CHAPITRE 1 : INTRODUCTION
2. Le tubule proximal
2.4. Endocytose médiée par récepteur
2.4.1. Mégaline et cubiline
Structure et ligands
La mégaline et la cubiline sont deux glycoprotéines de haut poids moléculaire dont les caractéristiques principales sont reprises dans le Tableau 1. Ces deux
récepteurs ont une structure très différente : la mégaline est une protéine
transmembranaire contrairement à la cubiline qui est une protéine membranaire périphérique ne possédant pas de domaine transmembranaire (Fig. 11).
Tableau 1 : Caractéristiques de la mégaline et de la cubiline
Mégaline Cubiline
gp330
antigène de la néphrite d’Heymann [Kerjaschki D. et al., 1982]
gp280
récepteur du complexe facteur intrinsèque gastrique/cobalamine
[Seetharam B. et al., 1997]
600 kDa 460 kDa
Glycoprotéine récepteur transmembranaire constituée d’un grand domaine extracellulaire amino-terminal, un seul domaine transmembranaire et d’une petite extrémité cytoplasmique carboxy-terminale
[Saito A. et al., 1994]
Glycoprotéine périphérique de la membrane qui ne possède pas de domaine
transmembranaire ni d’ancre glycosylphosphatidyinositol. La région
amino-terminale (100 résidus) est probablement nécessaire à l’association du
récepteur à la membrane plasmique. [Kristiansen M. et al., 1999]
Les séquences complètes d’ADN complémentaire ont été déterminées chez le
rat [Saito A. et al., 1994] et chez l’homme [Hjalm G. et al., 1996] et présentent 77 %
d’identité.
Les séquences complètes d’ADN complémentaire ont été caractérisées pour le rat [Moestrup S.K. et al., 1998a], l’homme [Kozyraki R. et al., 1998] et le chien [Xu D. et al., 1999]. Homologie de séquence de 70 %.
Gène humain localisé sur le chromosome 2q24-q31
[Korenberg J.R. et al., 1994]
Gène humain localisé sur le chromosome 10p12.33-p13
[Kozyraki R. et al., 1998] Appartient à la famille des lipoprotéines
récepteurs de faible densité [Raychowdhury R. et al., 1989]
Figure 11. Structure de la mégaline et de la cubiline. D’après Christensen EI et al. [Christensen E.I. et al., 2002]
La mégaline est constituée d’un grand domaine extracellulaire (~ 4400 acides aminés) composé de 4 groupements riches en cystéine de type A « repeats » des récepteurs des lipoprotéines de faible densité (LDL) qui correspondent aux régions de liaison des ligands [Hjalm G. et al., 1996; Korenberg J.R. et al., 1994; Raychowdhury R. et al., 1989; Saito A. et al., 1994]. Ces régions sont séparées par 17 domaines EGF (epidermal growth factor) de type « repeats » et de 8 régions d’espacement pauvres en cystéine contenant des motifs YWTD qui interviennent dans la libération des ligands dépendant du pH dans les endosomes [Davis C.G. et al., 1987]. Un seul domaine transmembranaire (22 acides aminés) est suivi de l’extrémité cytoplasmique (213 acides aminés) constituée de 2 séquences NPXY qui permettent l’internalisation des puits de clathrine [Chen W.J. et al., 1990] et une séquence ressemblant au motif NPXY.
La cubiline est principalement composée d’un domaine extracellulaire composé de 27 domaines CUB (complement subcomponents C1r/C1s, EGF-related sea urchin protein and bone morphogenic protein-1) qui permettent l’interaction avec plusieurs protéines [Kristiansen M. et al., 1999; Kristiansen M. et al., 2000]. Les domaines CUB sont précédés d’une séquence de 110 acides aminés suivie de 8 domaines EGF de type « repeats ». La région amino-terminale comporte un site
potentiel de palmitoylation et une structure aliphatique en hélice alpha. Ces deux structures semblent contribuer à l’ancrage du récepteur dans la membrane [Kristiansen M. et al., 1999].
La structure de la cubiline présente très peu d’homologie avec d’autres récepteurs connus d’endocytose tandis que la mégaline appartient à la famille des récepteurs LDL (Fig. 12). L’étroite homologie entre la structure de la mégaline et du
récepteur d’endocytose chez le nématode Caenorhabditis elegans indique que cette
protéine est fortement conservée au cours de l’évolution [Yochem J. et al., 1993].
Figure 12. Superfamille des récepteurs LDL (low density lipoprotein) montrant les
homologies de structure entre les membres de cette famille: récepteur LDL, récepteur VLDL (very low density lipoprotein), récepteur 2 de l’apolipoprotéine E, LRP (LDL receptor related protein), la mégaline et le récepteur chez Caenorhabditis elegans. [Christensen E.I. et al., 1999b].
La cubiline ne possède pas de site d’interaction avec les protéines adaptatrices ou d’autres médiateurs de l’endocytose dépendante de la clathrine ; une liaison de haute affinité, calcium dépendante, et partiellement inhibée par la protéine
associée au récepteur (RAP) a été décrite entre la cubiline et la mégaline in vitro. La
mégaline semble donc médier l’endocytose et le transport intracellulaire de la cubiline [Moestrup S.K. et al., 1998a]. En plus de cette interaction directe entre les deux récepteurs, la mégaline et la cubiline ont plusieurs ligands en commun (Tableau 2). La co-localisation entre la mégaline et la cubiline ainsi que
l’internalisation de l’albumine médiée par la mégaline et la cubiline sont décrites dans le tubule proximal chez la souris (Fig. 13) [Christensen E.I. et al., 2004] et dans les cellules tubulaires proximales de rein d’opossum [Zhai X.Y. et al., 2000].
Figure 13. Colocalisation de la mégaline, cubiline et de l’albumine à la membrane apicale
des cellules tubulaires proximales de souris. D’après Christensen EI et al. [Christensen E.I. et al., 2004].
A. Double marquage en immunofluorescence de la mégaline (vert) et de la cubiline (rouge). La couleur jaune illustre la colocalisation de la mégaline et de la cubiline au niveau de l’épithélium apical des cellules. B. Double marquage en immunofluorescence de la mégaline (vert) et de l’albumine (rouge). La couleur jaune correspond à la colocalisation de la mégaline et de l’albumine à la membrane apicale des cellules. Barre = 10 µm.
Expression et régulation
La mégaline et la cubiline sont exprimées au niveau de la membrane plasmique et de l’appareillage d’endocytose des cellules épithéliales (Tableau 3). Elles sont co-exprimées par plusieurs épithéliums d’absorption comme l’intestin grêle [Birn H. et al., 1997; Levine J.S. et al., 1984], le tubule proximal rénal [Chatelet F. et al., 1986a; Kerjaschki D. et al., 1982; Sahali D. et al., 1988; Seetharam B. et al., 1988], le feuillet viscéral du sac vitellin [Chatelet F. et al., 1986b; Sahali D. et al., 1988] et le cytotrophoblaste placentaire [Juhlin C. et al., 1990; Sahali D. et al., 1992]. La mégaline semble être plus largement distribuée que la cubiline ; elle est entre autre présente au niveau des podocytes glomérulaires de rat [Kerjaschki D. et al., 1982].
Tableau 2 : Ligands de la mégaline et de la cubiline [Christensen E.I. et al., 2002]
Mégaline Cubiline
Protéines de liaison des vitamines
Transcobalamine – vitamine B12 [Moestrup S.K. et al., 1996] Protéine de liaison de la vitamine D [Nykjaer A. et al., 1999] Protéine de liaison du rétinol [Christensen E.I. et al., 1999a]
Facteur intrinsèque – vitamine B12 [Seetharam B. et al., 1997] Protéine de liaison de la vitamine D [Nykjaer A. et al., 2001]
Autres protéines de transport
Albumine [Cui S. et al., 1996; Zhai X.Y. et al., 2000] Lactoferrine [Willnow T.E. et al., 1992]
Hémoglobine [Gburek J. et al., 2002] Myoglobine [Gburek J. et al., 2003]
Odorant-binding protein [Leheste J.R. et al., 1999] Transthyrétine [Sousa M.M. et al., 2000]
Albumine [Birn H. et al., 2000a; Zhai X.Y. et al., 2000] Transferrine [Kozyraki R. et al., 2001]
Hémoglobine [Gburek J. et al., 2002] Myoglobine [Gburek J. et al., 2003]
Lipoprotéines
Apolipoprotéine B [Stefansson S. et al., 1995a] Apolipoprotéine E [Willnow T.E. et al., 1992]
Apolipoprotéine J/clusterine [Kounnas M.Z. et al., 1995] Apolipoprotéine H [Moestrup S.K. et al., 1998b]
Apolipoprotéine A-I [Kozyraki R. et al., 1999]
HDL (high density lipoprotein) [Hammad S.M. et al., 1999]
Hormones et hormones précurseurs
Hormone parathyroïdienne [Hilpert J. et al., 1999] Insuline [Orlando R.A. et al., 1998]
EGF [Orlando R.A. et al., 1998] Prolactine [Orlando R.A. et al., 1998] Thyroglobuline [Zheng G. et al., 1998]
Drogues et toxines
Aminoglycosides [Moestrup S.K. et al., 1995] Polymyxine B [Moestrup S.K. et al., 1995] Aprotinine [Moestrup S.K. et al., 1995] Trichosanthine [Chan W.L. et al., 2000]
Enzymes et inhibiteurs d’enzymes
PAI-1 [Stefansson S. et al., 1995b]
PAI-1-urokinase [Moestrup S.K. et al., 1993]
PAI-1-tPA [Moestrup S.K. et al., 1993; Willnow T.E. et al., 1992] Pro-urokinase [Stefansson S. et al., 1995b]
Lipoprotéine lipase [Kounnas M.Z. et al., 1993] Plasminogène [Kanalas J.J. et al., 1993]
β-amylase [Birn H. et al., 2000b]
α1-microglobuline [Leheste J.R. et al., 1999] Lysozyme [Orlando R.A. et al., 1998]
Protéines apparentées à la réponse immune et de stress
Chaînes légères des immunoglobulines [Birn H. et al., 2002] PAP-1 [Leheste J.R. et al., 1999]
β2-microglobuline [Orlando R.A. et al., 1998]
Chaînes légères des immunoglobulines [Batuman V. et al., 1998] Protéine sécrétée par les cellules de Clara [Burmeister R. et al., 2001]
Autres
RAP [Christensen E.I. et al., 1992; Kanalas J.J. et al., 1993; Kounnas M.Z. et al., 1992; Orlando R.A. et al., 1998; Willnow T.E. et al., 1992] Ca2+ [Christensen E.I. et al., 1992]
Cytochrome c [Orlando R.A. et al., 1998]
Tableau 3 : Expression de la mégaline et de la cubiline [Christensen E.I. et al., 2002; Moestrup S.K. et al., 2001]
Organe Mégaline Cubiline Références
Rein : tubule proximal + + [Chatelet F. et al., 1986a; Kerjaschki D. et al., 1982; Sahali D. et al., 1988; Seetharam B. et al., 1988] Rein : podocytes du glomérule (chez le rat
uniquement) + - [Kerjaschki D. et al., 1982]
Intestin grêle + + [Birn H. et al., 1997; Levine J.S. et al., 1984]
Poumons : pneumocytes de type II + - [Chatelet F. et al., 1986b; Kounnas M.Z. et al., 1994; Zheng G. et al., 1994]
Thyroïde + - [Kounnas M.Z. et al., 1994; Zheng G. et al., 1994]
Thymus + + [Hammad S.M. et al., 2000]
Cellules sécrétant l’hormone parathyroïdienne
de la glande parathyroïde + - [Juhlin C. et al., 1987; Zheng G. et al., 1994]
Cellules de l’épendyme + - [Zheng G. et al., 1994]
Epithélium ciliaire de l’oeil + - [Lundgren S. et al., 1997; Zheng G. et al., 1994] Epithélium de l’oreille interne + - [Kounnas M.Z. et al., 1994; Mizuta K. et al., 1999]
Plexus choroïdes + - [Kounnas M.Z. et al., 1994]
Oviductes + - [Zheng G. et al., 1994]
Muqueuse utérine + + [Zheng G. et al., 1994]
Epididyme + - [Chatelet F. et al., 1986b; Zheng G. et al., 1994]
Feuillet viscéral du sac vitellin + + [Chatelet F. et al., 1986b; Sahali D. et al., 1988] Cytotrophoblaste placentaire + + [Juhlin C. et al., 1990; Sahali D. et al., 1992]
Endomètre + - [Bernadotte F. et al., 1989; Sahali D. et al., 1992]
Dans les cellules du tubule proximal rénal et du feuillet viscéral du sac vitellin, la mégaline et la cubiline sont co-localisées tout au long de l’appareillage d’endocytose [Christensen E.I. et al., 1992; Kerjaschki D. et al., 1984; Sahali D. et al., 1988] incluant la bordure en brosse, les puits recouverts d’un manteau de clathrine, les vésicules endocytaires et les tubules apicaux denses [Christensen E.I. et al., 1998] (Fig. 14).
Figure 14. Expression de la mégaline et de la cubiline dans l’appareillage endocytaire de la
membrane apicale des cellules tubulaires proximales du rein de rat. D’après Christensen EI et al. [Christensen E.I. et al., 2002].
Les récepteurs sont identifiés par immunocytochimie sur une cryosection de cortex rénal de rat à l’aide d’un anticorps de mouton anti-mégaline de rat marqué par un anticorps secondaire mouton couplé à des particules d’or de 5 nm, et d’un anticorps de lapin anti-cubiline de rat marqué par un anticorps secondaire anti-lapin couplé à des particules d’or de 10 nm. Les récepteurs sont coexprimés sur les microvillosités (MV), dans les puits recouverts d’un manteau de clathrine à la membrane apicale (CP, coated pits), dans les endosomes (E) et dans les tubules apicaux denses. Barre = 300 nm.
L’expression de la mégaline et de la cubiline in vitro est stimulée par l’acide
rétinoïque et le dibutyryl cyclique AMP, l’expression de la mégaline par la vitamine D [Hammad S.M. et al., 1999; Liu W. et al., 1998; Stefansson S. et al., 1995a].
Une augmentation de l’expression de la mégaline est observée dans les reins de rats atteints de la néphrite d’Heymann, maladie glomérulaire expérimentale induite par des autoanticorps dirigés contre la mégaline [Makker S.P. et al., 1995]. Les cellules neuronales, touchées dans la maladie d’Alzheimer, sont caractérisées
présentent une accumulation intracellulaire d’apolipoprotéine E ainsi qu’une forte expression de mégaline à la surface cellulaire [LaFerla F.M. et al., 1997].
Une diminution de l’expression de la mégaline au niveau rénal est observée dans certaines maladies caractérisées par une protéinurie et un défaut de réabsorption des protéines filtrées. Notamment, la maladie de Dent est causée par des mutations au niveau du canal chlore rénal ClC-5 [Thakker R.V., 1998]. En effet, une perturbation du ClC-5 diminue la réabsorption tubulaire proximale et induit une réduction de l’expression de la mégaline dans le tubule proximal [Piwon N. et al., 2000]. Ces observations indiquent donc l’existence d’une corrélation fonctionnelle entre le ClC-5 et l’endocytose médiée par la mégaline.
Fonction
L’implication de la mégaline et de la cubiline dans le processus de réabsorption tubulaire des protéines de faible poids moléculaire contenues dans l’ultrafiltrat glomérulaire est confirmée par le fait que les souris déficientes en mégaline ainsi que les chiens ayant une mauvaise post-transcription de la cubiline présentent une augmentation de l’excrétion urinaire des microprotéines.
L’étude sur des souris dont le gène de la mégaline a été invalidé montre que la plupart des souris meurent avant la naissance à cause de complications respiratoires liées à une altération de l’insufflation des poumons [Willnow T.E. et al., 1996]. Ces souris sont également caractérisées par des malformations du cerveau antérieur et des structures dérivées du cerveau antérieur, ce qui cause le syndrome d’holoprosencéphalie. Par conséquent, seulement 1 souris déficiente en mégaline sur 50 atteint l’âge adulte. Les urines de ces souris contiennent les protéines de faible poids moléculaire, tout comme celles des patients atteints du syndrome de Fanconi [Leheste J.R. et al., 1999]. En outre, les souris déficientes en mégaline présentent également des perturbations de l’homéostasie du calcium.
L’étude de patients ayant un déficit héréditaire de l’absorption de la vitamine B12, connu sous le nom d’anémie mégaloblastique autosomique récessive ou syndrome d’Imerslund-Gräsbeck, a permis d’acquérir la certitude que la cubiline était le récepteur physiologique du complexe facteur intrinsèque/vitamine B12. En effet,
deux mutations différentes ont été identifiées au niveau du gène de la cubiline chez ces patients, entraînant des anomalies de structure de la cubiline [Aminoff M. et al., 1999]. Une race de chiens, issus de parents consanguins ayant un développement intracellulaire médiocre de la cubiline, présente également une anémie mégaloblastique [Fyfe J.C. et al., 1991]. Les patients atteints de la maladie d’Imerslund-Gräsbeck ainsi que les chiens déficients en cubiline sont protéinuriques, mais sont normaux pour les autres phénotypes et fertiles. Les premières expériences d’invalidation du gène de la cubiline indiquent que les embryons meurent très
précocement in utero. De même, l’injection d’anticorps anti-cubiline induit des
malformations fœtales chez le rat, probablement dues à la fixation des anticorps sur le sac vitellin et à une inhibition des mécanismes d’endocytose qui assurent le transfert entre la mère et le fœtus [Le Panse S. et al., 1994; Sahali D. et al., 1988].
La mégaline peut également influencer le transport de l’échangeur 3 sodium/hydrogène (NHE3), ces deux protéines semblent former un complexe multimérique à la membrane apicale des cellules du tubule proximal [Biemesderfer D. et al., 1999].
La mégaline et la cubiline peuvent moduler la signalisation cellulaire essentiellement par la voie classique d’endocytose médiée par récepteur : en régulant la captation des hormones pour la dégradation comme l’hormone parathyroïdienne (PTH) [Hilpert J. et al., 1999], ou la captation des précurseurs
d’hormones pour l’activation comme la 25-OH-vitamine D3 [Nykjaer A. et al., 1999;
Nykjaer A. et al., 2001]. En effet, la 25-OH-vitamine D3 formant un complexe avec sa
protéine de transport plasmatique, la protéine de liaison à la vitamine D, est réabsorbée au niveau de l’épithélium tubulaire proximal par endocytose médiée par récepteur incluant la mégaline et la cubiline. L’endocytose est nécessaire pour
préserver la 25-OH-vitamine D3 et délivrer aux cellules le précurseur afin de générer
la 1,25-(OH)2-vitamine D3 , un régulateur du métabolisme du calcium.
L’extrémité cytoplasmique de la mégaline, probablement le domaine carboxy-terminal NPXY, a été décrite comme interagissant avec Dab2 (disabled protein 2) [Oleinikov A.V. et al., 2000], une protéine intracellulaire potentiellement impliquée dans la signalisation et la régulation de la croissance cellulaire et la différenciation.
La réabsorption tubulaire proximale des drogues polybasiques comme l’aprotinine, la polymyxine B et les aminoglycosides incluant la gentamicine est également médiée par la mégaline [Moestrup S.K. et al., 1995]. La captation de gentamicine médiée par la mégaline au niveau des cellules tubulaires proximales est confirmée chez les souris déficientes en mégaline [Schmitz C. et al., 2002]. Ces drogues sont donc néphrotoxiques ainsi qu’ototoxiques. La toxicité est probablement induite par la mégaline qui accumule les drogues dans les cellules.