TABLE DES MATIERES
Pages
Liste des abréviations . . . 7
Résumé . . . 9
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION . . . 10
1. Le rein : généralités . . . 10
1.1. Unité anatomique, le néphron . . . 11
1.2. Unité fonctionnelle, le néphron . . . 12
1.2.1. Le glomérule . . . 12
1.2.2. Le tubule rénal . . . 15
1.2.3. La vascularisation rénale . . . 18
2. Le tubule proximal . . . 20
2.1. L’épithélium tubulaire proximal . . . 21
2.2. Réabsorption tubulaire . . . 22
2.2.1. Réabsorption du sodium . . . 22
2.2.2. Réabsorption des nutriments . . . 23
2.3. Sécrétion tubulaire . . . 24
2.3.1. Sécrétion d’hydrogène . . . 24
2.3.2. Sécrétion d’ammonium . . . 25
2.4. Endocytose médiée par récepteur . . . 25
2.4.1. Mégaline et cubiline . . . 27
2.5. Sécrétion et réabsorption tubulaire des drogues et xénobiotiques . . . 37
3. Marqueurs urinaires d’atteinte tubulaire proximale . . . 42
3.1. Atteinte structurelle . . . 43
3.2. Atteinte fonctionnelle . . . 45
4. Cellules de rein d’opossum : modèle d’étude du tubule proximal . . . 51
4.1. Caractérisation de la lignée de cellules OK (opossum kidney) . . . 51
4.2. Endocytose médiée par récepteur . . . 56
5. Toxicité tubulaire des acides aristolochiques . . . 59
5.1. Néphropathie aux plantes chinoises : aperçu clinique . . . 61
5.2. Données expérimentales chez l’animal . . . 64
5.2.1. Toxicité aiguë . . . 64
5.2.2. Toxicité chronique . . . 64
CHAPITRE 2 : BUTS DU TRAVAIL . . . 66
CHAPITRE 3 : METHODOLOGIE . . . 67
1. Etude in vitro : effets des acides aristolochiques sur les cellules rénales d’opossum . . . 67
1.1. Culture des cellules OK . . . 67
1.2. Exposition des cellules OK à différentes substances . . . 67
1.2.1. Acides aristolochiques . . . 67
1.2.2. Cadmium . . . 68
1.2.3. Autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes . . 68
1.3. Réabsorption d’albumine et de β2-microglobuline . . . 69
1.3.1. Compétition avec d’autres protéines . . . 69
1.4. Tests de cytotoxicité et de viabilité cellulaire . . . 70
1.4.1. Dosage de lactate déshydrogénase . . . 70
1.4.2. Dosage de 3-(4,5-diméthyl-thiazoyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide (MTT) . . . 70
1.5. Observations en microscopie des cellules OK . . . 71
1.5.1. Microscopie conventionnelle . . . 71
1.5.2. Microscopie confocale . . . 71
1.6. Marquage des protéines à la [35S]L-méthionine . . . 72
1.7. Réabsorption de méthyl-α-D-glucopyranoside (AMG) . . . 73
1.8. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques . . 73
1.9. Analyse de l’expression de la mégaline dans les extraits cellulaires . . 74
1.10. Analyses statistiques . . . 75
2. Etude in vivo : effets de l’intoxication aux acides aristolochiques sur l’épithélium
tubulaire proximal de rat . . . 76
2.1. Conditionnement des rats Wistar . . . 76
2.2. Administration des acides aristolochiques aux rats . . . 76
2.2.1. Modèle initial de la néphropathie aux acides aristolochiques : rats traités pendant 35 jours . . . 77
2.2.2. Protocole court : rats traités pendant 5 jours . . . 77
2.2.3. Protocole destiné à des études histologiques particulières (10 jours)77 2.3. Prélèvement des urines, du sang et des reins . . . 78
2.4. Dosages de la créatinine plasmatique et urinaire . . . 79
2.5. Dosage de l’activité leucine aminopeptidase dans l’urine . . . 79
2.6. Dosage de l’activité endopeptidase neutre dans l’urine . . . 80
2.7. Dosage de l’activité N-acétyl-β-D-glucosaminidase dans l’urine . . . 81
2.8. Dosage et analyse des protéines urinaires . . . 81
2.9. Dosage d’albumine plasmatique et urinaire . . . 82
2.10. Dosage d’alpha-glutathion-S-transférase urinaire . . . 83
2.11. Dosages de sodium, potassium et glucose urinaire et plasmatique . . 83
2.12. Histologie rénale conventionnelle . . . 84
2.13. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre . . . 86
2.14. Immunomarquages de la mégaline et de la cubiline . . . 87
2.15. Microscopie électronique (étude préliminaire) . . . 88
2.16. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques dans le cortex rénal . . . 88
2.17. Analyses statistiques . . . 89
CHAPITRE 4 : RESULTATS . . . 90
1. Etude in vitro : effets des acides aristolochiques sur la lignée cellulaire de rein d’opossum . . . .. . . 90
1.1. Endocytose de protéines médiée par récepteur . . . . .. . . 90
1.1.1. Albumine . . . . .. . . .. . . 90
1.1.2. Autres protéines . . . . .. . . 92
1.1.3. β2-microglobuline . . . . .. . . 92
1.1.4. Compétition entre albumine et β2-microglobuline . . . 92
1.2. Inhibition de la réabsorption d’albumine et de β2-microglobuline . . . 93
1.2.1. Effets des acides aristolochiques . . . 94
1.2.2. Effets du cadmium . . . 97
1.2.3. Observation de l’inhibition en microscopie confocale . . . 98
1.2.4. Réversibilité de l’inhibition . . . 99
1.3. Viabilité et fonctionnalité des cellules OK . . . 100
1.3.1. Tests de cytotoxicité et de viabilité cellulaire . . . 100
1.3.2. Synthèse des protéines . . . 102
1.3.3. Réabsorption du glucose . . . 103
1.4. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques . . 104
1.5. Expression de la mégaline . . . 106
1.5.1. Colocalisation avec l’albumine . . . 106
1.5.2. Effets des acides aristolochiques . . . 107
1.6. Effets d’autres composés contenus dans les gélules amaigrissantes . . 108
2. Etude in vivo : effets de l’intoxication aux acides aristolochiques sur l’épithélium tubulaire proximal de rat . . . 109
2.1. Protocole long : rats traités pendant 35 jours . . . 109
2.1.1. Paramètres biologiques . . . 111
2.1.1.1. Créatinine plasmatique . . . 111
2.1.1.2. Protéines et enzymes urinaires . . . 111
2.1.1.3. Relations structure-fonction . . . 116
2.1.2. Observations histologiques . . . 116
2.1.2.1. Histologie conventionnelle . . . 116
2.1.2.2. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre . . . 118
2.1.2.3. Evaluation semi-quantitative des lésions morphologiques 119 2.1.3. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques dans le cortex rénal . . . 120
2.2. Protocole de suivi des paramètres urinaires : rats traités pendant 35 jours 121 2.2.1. Paramètres reflétant l’atteinte fonctionnelle . . . 122
2.2.2. Paramètres reflétant l’atteinte structurelle . . . 122
2.3. Protocole court : rats traités pendant 5 jours . . . 125
2.3.1. Paramètres biologiques . . . 126
2.3.1.1. Créatinine plasmatique . . . 126
2.3.1.2. Protéines et enzymes urinaires . . . 127
2.3.1.3. Relations structure-fonction . . . 130
2.3.2. Observations histologiques . . . 131
2.3.2.1. Histologie conventionnelle . . . 131
2.3.2.2. Immunomarquage de l’endopeptidase neutre . . . 132
2.3.3. Détection des adduits d’ADN spécifiques aux acides aristolochiques dans le cortex rénal . . . 134
2.4. Protocole destiné à des études histologiques particulières : rats traités pendant 10 jours . . . 136
2.4.1. Paramètres biologiques . . . 136
2.4.2. Immunomarquages de la mégaline et de la cubiline . . . 137
2.4.3. Microscopie électronique : résultats préliminaires . . . 138
CHAPITRE 5 : DISCUSSION ET CONCLUSIONS . . . 141
1. Discussion et conclusion de l’approche in vitro . . . 141
2. Discussion et conclusion de l’approche in vivo . . . 147
3. Conclusion générale et perspectives . . . 154
ANNEXE 1 : Sécrétion et réabsorption tubulaires des drogues et xénobiotiques 158 A.1. Transporteurs tubulaires anioniques (OAT) . . . 158
A.2. Transporteurs tubulaires cationiques (OCT) . . . 161
ANNEXE 2 : Effets des acides aristolochiques sur l’expression de protéines impliquées dans l’endocytose médiée par récepteur . . . 165
ARTICLES PUBLIES . . . 166
1. Aristolochic acid impedes endocytosis and induces DNA adducts in proximal tubule cells. Kidney International 60: 1332-1342, 2001 . . . 166
2. Early proximal tubule injury in experimental aristolochic acid nephropathy: functional and histological studies. Nephrol Dial Transplant 20: 2321-2332, 2005 . . . 178
BIBLIOGRAPHIE . . . 191
THESE ANNEXE . . . 214 L’étude dans les cellules tubulaires proximales humaines en culture de l’effet des
ochratoxines (A, B, C) sur les agents médiateurs de l’apoptose, l’inflammation et la fibrose devrait permettre de caractériser les voies de signalisation des MAP-kinases impliquées dans le développement de la néphropathie tubulo-interstitielle
