la régulation de l’équilibre acide-base, à l’élimination des produits terminaux du métabolisme (par exemple : urée, acide urique) et des substances étrangères (par exemple : médicaments, toxines) mais aussi à la conservation simultanée des composants essentiels comme le glucose ou les acides aminés. Le fonctionnement physiologique du rein est sous la dépendance d’hormones, comme le système rénine-angiotensine-aldostérone qui participe au maintien de la pression sanguine. Le rein synthétise aussi l’érythropoïétine qui régule la capacité de transport de l’oxygène du sang via la stimulation de l’érythropoïèse.
Enfin, le rein joue également un rôle dans le catabolisme (exemple : la dégradation des protéines et des peptides) et la gluconéogenèse.
1.1. Unité anatomique, le néphron
La structure macroscopique des reins présente l’arrangement des néphrons (Fig. 1). Le parenchyme, partie fonctionnelle du rein, est composé d’une région externe, le cortex et une région interne, la médullaire. Le parenchyme rénal contient approximativement un million de structures microscopiques appelées néphrons qui constituent les unités fonctionnelles du rein. Les néphrons sont localisés pour la plus grande part dans le cortex mais aussi dans la médullaire.
Figure 1. Structure macroscopique du rein de mammifère. D’après Wheater P.R. et al.
[Wheater P.R. et al., 1979].
La médullaire est composée de structures triangulaires striées, les pyramides médullaires ou pyramides de Malpighi. Leur aspect strié s’explique par la présence de tubules droits et de vaisseaux sanguins. Les bases des pyramides font face au cortex, tandis que leurs sommets, les papilles rénales, sont orientés vers le centre du rein.
Hile
Le cortex est la région d’aspect lisse qui s’étend de la capsule rénale aux bases des pyramides et dans l’espace entre celles-ci. Le cortex se divise en une région corticale externe et une région juxta-médullaire interne.
Les calices majeurs ou mineurs sont des espaces en forme d’entonnoir, chaque petit calice reçoit l’urine des tubules collecteurs d’une pyramide et la déverse dans un grand calice. Les calices convergent pour former une grande cavité, le bassinet rénal. L’urine est évacuée vers la vessie par l’uretère.
L’artère et la veine rénale pénètrent et quittent le rein au-dessus de l’uretère au niveau du hile.
Le rein est entouré de 3 couches de tissus. La couche interne, la capsule fibreuse est une membrane fibreuse lisse et transparente qui est en continuité avec la couche externe de l’uretère au niveau du hile. La couche moyenne, la capsule adipeuse, est une masse de tissu adipeux qui entoure la capsule fibreuse. La couche externe, le fascia rénal, est une fine couche de tissu conjonctif dense irrégulier qui fixe le rein aux organes adjacents et à la paroi abdominale.
1.2. Unité fonctionnelle, le néphron
Le néphron est l’unité fonctionnelle du rein dont les trois fonctions principales sont : la filtration, la réabsorption et la sécrétion. Le néphron est constitué de deux parties principales : le corpuscule rénal ou glomérule rénal et le tubule rénal. (Fig. 2)
1.2.1. Le glomérule
Le glomérule rénal est la partie du néphron responsable de la filtration du sang. Il est composé de deux structures, la capsule de Bowman et le glomérule (Fig.
3).
Figure 2. Schéma des différentes subdivisions d’un rein de mammifère montrant la localisation des segments des néphrons par rapport aux parties du rein. D’après Maunsbach A.B. et al. [Maunsbach A.B. et al., 1992].
La capsule de Bowman est formée par une seule couche de cellules aplaties reposant sur une membrane basale et constitue le feuillet pariétal qui est en continuité avec l’épithélium bordant le tubule rénal.
Le glomérule est composé d’un réseau capillaire étroitement pelotonné qui s’invagine dans la capsule de Bowman et est enveloppé par une couche de cellules épithéliales, les podocytes, qui forment le feuillet viscéral de la capsule de Bowman.
GLOMERULUS
DISTAL CONVOLUTED TUBULE
DISTAL STRAIGHT TUBULE
(THICK ASCENDING LIMB OF HENLE’S LOOP)
ASCENDING THIN LIMB OF HENLE’S LOOP CONNECTING TUBULE
GLOMERULUS
DISTAL CONVOLUTED TUBULE
DISTAL STRAIGHT TUBULE
(THICK ASCENDING LIMB OF HENLE’S LOOP)
ASCENDING THIN LIMB OF HENLE’S LOOP CONNECTING TUBULE
Figure 3. Schéma des principales structures du glomérule de mammifère. [Wheater P.R. et al., 1979].
L’espace entre le feuillet pariétal et viscéral, appelé espace capsulaire, est en continuité avec la lumière du tubule rénal et constitue le pôle urinaire. A l’opposé, au pôle vasculaire, l’artériole afférente amène le sang au glomérule et le sang quitte le glomérule par l’artériole efférente après avoir circulé dans les capillaires.
Le mésangium, composé des cellules mésangiales et de la matrice mésangiale, est un autre élément important du glomérule. Les cellules mésangiales, apparentées aux monocytes, entourent les capillaires glomérulaires, leur fournissant un support structurel. Les cellules produisent la matrice extracellulaire, possédent une activité de phagocytose et sécrètent des prostaglandines, des peptides et des cytokines.
La fonction principale du glomérule est l’ultrafiltration du plasma au travers des capillaires glomérulaires. La barrière de filtration est composée de l’endothélium du capillaire, la membrane basale du capillaire et les podocytes. L’endothélium présente de nombreux pores ou fenestrations permettant à l’eau, aux protéines de petite taille et aux petites molécules de soluté comme le sodium, l’urée et le glucose, de passer
librement mais retenant les cellules. Comme les cellules endothéliales expriment des glycoprotéines chargées négativement à leur surface, la filtration des grosses protéines anioniques peut être retardée. La membrane basale du capillaire est une matrice poreuse de protéines extracellulaires présentant des charges négatives à sa surface, c’est une barrière de filtration importante pour les protéines plasmatiques.
Les podocytes possèdent de longs prolongements cytoplasmiques en forme de pieds, appelés pédicelles, qui entourent complètement la surface externe des capillaires. Les pédicelles entremêlés recouvrent la membrane basale, les espaces présents entre les pédicelles forment les fentes de filtration. Une membrane mince s’étend à la surface de ces fentes de filtration, empêchant le passage des protéines de taille moyenne (Fig. 4).
La structure de la barrière de filtration glomérulaire détermine la composition de l’ultrafiltrat du plasma. La barrière de filtration glomérulaire limite la filtration des molécules en fonction de leur taille et de leur charge électrique. En général, les molécules neutres de rayon inférieur à 20 Å sont filtrées librement, les molécules de rayon supérieur à 42 Å ne sont pas filtrées et les molécules comprises entre 20 et 42 Å sont filtrées à des degrés variables.
Le taux de filtration glomérulaire est de l’ordre de 120 ml/min, correspondant à environ 180 litres de plasma filtré par jour.
L’ultrafiltrat plasmatique ou l’urine primitive possède les mêmes concentrations en sels et en molécules organiques que le plasma.
1.2.2. Le tubule rénal
L’ultrafiltrat, contenu dans l’espace capsulaire, est déversé dans le tubule rénal qui s’étend de la capsule de Bowman jusqu’à sa jonction avec un tube collecteur. La première fonction du tubule rénal est la réabsorption sélective de l’eau, des ions inorganiques et d’autres molécules au départ de l’ultrafiltrat glomérulaire.
Le tubule rénal est bordé par une couche unique de cellules épithéliales et comporte trois segments principaux qui sont dans l’ordre : le tubule contourné proximal, l’anse de Henlé et le tubule contourné distal (Fig. 2).
Figure 4. Observation en microscopie électronique d’un glomérule (A, grossissement × 1440) et d’une anse d’un capillaire glomérulaire (B, grossissement × 7200). Vue en section longitudinale d’un capillaire glomérulaire (C, grossissement × 36000); sur la partie gauche, la distribution des charges négatives dans la paroi du capillaire glomérulaire est indiquée.
D’après Valtin H. [Valtin H., 1983].
Fentes de filtration Pédicelles
Podocyte
Espace de Bowman Pédicelles
Fentes de filtration Membrane basale
Lumière du capillaire Pore dans
l’endothélium 0,3 µm
C
Podocyte Anses capillaires Espace de Bowman
A B
Le tubule proximal est la partie du tubule attachée à la capsule glomérulaire et la plus longue. La portion initiale du tubule est contournée (tube contourné proximal, pars convoluta) et se prolonge par une section droite (pars recta). Le tubule proximal constitue l’essentiel du cortex rénal. Ce segment est plus longuement détaillé dans les pages suivantes (pages : 20-41).
L’anse de Henlé débute à la partie terminale de la pars recta sous forme d’une branche droite à paroi mince, la branche grêle descendante, et s’étend du cortex à la médullaire. Après formation d’une boucle en épingle à cheveux, l’anse de Henlé remonte dans le cortex rénal sous forme d’une branche fine ascendante (uniquement pour les néphrons avec de longues anses de Henlé) et d’une branche à paroi plus épaisse, la branche large ascendante.
Un petit segment de l’anse large ascendante est constitué de cellules spécialisées, la macula densa, qui jouxtent l’artériole afférente et efférente du néphron concerné. Les cellules de la macula densa contrôlent la concentration en sel (NaCl) dans le liquide de la lumière du tubule.
L’anse de Henlé a pour fonction de produire un gradient osmotique du cortex au sommet de la médullaire rénale. La forte pression osmotique des liquides extracellulaires et la présence de l’hormone antidiurétique permettent la sortie de l’eau par osmose à partir du liquide contenu dans les tubules connecteurs et les tubes collecteurs. L’anse de Henlé et l’hormone antidiurétique sont donc responsables de la production d’une urine qui est hypertonique par rapport au plasma.
Le tubule distal débute par une portion droite qui correspond à la branche large ascendante de l’anse de Henlé et se prolonge par une partie contournée.
Le tubule distal a pour rôle essentiel de réabsorber les ions sodium du liquide tubulaire. Ce processus, directement lié à la sécrétion d’ions hydrogène et potassium dans le fluide tubulaire, est sous le contrôle de l’aldostérone, une hormone sécrétée par le cortex surrénalien.
Le tubule connecteur relie ensuite le tubule distal au tubule collecteur. Le tubule collecteur se subdivise en une partie corticale et une partie médullaire : le
tubule collecteur de la médullaire externe suivi du tubule collecteur de la médullaire interne.
Les tubes collecteurs deviennent perméables à l’eau en présence d’hormone antidiurétique sécrétée par l’hypophyse. L’eau est alors attirée vers l’extérieur en raison de la forte pression osmotique des fluides extracellulaires médullaires.
1.2.3. La vascularisation rénale
Le débit sanguin rénal, assuré par les artères rénales, représente 20 à 25 % du débit cardiaque, soit environ 1200 ml/min. L’artère rénale se divise en cinq artères segmentaires afin d’irriguer les différents segments rénaux. Chaque artère segmentaire se ramifie en artères interlobaires, qui pénètrent le parenchyme et passent entre les pyramides rénales. A la jonction cortico-médullaire, les artères interlobaires deviennent arquées, elles se divisent en une série d’artères interlobulaires, lesquelles s’enfoncent dans le cortex et se ramifient en artérioles afférentes. L’artériole afférente se scinde pour former les capillaires glomérulaires qui ensuite fusionnent pour constituer l’artériole efférente à la sortie du glomérule.
Chaque artériole efférente d’un néphron cortical se ramifie en un réseau de capillaires péritubulaires autour des tubules contournés proximal et distal. L’artériole efférente d’un néphron juxta-médullaire se divise également en capillaires péritubulaires ainsi qu’en vaisseaux en forme de boucle allongée, les vasa recta, qui descendent le long de l’anse de Henlé dans la médullaire (Fig. 5).
Les capillaires péritubulaires se réunissent pour former les veinules péritubulaires, puis successivement les veines interlobulaires, les veines arquées, les veines interlobaires, les veines segmentaires et la veine rénale qui sort du rein au hile.
Figure 5. A. Vascularisation artérielle rénale (coupe longitudinale d’un rein de lapin). 1 : artère rénale, 2 : artère interlobaire, 3 : artère arquée, 4: artères interlobulaires. B.
Vascularisation artérielle du cortex et de la médulaire externe (coupe longitudinale d’un rein de lapin). D’après INSERM [INSERM., 1980]. C. Schéma de la vascularisation rénale.
D’après Kriz W. et al. [Kriz W. et al., 1988].
A
Vasa recta Glomérule
Artères interlobulaires
B
C
MR = medullary ray CL = cortical labyrinth OS = outer stripe IS = inner stripe IM = inner medulla P = renal pelvis
2. Le tubule proximal
Le tubule proximal réabsorbe environ 99 % du volume de l’ultrafiltrat glomérulaire (environ 178 l par jour), contenant des sels, du glucose, des acides aminés, des vitamines, des protéines et d’autres nutriments ainsi que des produits du métabolisme. Les constituants réabsorbés de l’ultrafiltrat retournent ensuite dans le sang à travers la paroi du tubule. La portion restante de l’ultrafiltrat (1 %, environ 1,5 l par jour) est excrétée sous forme d’urine. Le tubule proximal réabsorbe au départ de l’ultrafiltrat 65 % d’eau, de Na+ et K+, 60 % de Ca2+, 15 % de Mg2+, 55 % de Cl-, 93 % de bicarbonate, 65 % de phosphate, 96 % du glucose, presque 100 % des protéines.
Ces protéines, dites de faible poids moléculaire, correspondent entre autres à la β2- microglobuline, l’α1-microglobuline, l’α2-microglobuline, la protéine de liaison à la vitamine D, la protéine de liaison au rétinol, la protéine des cellules de Clara (d’origine pulmonaire), le lysozyme ainsi que l’albumine.
Les protéines sont réabsorbées à la membrane apicale des cellules épithéliales du tubule proximal par un processus complexe et spécifique : l’endocytose médiée par récepteur. Après l’endocytose, les protéines sont dégradées par la voie lysosomale, les acides aminés produits ainsi que les autres substances réabsorbées sont transportées au travers de la membrane basolatérale de la cellule et retournent dans les capillaires rénaux (Fig. 6).
Figure 6. Schéma de la fonction tubulaire proximale: la réabsorption de l’ultrafiltrat glomérulaire par une cellule tubulaire proximale. D’après Christensen EI et al. [Christensen E.I. et al., 2002]
Apical membrane
Basolateral membrane
L’altération de ce mécanisme de réabsorption tubulaire augmente le taux de protéines dans l’urine, conduisant à une protéinurie dite tubulaire.
2.1. L’épithélium tubulaire proximal
Les cellules épithéliales du tubule proximal sont des cellules polarisées possédant une membrane apicale ou luminale, -côté urine-, qui se distingue très nettement d’un point de vue fonctionnel de la membrane basale située côté sanguin.
D’un point de vue structurel, la membrane apicale présente des microvillosités, dont l’ensemble forme la bordure en brosse, augmentant significativement la surface de la membrane.
Chez la plupart des espèces de mammifères, le tubule proximal se subdivise en 3 segments en fonction de la structure des cellules tubulaires proximales. Les deux premiers segments sont principalement localisés dans la partie contournée (pars convoluta) et le troisième constitue la majeure partie de la section droite (pars recta).
Chez le rat, le premier segment S1 se compose du début de la partie contournée, le second segment S2 consiste en la fin de la partie contournée et le tout début de la section droite, et le troisième segment S3 comprend le reste de la section droite. Les cellules du segment S1 sont plus grandes, les microvillosités de la bordure en brosse plus longues et les vacuoles apicales d’endocytose plus nombreuses que dans le segment S2. Au niveau du segment S3, les microvillosités de la bordure en brosse sont plus longues que pour les segments S1 et S2. Les mitochondries des cellules du segment S3 sont plus petites, moins nombreuses et dispersées de manière plus aléatoire que dans les deux autres segments, et ne présentent pas une association étroite avec la membrane plasmique (Fig. 7).
Figure 7. Schéma de l’ultrastructure de l’épithélium de chacun des 3 segments du tubule proximal chez le rat (S1 à S3), illustrant les différences d’organisation cellulaire et de distribution des mitochondries (M), lysosomes (L) vacuoles d’endocytose (E) et peroxisomes (P). [Maunsbach A.B. et al., 1992]
2.2. Réabsorption tubulaire
2.2.1. Réabsorption du sodium
Les ions sodium sont réabsorbés dans chaque partie du tubule rénal par des systèmes de transport qui permettent non seulement de récupérer le sodium filtré par le glomérule mais aussi l’eau, les anions et les nutriments. D’autre part, ces systèmes de transport entraînent parfois la sécrétion de substances inutiles telles que les ions H+ et K+ excédentaires.
La concentration intracellulaire du sodium inférieure à la concentration extracellulaire ainsi que le potentiel intracellulaire négatif induisent un gradient électrochimique permettant aux ions sodium contenus dans l’ultrafiltrat de rentrer par diffusion passive dans la cellule au travers de la bordure en brosse de la membrane apicale.
Simultanément, la pompe Na+/K+-ATPase située à la membrane basale expulse du Na+ hors de la cellule, tout en introduisant du K+ dans la cellule. Les ions K+ étant plus concentrés à l’intérieur de la cellule qu’à l’extérieur, le K+ diffuse à l’extérieur de la cellule par des canaux (Fig. 8).
Figure 8. Schéma de la réabsorption du sodium par la cellule tubulaire proximale du rein de mammifère. Le sodium entre dans la cellule par diffusion passive à la membrane apicale et est transporté à la membrane basale par la pompe Na+/K+-ATPase. Le potassium est expulsé de la cellule par les canaux K+.
Le transport actif primaire de sodium par la pompe Na+/K+-ATPase favorise la réabsorption de l’eau par osmose. Par conséquent, la concentration d’autres solutés est augmentée dans l’ultrafiltrat favorisant ainsi la réabsorption par diffusion facilitée des ions K+, Cl- et HCO3-
.
2.2.2. Réabsorption des nutriments
Figure 9. Schéma de la réabsorption des nutriments par la cellule tubulaire proximale du rein de mammifère. Le glucose est réabsorbé par le symporteur sodium-glucose.
Apical Basolatéral
Na+ Na+ Na+ Na+
K+ K+
K+
H2O H2O H2O
ADPATP
Cl-, HCO3- urée
Cl-, HCO3- urée
Apical Basolatéral
Na+ Na+ Na+ Na+
K+ K+
K+
H2O H2O H2O
ADPATP
Cl-, HCO3- urée
Cl-, HCO3- urée
Apical Basolatéral
Na+ Na+
Na+ Na+
K+ K+
K+
ADPATP
glucose glucose
Apical Basolatéral
Na+ Na+
Na+ Na+
K+ K+
K+
ADPATP
glucose glucose
Le glucose filtré, les acides aminés, l’acide lactique et d’autres métabolites sont réabsorbés par les symporteurs de sodium, qui fonctionnent par transport actif secondaire. Un symporteur sodium-glucose achemine un ion Na+ et une molécule de glucose à l’intérieur de la cellule et la pompe à sodium permet de maintenir la concentration intracellulaire faible en ions Na+. La réabsorption des nutriments entraîne également la réabsorption d’eau par osmose (Fig. 9).
2.3. Sécrétion tubulaire
Les métabolites de l’organisme comme l’acide urique, le glucuronide, l’hippurate, les sulfates ainsi que des substances exogènes (pénicilline, diurétiques, acide para-aminohippurique) parviennent dans l’urine tubulaire par sécrétion transcellulaire. D’autres substances, comme l’ammoniaque et les ions H+, sont uniquement produites par le métabolisme de la cellule tubulaire et parviennent dans le tubule par sécrétion cellulaire.
La sécrétion tubulaire a pour fonction d’éliminer certaines substances de l’organisme et de réguler le pH. Les substances sécrétées sont les ions K+, H+ et NH4+
, la créatinine et des médicaments (exemple : la pénicilline) et l’acide para- aminohippurique.
2.3.1. Sécrétion d’hydrogène
La sécrétion des ions H+ est effectuée par les antiporteurs Na+/H+ situés à la membrane apicale. Ces systèmes de transport actif secondaire dépendent de la pompe à sodium afin de maintenir la concentration intracellulaire de sodium faible.
2.3.2. Sécrétion d’ammonium
Les cellules tubulaires produisent également de l’ammoniaque en désaminant des acides aminés. La plus grande partie de l’ammoniaque s’associe à des ions H+ pour former des ions ammonium qui sont sécrétés par des antiporteurs Na+/NH4+
.
2.4. Endocytose médiée par récepteur
L’endocytose est un processus universel qui consiste pour une cellule à internaliser, par un système de vésicules, des composants du milieu extérieur. Par ce mécanisme, les cellules épithéliales polarisées de la membrane apicale du tubule proximal réabsorbent les protéines plasmatiques qui n’ont pas été retenues par la barrière de filtration glomérulaire.
L’épithélium tubulaire est caractérisé par la présence d’un appareillage d’endocytose particulièrement bien développé (Fig. 10). Les nombreuses invaginations de la membrane apicale à la base des microvillosités de la bordure en brosse donnent naissance à des puits recouverts d’un manteau de clathrine. Ces puits se referment pour former des vésicules intracytoplasmiques, des petits endosomes ou préendosomes (< 0,5 µm) ainsi que des grands endosomes (> 0,5 µm) possédant ou non un manteau de clathrine. Des tubules apicaux denses intracytoplasmiques sont liés aux petits ou aux grands endosomes ou circulent librement dans le cytoplasme en direction de la membrane apicale. Ces tubules apicaux denses permettent le recyclage des protéines membranaires à la membrane apicale. Les lysosomes vont ensuite digérer les protéines en acides aminés [Christensen E.I. et al., 1998].
Deux récepteurs multiligands, la mégaline et la cubiline, sont exprimés à la membrane apicale des cellules épithéliales au niveau de la bordure en brosse et plus particulièrement dans les espaces intermicrovillaires. Les ligands liés au complexe mégaline-cubiline sont internalisés dans les puits à clathrine qui se referment pour former les vésicules recouvertes de clathrine. L’acidification des endosomes par la
présence d’une pompe à proton, la proton ATPase type V et d’un canal chlore ClC5 [Marshansky V. et al., 1997; Marshansky V. et al., 2002] entraîne la perte du manteau de clathrine ainsi que la dissociation du complexe ligand-récepteur. Les tubules apicaux denses assurent le recyclage de la mégaline et de la cubiline vers la membrane apicale. Les ligands sont transférés vers les prélysosomes puis les lysosomes où ils sont dégradés.
Figure 10. Schéma d’une cellule épithéliale absorptive présentant les mécanismes possibles par lesquels la mégaline peut médier l’endocytose et le transport transcellulaire. [Christensen E.I. et al., 2002].
Partie de gauche: La mégaline facilite l’endocytose de la cubiline par liaison à ce récepteur.
Les vitamines et le fer qui forment un complexe avec une protéine de transport ainsi que les protéines se lient à la mégaline et/ou la cubiline pour être endocytosés. Les ligands se dissocient des récepteurs sous l’action du faible pH dans les endosomes et les récepteurs sont recyclés à la bordure en brosse par les tubules apicaux denses. Les composés protéiniques sont dégradés alors que les vitamines et le fer sont transportés au travers de la cellule épithéliale (mécanisme inconnu).
La partie de droite du schéma montre le transport transcellulaire médié par la mégaline pour des protéines spécifiques comme la thyroglobuline [Marino M. et al., 2000] et la protéine de liaison au rétinol [Marino M. et al., 2001].
Coated vesicles
2.4.1. Mégaline et cubiline
Structure et ligands
La mégaline et la cubiline sont deux glycoprotéines de haut poids moléculaire dont les caractéristiques principales sont reprises dans le Tableau 1. Ces deux récepteurs ont une structure très différente : la mégaline est une protéine transmembranaire contrairement à la cubiline qui est une protéine membranaire périphérique ne possédant pas de domaine transmembranaire (Fig. 11).
Tableau 1 : Caractéristiques de la mégaline et de la cubiline
Mégaline Cubiline gp330
antigène de la néphrite d’Heymann [Kerjaschki D. et al., 1982]
gp280
récepteur du complexe facteur intrinsèque gastrique/cobalamine
[Seetharam B. et al., 1997]
600 kDa 460 kDa
Glycoprotéine récepteur transmembranaire constituée d’un grand domaine extracellulaire amino-terminal, un seul domaine transmembranaire et d’une petite extrémité cytoplasmique carboxy-terminale
[Saito A. et al., 1994]
Glycoprotéine périphérique de la membrane qui ne possède pas de domaine
transmembranaire ni d’ancre glycosylphosphatidyinositol. La région
amino-terminale (100 résidus) est probablement nécessaire à l’association du
récepteur à la membrane plasmique.
[Kristiansen M. et al., 1999]
Les séquences complètes d’ADN complémentaire ont été déterminées chez le
rat [Saito A. et al., 1994] et chez l’homme [Hjalm G. et al., 1996] et présentent 77 %
d’identité.
Les séquences complètes d’ADN complémentaire ont été caractérisées pour le rat [Moestrup S.K. et al., 1998a], l’homme [Kozyraki R. et al., 1998] et le chien [Xu D. et al., 1999]. Homologie de séquence de 70 %.
Gène humain localisé sur le chromosome 2q24-q31
[Korenberg J.R. et al., 1994]
Gène humain localisé sur le chromosome 10p12.33-p13
[Kozyraki R. et al., 1998]
Appartient à la famille des lipoprotéines récepteurs de faible densité [Raychowdhury R. et al., 1989]
Figure 11. Structure de la mégaline et de la cubiline. D’après Christensen EI et al.
[Christensen E.I. et al., 2002]
La mégaline est constituée d’un grand domaine extracellulaire (~ 4400 acides aminés) composé de 4 groupements riches en cystéine de type A « repeats » des récepteurs des lipoprotéines de faible densité (LDL) qui correspondent aux régions de liaison des ligands [Hjalm G. et al., 1996; Korenberg J.R. et al., 1994;
Raychowdhury R. et al., 1989; Saito A. et al., 1994]. Ces régions sont séparées par 17 domaines EGF (epidermal growth factor) de type « repeats » et de 8 régions d’espacement pauvres en cystéine contenant des motifs YWTD qui interviennent dans la libération des ligands dépendant du pH dans les endosomes [Davis C.G. et al., 1987]. Un seul domaine transmembranaire (22 acides aminés) est suivi de l’extrémité cytoplasmique (213 acides aminés) constituée de 2 séquences NPXY qui permettent l’internalisation des puits de clathrine [Chen W.J. et al., 1990] et une séquence ressemblant au motif NPXY.
La cubiline est principalement composée d’un domaine extracellulaire composé de 27 domaines CUB (complement subcomponents C1r/C1s, EGF-related sea urchin protein and bone morphogenic protein-1) qui permettent l’interaction avec plusieurs protéines [Kristiansen M. et al., 1999; Kristiansen M. et al., 2000]. Les domaines CUB sont précédés d’une séquence de 110 acides aminés suivie de 8 domaines EGF de type « repeats ». La région amino-terminale comporte un site
Apical plasma membrane
potentiel de palmitoylation et une structure aliphatique en hélice alpha. Ces deux structures semblent contribuer à l’ancrage du récepteur dans la membrane [Kristiansen M. et al., 1999].
La structure de la cubiline présente très peu d’homologie avec d’autres récepteurs connus d’endocytose tandis que la mégaline appartient à la famille des récepteurs LDL (Fig. 12). L’étroite homologie entre la structure de la mégaline et du récepteur d’endocytose chez le nématode Caenorhabditis elegans indique que cette protéine est fortement conservée au cours de l’évolution [Yochem J. et al., 1993].
Figure 12. Superfamille des récepteurs LDL (low density lipoprotein) montrant les homologies de structure entre les membres de cette famille: récepteur LDL, récepteur VLDL (very low density lipoprotein), récepteur 2 de l’apolipoprotéine E, LRP (LDL receptor related protein), la mégaline et le récepteur chez Caenorhabditis elegans. [Christensen E.I. et al., 1999b].
La cubiline ne possède pas de site d’interaction avec les protéines adaptatrices ou d’autres médiateurs de l’endocytose dépendante de la clathrine ; une liaison de haute affinité, calcium dépendante, et partiellement inhibée par la protéine associée au récepteur (RAP) a été décrite entre la cubiline et la mégaline in vitro. La mégaline semble donc médier l’endocytose et le transport intracellulaire de la cubiline [Moestrup S.K. et al., 1998a]. En plus de cette interaction directe entre les deux récepteurs, la mégaline et la cubiline ont plusieurs ligands en commun (Tableau 2). La co-localisation entre la mégaline et la cubiline ainsi que
l’internalisation de l’albumine médiée par la mégaline et la cubiline sont décrites dans le tubule proximal chez la souris (Fig. 13) [Christensen E.I. et al., 2004] et dans les cellules tubulaires proximales de rein d’opossum [Zhai X.Y. et al., 2000].
Figure 13. Colocalisation de la mégaline, cubiline et de l’albumine à la membrane apicale des cellules tubulaires proximales de souris. D’après Christensen EI et al. [Christensen E.I.
et al., 2004].
A. Double marquage en immunofluorescence de la mégaline (vert) et de la cubiline (rouge).
La couleur jaune illustre la colocalisation de la mégaline et de la cubiline au niveau de l’épithélium apical des cellules. B. Double marquage en immunofluorescence de la mégaline (vert) et de l’albumine (rouge). La couleur jaune correspond à la colocalisation de la mégaline et de l’albumine à la membrane apicale des cellules. Barre = 10 µm.
Expression et régulation
La mégaline et la cubiline sont exprimées au niveau de la membrane plasmique et de l’appareillage d’endocytose des cellules épithéliales (Tableau 3).
Elles sont co-exprimées par plusieurs épithéliums d’absorption comme l’intestin grêle [Birn H. et al., 1997; Levine J.S. et al., 1984], le tubule proximal rénal [Chatelet F. et al., 1986a; Kerjaschki D. et al., 1982; Sahali D. et al., 1988; Seetharam B. et al., 1988], le feuillet viscéral du sac vitellin [Chatelet F. et al., 1986b; Sahali D. et al., 1988] et le cytotrophoblaste placentaire [Juhlin C. et al., 1990; Sahali D. et al., 1992].
La mégaline semble être plus largement distribuée que la cubiline ; elle est entre autre présente au niveau des podocytes glomérulaires de rat [Kerjaschki D. et al., 1982].
Tableau 2 : Ligands de la mégaline et de la cubiline [Christensen E.I. et al., 2002]
Mégaline Cubiline Protéines de liaison des vitamines
Transcobalamine – vitamine B12 [Moestrup S.K. et al., 1996]
Protéine de liaison de la vitamine D [Nykjaer A. et al., 1999]
Protéine de liaison du rétinol [Christensen E.I. et al., 1999a]
Facteur intrinsèque – vitamine B12 [Seetharam B. et al., 1997]
Protéine de liaison de la vitamine D [Nykjaer A. et al., 2001]
Autres protéines de transport Albumine [Cui S. et al., 1996; Zhai X.Y. et al., 2000]
Lactoferrine [Willnow T.E. et al., 1992]
Hémoglobine [Gburek J. et al., 2002]
Myoglobine [Gburek J. et al., 2003]
Odorant-binding protein [Leheste J.R. et al., 1999]
Transthyrétine [Sousa M.M. et al., 2000]
Albumine [Birn H. et al., 2000a; Zhai X.Y. et al., 2000]
Transferrine [Kozyraki R. et al., 2001]
Hémoglobine [Gburek J. et al., 2002]
Myoglobine [Gburek J. et al., 2003]
Lipoprotéines Apolipoprotéine B [Stefansson S. et al., 1995a]
Apolipoprotéine E [Willnow T.E. et al., 1992]
Apolipoprotéine J/clusterine [Kounnas M.Z. et al., 1995]
Apolipoprotéine H [Moestrup S.K. et al., 1998b]
Apolipoprotéine A-I [Kozyraki R. et al., 1999]
HDL (high density lipoprotein) [Hammad S.M. et al., 1999]
Hormones et hormones précurseurs Hormone parathyroïdienne [Hilpert J. et al., 1999]
Insuline [Orlando R.A. et al., 1998]
EGF [Orlando R.A. et al., 1998]
Prolactine [Orlando R.A. et al., 1998]
Thyroglobuline [Zheng G. et al., 1998]
Drogues et toxines Aminoglycosides [Moestrup S.K. et al., 1995]
Polymyxine B [Moestrup S.K. et al., 1995]
Aprotinine [Moestrup S.K. et al., 1995]
Trichosanthine [Chan W.L. et al., 2000]
Enzymes et inhibiteurs d’enzymes PAI-1 [Stefansson S. et al., 1995b]
PAI-1-urokinase [Moestrup S.K. et al., 1993]
PAI-1-tPA [Moestrup S.K. et al., 1993; Willnow T.E. et al., 1992]
Pro-urokinase [Stefansson S. et al., 1995b]
Lipoprotéine lipase [Kounnas M.Z. et al., 1993]
Plasminogène [Kanalas J.J. et al., 1993]
β-amylase [Birn H. et al., 2000b]
α1-microglobuline [Leheste J.R. et al., 1999]
Lysozyme [Orlando R.A. et al., 1998]
Protéines apparentées à la réponse immune et de stress Chaînes légères des immunoglobulines [Birn H. et al., 2002]
PAP-1 [Leheste J.R. et al., 1999]
β2-microglobuline [Orlando R.A. et al., 1998]
Chaînes légères des immunoglobulines [Batuman V. et al., 1998]
Protéine sécrétée par les cellules de Clara [Burmeister R. et al., 2001]
Autres RAP [Christensen E.I. et al., 1992; Kanalas J.J. et al., 1993; Kounnas M.Z. et al., 1992; Orlando R.A. et al., 1998; Willnow T.E. et al., 1992]
Ca2+ [Christensen E.I. et al., 1992]
Cytochrome c [Orlando R.A. et al., 1998]
RAP [Birn H. et al., 1997]
Tableau 3 : Expression de la mégaline et de la cubiline [Christensen E.I. et al., 2002; Moestrup S.K. et al., 2001]
Organe Mégaline Cubiline Références
Rein : tubule proximal + + [Chatelet F. et al., 1986a; Kerjaschki D. et al., 1982; Sahali D. et al., 1988;
Seetharam B. et al., 1988]
Rein : podocytes du glomérule (chez le rat
uniquement) + - [Kerjaschki D. et al., 1982]
Intestin grêle + + [Birn H. et al., 1997; Levine J.S. et al., 1984]
Poumons : pneumocytes de type II + - [Chatelet F. et al., 1986b; Kounnas M.Z. et al., 1994; Zheng G. et al., 1994]
Thyroïde + - [Kounnas M.Z. et al., 1994; Zheng G. et al., 1994]
Thymus + + [Hammad S.M. et al., 2000]
Cellules sécrétant l’hormone parathyroïdienne
de la glande parathyroïde + - [Juhlin C. et al., 1987; Zheng G. et al., 1994]
Cellules de l’épendyme + - [Zheng G. et al., 1994]
Epithélium ciliaire de l’oeil + - [Lundgren S. et al., 1997; Zheng G. et al., 1994]
Epithélium de l’oreille interne + - [Kounnas M.Z. et al., 1994; Mizuta K. et al., 1999]
Plexus choroïdes + - [Kounnas M.Z. et al., 1994]
Oviductes + - [Zheng G. et al., 1994]
Muqueuse utérine + + [Zheng G. et al., 1994]
Epididyme + - [Chatelet F. et al., 1986b; Zheng G. et al., 1994]
Feuillet viscéral du sac vitellin + + [Chatelet F. et al., 1986b; Sahali D. et al., 1988]
Cytotrophoblaste placentaire + + [Juhlin C. et al., 1990; Sahali D. et al., 1992]
Endomètre + - [Bernadotte F. et al., 1989; Sahali D. et al., 1992]
Trophectoderme + - [Sahali D. et al., 1993]
Dans les cellules du tubule proximal rénal et du feuillet viscéral du sac vitellin, la mégaline et la cubiline sont co-localisées tout au long de l’appareillage d’endocytose [Christensen E.I. et al., 1992; Kerjaschki D. et al., 1984; Sahali D. et al., 1988] incluant la bordure en brosse, les puits recouverts d’un manteau de clathrine, les vésicules endocytaires et les tubules apicaux denses [Christensen E.I.
et al., 1998] (Fig. 14).
Figure 14. Expression de la mégaline et de la cubiline dans l’appareillage endocytaire de la membrane apicale des cellules tubulaires proximales du rein de rat. D’après Christensen EI et al. [Christensen E.I. et al., 2002].
Les récepteurs sont identifiés par immunocytochimie sur une cryosection de cortex rénal de rat à l’aide d’un anticorps de mouton anti-mégaline de rat marqué par un anticorps secondaire anti-mouton couplé à des particules d’or de 5 nm, et d’un anticorps de lapin anti- cubiline de rat marqué par un anticorps secondaire anti-lapin couplé à des particules d’or de 10 nm. Les récepteurs sont coexprimés sur les microvillosités (MV), dans les puits recouverts d’un manteau de clathrine à la membrane apicale (CP, coated pits), dans les endosomes (E) et dans les tubules apicaux denses. Barre = 300 nm.
L’expression de la mégaline et de la cubiline in vitro est stimulée par l’acide rétinoïque et le dibutyryl cyclique AMP, l’expression de la mégaline par la vitamine D [Hammad S.M. et al., 1999; Liu W. et al., 1998; Stefansson S. et al., 1995a].
Une augmentation de l’expression de la mégaline est observée dans les reins de rats atteints de la néphrite d’Heymann, maladie glomérulaire expérimentale induite par des autoanticorps dirigés contre la mégaline [Makker S.P. et al., 1995].
Les cellules neuronales, touchées dans la maladie d’Alzheimer, sont caractérisées par un dépôt extracellulaire de protéines β-amyloïdes ; parallèlement, ces neurones
