Exposition des cellules OK à différentes substances

1.2.1. Acides aristolochiques

Les cellules OK confluentes sont traitées pendant 24 h avec du DMSO 0,1 % (contrôle) ou avec des AA à la concentration de 10 ou 20 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique). Le mélange d’AA utilisé est constitué de AAI (69 %) et AAII (19 %) ; les AA sont solubilisés dans du DMSO (concentration finale : 0,1%).

Dans une autre série d’expériences, le temps d’exposition aux AA (20 µmol/l) est de 15 min et de 2, 6, 14, 18 heures.

Pour les expériences de récupération, après 24 h d’exposition aux AA (20 µmol/l), les monocouches de cellules OK sont incubées dans le milieu de culture pendant 1, 2, 3 et 6 jours.

Les cellules OK sont également exposées pendant 24 h à un mélange des AA extraits de la plante (20 µmol/l) ainsi qu’à chacun des dérivés AAI et AAII isolé au départ de cet extrait (20 µmol/l). Ces 3 substances ont été fournies par le Prof H. Schmeiser (Division of Molecular Toxicology, Deutsches Krebsforschungszentrum, German Cancer Research Center, Heidelberg, Allemagne).

1.2.2. Cadmium

Les cellules OK confluentes sont traitées avec du CdCl2 à la concentration de

15 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique) pendant 24 h. Le CdCl2 est solubilisé dans de

l’eau et les contrôles correspondent aux cellules dans le milieu de culture.

Dans une autre série d’expériences, le temps d’exposition au CdCl2 (15 µmol/l) de

est de 15 min et de 2, 6, 14, 18 heures.

Pour les expériences de récupération, après 24 h d’exposition au CdCl2 (15 µmol/l),

les monocouches de cellules OK sont incubées pendant 1, 2, 3 et 6 jours dans le milieu de culture.

1.2.3. Autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes

Les cellules OK confluentes sont traitées avec de la fenfluramine à la concentration de 20 et 100 µmol/l (préparation obtenue à la pharmacie de l’hôpital Erasme, Bruxelles, Belgique), du diéthylpropion à la concentration de 20 et 100 µmol/l (préparation obtenue à la pharmacie de l’hôpital Erasme, Bruxelles, Belgique) et de l’acétazolamide à la concentration de 20 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique). Ces 3 composés sont solubilisés dans l’eau.

1.3. Réabsorption d’albumine et de ββββ

2

-microglobuline

Les expériences de réabsorption sont réalisées comme décrit précédemment [Schwegler J.S. et al., 1991]. Les cellules OK sont cultivées dans les plaques à 6 puits et traitées à confluence comme détaillé plus haut. Après 3 rinçages avec la

solution de Ringer (en mmol : NaCl 130, KCl 4, MgCl2.6H2O 1, CaCl2.2H2O 1,

glucose 5, HEPES 10, titrée à pH 7,4 avec du Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane), les cellules OK sont incubées à 37°C pendant 15 min avec différentes concentrations d’albumine-fluorescéine isothiocyanate (FITC, Molecular Probes, Leiden, Les

Pays-Bas) ou de β2-microglobuline-Cy5 dilués dans la solution de Ringer. L’incubation est

arrêtée par 10 rinçages des monocouches de cellules à 4°C avec la solution de Ringer froide. Les cellules sont ensuite lysées avec une solution de 10 mmol/l de MOPS (pH 7,4) contenant 0,1% de Triton X-100. La fluorescence intracellulaire est mesurée à l’aide d’un spectrofluorimètre à un seul faisceau (Kontron SFM25, AG Instruments, Zurich, Suisse) à longueur d’onde d’excitation de 492 nm et d’émission

de 520 nm pour l’albumine-FITC ou à 649 et 670 nm pour la β2-microglobuline-Cy5.

La fluorescence de la dernière solution de rinçage (avant la lyse des cellules) est comparable à celle du bruit de fond. Le contenu en protéines est mesuré par la réaction de biuret à l’aide du dosage de protéines BCA (Bicinchoninic acid Protein Assay Reageant kit, Pierce, Polylab, Anvers, Belgique). La quantité d’albumine et de

β2-microglobuline réabsorbée est exprimée en pmol/mg de protéine.

La β2-microglobuline (1mg ; ICN Biomedicals, Asse-Relegem, Belgique) est

marquée avec le colorant cyanine à l’aide du kit de marquage Cy™5 (Amersham Pharmacia Biotech Benelux, Roosendaal, Les Pays-Bas).

1.3.1. Compétition avec d’autres protéines

Les cellules OK ont été exposées pendant la période d’incubation de 15 min en présence d’albumine-FITC (0,8 µmol/l) et d’autres protéines à la concentration de

-macroglobuline, lactoferrine, transferrine, thyroglobuline, α1 acide glycoprotéine (Sigma, Bornem, Belgique).

1.4. Tests de cytotoxicité et de viabilité cellulaire

1.4.1. Dosage de lactate déshydrogénase

Les cellules OK sont cultivées dans les plaques à 96 puits et exposées à confluence aux substances comme détaillé ci-dessus. Le milieu de culture est remplacé par du milieu de culture frais sans sérum, le maximum de lactate déshydrogénase (LDH) libéré est obtenu par ajout de Triton (1 %) dans le milieu de culture sans sérum. Après 6 heures d’incubation, le surnageant de la culture est récupéré et incubé à température ambiante avec le mélange de « réaction » du « Cytotoxicity Detection kit » (Roche Diagnostics, Bruxelles, Belgique). Ce mélange

de « réaction » est composé d’un catalyseur (diaphorase/NAD⁺) et d’une solution

colorante contenant du chlorure de iodotétrazolium et du lactate de sodium. Les mesures de LDH sont réalisées à la longueur d’onde de 490 nm (avec 655 nm

comme référence), la quantité de LDH libéré est exprimé en absorbance (A490nm –

A655nm). Toutes les conditions sont effectuées en triple.

1.4.2. Dosage de

3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazo-lium bromide (MTT)

Les cellules OK sont cultivées dans les plaques à 96 puits et traitées à confluence comme décrit ci-dessus. La solution MTT (5 mg/ml ; Sigma, Bornem, Belgique) est ensuite ajoutée dans les puits et les cellules sont incubées pendant

3h30 à 37°C avec 5 % de CO2. Les cristaux de MTT formazan formés sont

solubilisés avec une solution acidifiée d’isopropanol. Les densités optiques sont mesurées à la longueur d’onde de 570 nm (avec 655 nm comme référence). La

viabilité cellulaire est exprimée en % du contrôle. Toutes les conditions sont réalisées en triple.

1.5. Observation en microscopie des cellules OK

1.5.1. Microscopie conventionnelle

Les cellules OK sont cultivées sur des lamelles en verre, traitées comme décrit ci-dessus, et fixées pendant 10 min avec du paraformaldéhyde 4 % en tampon phosphate 0,1 mol/l de pH 7,4 à température ambiante. Les cellules sont ensuite colorées à l’hématoxyline-éosine et observées sous un microscope optique DMR couplé à un système microphotographique MPS60 (Leica, Heerbrugg, Suisse).

1.5.2. Microscopie confocale

Endocytose d’albumine

Pour l’étude fonctionnelle de l’endocytose, les cellules OK sont cultivées sur des lamelles en verre. Après rinçage avec la solution de Ringer, les monocouches de cellules OK sont incubées pendant 15 min à 37°C avec la solution de Ringer contenant l’albumine-FITC (150 µmol/l), et ensuite placées sur glace, rincées à froid et fixées comme décrit ci-dessus. Les cellules sont alors observées sous un microscope à fluorescence Zeiss Axiovert couplé à un microscope confocal à balayage laser (MRC 1000 ; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) équipé d’un laser argon-krypton et d’un logiciel Laser-Sharp (Bio-Rad). Les images sont ensuite analysées à l’aide du logiciel NIH-image 1.62 (Bethesda, MD, USA).

Colocalisation entre l’endocytose d’albumine et la mégaline

L’étude de colocalisation entre l’endocytose d’albumine et la mégaline est réalisée sur les cellules OK incubées durant 2, 5 et 15 min avec de l’albumine-FITC (150 µmol/l) et ensuite fixées. L’immunomarquage avec un anticorps de mouton

anti-mégaline (dilution 1/200) [Devuyst O. et al., 1999; Le Panse S. et al., 1995] est réalisé. Les cellules sont ensuite rincées et incubées avec un anticorps anti-mouton marqué au TRIC (tétraméthylrhodamine isothiocyanate, Sigma, Bornem, Belgique) à la dilution 1/200. Après rinçages, les cellules sont observées à l’aide du système d’imagerie confocale décrit ci-dessus. Les paramètres d’analyse confocale sont définis afin d’éviter les interférences de signaux entre les 2 canaux de fluorescence. Toutes les expériences ont été réalisées en double et comparées à celles effectuées en absence d’anticorps primaire à titre de contrôle.

1.6. Marquage des protéines à la [

³⁵

S]L-méthionine

Les cellules OK, cultivées dans des boîtes de 60 mm, sont exposées comme décrit ci-dessus ou incubées pendant 1 h en présence de cycloheximide à la concentration de 100 µmol/l (Sigma, Bornem, Belgique), un inhibiteur de la synthèse des protéines. Après rinçage avec du DMEM ne contenant pas de méthionine, les

monocouches de cellules sont exposées pendant 2 h à ~ 20 µCi/ml de [³⁵

S]L-méthionine (NEN Life Science Products, Zaventem, Belgique) en DMEM sans méthionine. Après rinçage, les cellules sont incubées pendant 1 ou 20 h avec du

DMEM contenant 10 mmol/l de méthionine à 37°C avec 5 % de CO2. Après rinçage à

froid, les cellules sont lysées pendant 20 min sur glace avec une solution de pH 8 composée de 10 mmol/l Tris et 1 mmol/l EDTA. Les cellules sont grattées et les lysats récupérés. Les protéines de ces lysats sont ensuite précipitées à l’aide d’une solution d’acide trichloroacétique 10 % pendant 30 min sur glace et centrifugées à

1600 × g à 4°C pendant 20 min. Finalement, les culots resuspendus avec du SDS 1

% (dodécyl sulfate de sodium ; Sigma, Bornem, Belgique) sont mis dans un liquide

de scintillation Ready Protein⁺ pour le comptage des émissions β (1214 Rackbeta

liquid scintillation counter, LKB Wallac, Finlande). La quantité de protéines

1.7. Réabsorption de méthyl-αααα-D-glucopyranoside (AMG)

Les cellules OK sont cultivées à confluence dans des plaques à 6 puits et traitées comme décrit précédemment. Après rinçage, les monocouches de cellules

sont incubées avec différentes concentrations de [¹⁴C]-AMG (NEN Life Science

Products, Zaventem, Belgique) en solution de Ringer à 37°C pendant 10 min. Ce temps est dans la phase linéaire de réabsorption. Après rinçages à froid avec la

solution de Ringer, les cellules lysées avec 0,1 mol/l de HNO3 sont mises dans le

liquide de scintillation Ready Protein⁺ pour le comptage des émissions β. La quantité

d’AMG réabsorbée est exprimée en nmol/mg de protéine.

1.8. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides

aristolochiques

La détection des adduits d’ADN spécifiques aux AA dans les extraits cellulaires a été réalisée par le Dr. V.M. Arlt dans le laboratoire de la Division de Toxicologie Moléculaire du Prof. H.H. Schmeiser (Deutsches Krebsforschungszentrum, German Cancer Research Center, Heidelberg, Allemagne). Les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont détectés par la méthode

d’enrichissement à la nucléase P1 du post-marquage ³²P comme décrit

précédemment [Schmeiser H.H. et al., 1997]. Brièvement, l’ADN des cellules OK est isolé par la méthode d’extraction au phénol après trypsinisation des cellules OK pour les différents traitements étudiés. Les échantillons d’ADN (12,5 µg) sont digérés,

enrichis à la nucléase P1 et post-marqués au ³²P. Ensuite, ces échantillons sont

séparés par chromatographie sur des couches minces en polyéthylèneimine-cellulose (Macherey and Nagel, Düren, Allemagne). Les conditions de chromatographie utilisées sont les suivantes : D1 : 1 mol/l phosphate de sodium, pH 6,8 ; D3 : 3,5 mol/l formate de lithium, 8,5 mol/l urée, pH 4,0 ; D4 : 0,8 mol/l chlorure

de lithium, 0,5 mol/l Tris-HCl, 8,5 mol/l urée, pH 9,0 ; D5 : 1,7 mol/l NaH2PO4, pH 6,0.

L’autoradiographie de ces plaques chromatographiques à l’aide de « Packard Instant Imager » (Canberra Co., Dowers Grove, IL, USA) permet d’analyser et de quantifier

les adduits d’ADN. Les adduits d’ADN spécifiques aux AA sont identifiés comme décrit précédemment [Bieler C.A. et al., 1997]. La quantification des adduits d’ADN

se base sur le nombre de coups par minute, l’activité spécifique de l’ATP[γ-³²P] et la

quantité d’ADN utilisée (pmol ADN-P). Le taux d’adduits d’ADN spécifique aux AA

est exprimé en quantité relative d’adduits d’ADN/10⁷ nucléotides normaux.

1.9. Analyse de l’expression de la mégaline dans les

extraits cellulaires

Les lysats cellulaires sont préparés au départ de cellules OK confluentes exposées dans différentes conditions [Devuyst O. et al., 1999]. Après lavages en

PBS (en mmol/l: 68 NaCl, 1,3 KCl, 4 Na2HPO4, 0,7 KH2PO4, titré à pH 7,4 par du

HCl) et un léger grattage, les cellules sont centrifugées à 8000 × g pendant 90

secondes et les culots sont congelés dans de l’azote liquide. Les culots congelés sont solubilisés dans du tampon de lyse froid contenant des inhibiteurs de protéases (Complete Mini® ; Roche Diagnostics, Bruxelles, Belgique), brièvement traités aux ultrasons (Branson Sonifer 250, 2 pulses à 40 % d’intensité), et ensuite centrifugés à

16000 × g pendant 1 min à 4°C. Le surnageant est récolté et mis en présence de 10

% SDS et chauffé à 95°C pendant 90 secondes.

Les extraits cellulaires (30 µg) et l’extrait membranaire de cortex rénal de rat (30 µg), utilisé comme contrôle positif, sont séparés par des gels de SDS-polyacrylamide ( 5%) et transférés sur membranes de nitrocellulose. Après les étapes de blocage, les membranes sont incubées toute la nuit à 4°C avec l’anticorps de mouton anti-mégaline (dilution 1/2500) [Le Panse S. et al., 1995]. Elles sont ensuite lavées, incubées avec l’anticorps anti-mouton marqué à la peroxidase (Dako, Prosan, Merelbeke, Belgique) et révélées à l’ECL (enhanced chemioluminescence kit, Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, Les Pays-Bas). Avant d’effectuer un nouveau marquage, les membranes sont rincées, le premier marquage est ensuite enlevé en incubant les membranes pendant 30 min à 55°C dans une solution de pH

-mercaptoéthanol. Après lavage, l’absence de signal est vérifiée par incubation avec l’ECL en exposant un film pendant 1h. Les membranes sont ensuite incubées avec

l’anticorps monoclonal anti-β-actine (dilution 1/10000, Sigma, Bornem, Belgique),

suivi de l’anticorps anti-souris marqué à la peroxydase (Dako, Prosan, Merelbeke, Belgique) et finalement exposées à l’ECL. Trois immunomarquages indépendants pour la détection de la mégaline dans les cellules OK ont été réalisés.

L’analyse densitométrique est effectuée sur un immunoblot représentatif à l’aide d’un Scanjet Hewlett Packart modèle IVC utilisant un logiciel NIH Image V1.60 (Bethesda, MD, USA). Les densités optiques, données en unités de pixels

arbitraires, pour la mégaline sont normalisées par rapport à la β-actine et exprimées

en pourcentage du signal obtenu pour les cellules OK contrôles. Chaque évaluation est obtenue en double.

1.10. Analyses statistiques

Tous les résultats représentent la moyenne ± l’erreur standard à la moyenne.

2. Etude in vivo : effets de l’intoxication aux acides

aristolochiques sur l’épithélium tubulaire proximal

de rat.

2.1. Conditionnement des rats Wistar

Des rats mâles de souche Wistar, provenant de l’Elevage agréé Janvier (Le Genest Saint-Isle, France) ont été hébergés dans l’animalerie de la Faculté de Médecine de l’Université Libre de Bruxelles (Belgique) dans des conditions contrôlées de température, d’humidité et de luminosité. Au cours des protocoles, les animaux ont un libre accès à l’eau (eau de distribution) et à la nourriture, à savoir un régime alimentaire complet pour rat contenant un taux normal de sodium (Carfil Quality, Oud-Turnhout, Belgique). Avant chaque protocole, une semaine d’acclimatation est laissée aux animaux afin qu’ils puissent s’adapter à leur nouvel environnement.

Les protocoles ont été approuvés par le Comité d’Ethique et du Bien-être Animal (Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Belgique).

2.2. Administration des acides aristolochiques aux rats

Le mélange d’AA (Acros Organics Co., Geel, Belgique) utilisé pour les injections, est composé de 40 % de AAI et 60 % de AAII. Les AA (20 mg/ml) sont solubilisés avec du polyéthylène glycol (PEG) 400 (Fluka Chemie, Buchs, Suisse) et dilués dans de l’eau pour injection à la concentration finale de 10 mg/ml. Les rats traités aux AA reçoivent une injection quotidienne sous-cutanée d’AA à la concentration de 10 mg/kg de poids corporel tandis que les rats contrôles reçoivent une injection journalière d’une solution volume/volume de PEG 400 et d’eau pour

injection. Les rats sont pesés chaque semaine afin d’ajuster la dose d’AA à administrer.

2.2.1. Modèle initial de la néphropathie aux acides aristolochiques :

rats traités pendant 35 jours

Septante-deux rats, âgés de 4 semaines, sont répartis au hasard au jour 0 en deux groupes de poids équivalents. Un premier groupe de 36 rats correspond aux rats traités aux AA et un deuxième groupe de 36 rats représente les rats contrôles. Six rats par groupe sont sacrifiés après 3, 7, 10, 14, 18 et 35 jours d’injection.

Une seconde série d’expériences est réalisée sur base du protocole détaillé ci-dessus afin de suivre l’évolution au cours du temps des paramètres urinaires pendant 35 jours. Sept rats, âgés de 4 semaines, sont divisés en deux groupes au jour 0 : quatre pour le groupe exposé aux AA et trois rats contrôles. Pour chaque rat, les urines de 24 heures sont récoltées aux jours 0, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 18, 22, 24, 27, 31 et 35.

2.2.2. Protocole court : rats traités pendant 5 jours

Soixante rats, âgés de 7 semaines, sont divisés en deux groupes (n = 30) au

jour 0. Les injections sont réalisées chaque jour comme décrit ci-dessus. Six rats du groupe exposé aux AA et six du groupe contrôle sont euthanasiés après 1, 2, 3, 4 et 5 jours d’injection.

2.2.3. Protocole destiné à des études histologiques particulières

(10 jours)

Trente rats, âgés de 7 semaines, sont divisés en deux groupes (n = 15) au

du groupe exposé aux AA et trois du groupe contrôle sont euthanasiés après respectivement 1, 2, 3, 4, 7 et 10 jours d’injection.

2.3. Prélèvement des urines, du sang et des reins

Urines

Avant le sacrifice, les urines sont collectées (durée approximative : 20 à 24 h) en plaçant les rats dans des cages à métabolisme pour rongeurs. Les échantillons

d’urine sont, en fonction du dosage ultérieur, centrifugés à 1600 × g pendant 15 min

à 4°C ou dilués dans du glycérol (dilution 1/3) avant d’être conservés à –20°C.

Sang et reins

Aux jours de sacrifice, les rats sont profondément anesthésiés par injection intra-péritonéale d’une solution composée d’un analgésique, la kétamine (Imalgen, Leo Pharma Belgium, Wilrijk, Belgique) et d’un sédatif puissant, la xylazine (Rompun, Bayer, Bruxelles, Belgique). Après ouverture de la cage thoracique, le sang est récolté par ponction intracardiaque à l’aide d’une seringue contenant du dipotassium-EDTA et les reins sont prélevés.

Le plasma est centrifugé à 1600 × g pendant 15 min à 4°C et congelé à –20°C

en prévision des dosages ultérieurs.

Après décapsulation, la moitié d’un rein est fixée dans une solution tamponnée de formaldéhyde 4% pour les analyses histologiques sur coupes en paraffine. Pour les études sur coupes au cryostat, un demi-rein est fixé dans une solution tamponnée en phosphate de paraformaldéhyde 4% et ensuite cryoprotégé par immersions successives dans des solutions de saccharose 10, 20 et 30%, avant la congélation dans de l’isopentane.

D’autre part, un fragment de cortex rénal est disséqué, congelé dans de l’azote liquide et conservé à –80°C pour la détection d’adduits d’ADN spécifiques aux AA.

2.4. Dosages de la créatinine plasmatique et urinaire

Créatinine plasmatique

La concentration de créatinine plasmatique est mesurée par une méthode de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) adaptée de Xue et al. [Xue G.P. et al., 1988]. Brièvement, les échantillons de plasma sont d’abord traités avec de l’acétonitrile afin de les déprotéiner et ensuite analysés par HPLC sur une colonne

échangeuse de cation de haute affinité (colonne Spherisorb 5 µm SCX, 4,0 × 250

mm, Waters, Milford, MA, USA). La phase mobile est composée d’acétonitrile (9 %) dans une solution 40 mM de phosphate d’ammonium à pH 5,3, utilisée pour l’élution de la colonne au débit de 1,0 ml/min à température ambiante. L’absorbance de la créatinine est mesurée à la longueur d’onde de 230 nm. L’identification et la quantification du pic de créatinine détecté sont réalisées par comparaison avec une courbe standard de créatinine (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique). La concentration de créatinine plasmatique est exprimée en µmol/l.

Créatinine urinaire

La concentration de créatinine urinaire est déterminée par la méthode pseudocinétique de Jaffé à l’aide du « Creatinine Diagnostic Kit » (Sigma-Aldrich,

Bornem, Belgique). Succinctement, les échantillons d’urine dilués 40 × sont incubés

pendant 4 min 30 sec à 37°C avec une solution volume/volume d’acide picrique 37 mM et de NaOH 0,3 M. La quantité de créatinine est mesurée à la longueur d’onde de 492 nm, rapportée à une courbe standard de créatinine et exprimée en mmol/l.

2.5. Dosage de l’activité leucine aminopeptidase dans

l’urine

L’excrétion urinaire de leucine aminopeptidase (LAP), enzyme originaire de la bordure en brosse du tubule proximal, est mesurée par dosage spectrofluorimétrique d’activité enzymatique. Les échantillons d’urine en glycérol sont portés à la dilution

substrat synthétique leucine-7-amino-4-méthyl-coumarine (Bachem, Bubendorf, Suisse) à 37°C pendant une heure. La réaction enzymatique est arrêtée en chauffant les échantillons à 95°C pendant 5 min. L’activité LAP est déduite de la mesure de la fluorescence du 7-amino-4-méthyl-coumarine (AMC), libéré par la réaction, à la longueur d’onde d’excitation de 367 nm et d’émission de 440 nm ; elle est exprimée en nmol d’AMC produit/mmol de créatinine/h.

2.6. Dosage de l’activité endopeptidase neutre dans l’urine

L’excrétion urinaire d’endopeptidase neutre (NEP), enzyme également localisée à la bordure en brosse du tubule proximal, est mesurée par dosage spectrofluorimétrique d’activité enzymatique. Les échantillons d’urine en glycérol sont

portés à la dilution finale de 120 × dans du tampon Tris-HCl 50 mM à pH 7,6 et

incubés avec le substrat synthétique succinyl-alanyl-alanyl-phénylalanine-7-amino-4-méthyl-coumarine (Bachem, Bubendorf, Suisse) à 37°C pendant une heure. La

réaction enzymatique est arrêtée en ajoutant du phosphoramidon [N-(α

-rhamnopyranosyloxyhydroxyphosphinyl)-leucine-tryptophane, Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique]. Les échantillons sont incubés avec un excès d’aminopeptidase

(EC 3.4.11.2, Pierce, Rockford, USA) à 56°C pendant 30 min afin de libérer l’AMC. Cette réaction est ensuite arrêtée par incubation des échantillons à 95°C pendant 5 min. L’activité NEP correspond à la mesure de la fluorescence de l’AMC libéré par la réaction, à la longueur d’onde d’excitation de 367 nm et d’émission de 440 nm. L’activité NEP est rapportée à une courbe standard établie au départ de NEP purifiée extraite de rein humain [Deschodt-Lanckman M. et al., 1988] et exprimée en µg/mmol de créatinine.

2.7. Dosage de l’activité N-acétyl-ββββ-D-glucosaminidase

dans l’urine

L’excrétion urinaire de N-acétyl-β-D-glucosaminidase (NAG), enzyme

présente dans les lysosomes, est mesurée par un dosage colorimétrique en adaptant le protocole fourni (Roche Diagnostics Belgium, Bruxelles, Belgique). Brièvement, les échantillons d’urines sont incubés avec le substrat

3-crésolsulfonphthaléinyl-N-acétyl-β-D-glucosaminide à 37°C pendant 30 min. Après arrêt de la réaction, le

produit de l’hydrolyse du substrat, le 3-crésolsulfonphtaléine, est détecté à la longueur d’onde de 540 nm. L’activité NAG est déterminée en rapportant les mesures de densité optique à une courbe standard de NAG et exprimée en

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