REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE MENTOURI CONSTANTINE FACULTE DES SCIENCES EXACTES
DEPARTEMENT DE CHIMIE N°d’ordre :………
Série :……….
MEMOIRE
Présenté pour obtenir le diplôme de Magister
en Chimie Organique
Option : Analyse Physico-Chimique et Substances Naturelles
Par : Sous la direction du Professeur : HAMMOUD Leila BENAYACHE Fadila
Devant le jury
:
Mr BENAYACHE Samir Pr. Univ. Mentouri Constantine Président Mme BENAYACHE Fadila Pr. Univ. Mentouri Constantine Rapporteur Mme BOUMAZA Ouahiba M.C. Univ. Mentouri Constantine Examinatrice Mr BOUHEROUM Mohamed M.C. Univ. Mentouri Constantine Examinateur
Mr ZAÏTER Lahcene M.C. Univ. Mentouri Constantine Examinateur
A mes chères parents,
à mes grands parents,
à ma sœur,
à mes frères,
à toute ma famille,
à mes amis,
pour leur présence de tous les instants,
pour le soutien qu’ils m’ont apporté,
avec toute mon affection et ma reconnaissance .
Ce travail a été réalisé au laboratoire de Phytochimie et Analyses Physico-Chimiques et Biologiques, Faculté des Sciences Exactes, Université Mentouri de Constantine, sous la direction de madame le professeur Fadila BENAYACHE, à qui je tiens à exprimer toute ma reconnaissance pour m’avoir accueillie au sein de ce laboratoire et particulièrement pour ses conseils précieux, ses efforts, ses compétences scientifiques et pour le soutien qu’elle m’a témoigné tout au long de cette étude.
J’exprime mes sincères remerciements à Monsieur Samir. BENAYACHE, professeur à l’Université Mentouri de Constantine, d’avoir accepté de présider le jury de ce mémoire et pour les conseils précieux qu’il m’a prodigués tout au long de ce travail .
Je suis très honorée de la présence en tant qu’examinateurs de Mr Mohamed BOUHEROUM, Mme Ouhiba BOUMAZA et Mr Lahcene ZAÏTER, Maîtres de conférences à l’Université Mentouri Constantine, je les en remercie sincérement.
Je remercie vivement monsieur la professeur P. MOSSET de l’Ecole Nationale de Chimie de Rennes pour l’enregistrement des spectres de RMN et de SM du composé F16-1 et madame le professeur A. LOBSTEIN et le docteur M. CHAABI de la Faculté de Pharmacie de Strasbourg pour l’enregistrement des spectres de RMN du composé F9-3-1.
J’adresse mes plus vifs remerciements à Monsieur Ramdane SEGHIRI Maître de conférences à l’Université Mentouri Constantine, pour son aide, ses conseils précieux et pour tout ce qu’il m’a appris.
Je voudrais également remercier l’ensemble du personnel du laboratoire pour leur disponibilité : Mlle Ratiba MEKKIOU, Mr Ali BENTAMENE, Mr Messaoud KERKATOU, Mlle Sabrina BICHA, Mlle Ouahiba BENAISSA , Mlle Hanene ZAATER, Mme Samia MEZHOUD , Mme Hayet TOUAHER ainsi que mes amis et collègues, pour avoir simplement été eux-mêmes et pour les moments inoubliables qu’ils m’ont permis de partager : Ouissaf, Souad, Amel, Nacera, Fatima, Hanene, Kaouther, Lamia, Nassima, Linda, Samia, Ratiba, Saïda.
Je remercie toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à ce que la réalisation de ce travail se soit déroulée dans les meilleures conditions.
CHCl3 : Chloroforme
CDCl3 : Chloroforme deutérié
MeOH : Méthanol
MeOH-d4 : Méthanol deutérié
Me2CO : Acétone
CD3CO CD3 : Acétone deutériée
CH2Cl2 : Dichlorométhane
AcOEt : Acétate d’éthyle isPrOH :Isopropanol Et2O : Ether diéthylique
CCM : Chromatographie sur couche mince Rf : Facteur de retardement (retardation factor)
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire
13C : Carbone 13 1H : Proton Me : Methyl (-CH3) Glc: Glucose Gluc : Glucuronide Rut : Rutinose Rham : Rhamnose
DEPT: Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer HSQC :Heteronuclear Single Quantum Coherence
HMBC : Heteronuclear Multiple Bonding Connectivity COSY : Correlated Spectroscopy
MHz : MegaHertz ppm : Partie par million δ : Déplacement chimique
J(Hz) : Constante de couplage exprimée en Hertz
s : Singulet d : Doublet
SMIE : Spectrométrie de masse sous impact électronique ESI : Ionisation electospray (Electro spray Ionisation)
m/z : Masse / Charge électrique
g : Gramme
˚C : Température en degrés Celsius ml : Millilitre
HCl : Acide chlorhydrique H3BO3 : Acide borique
NaOAc : Acétate de sodium NaOH : Hydroxyle de sodium AlCl3 :Chlorure d’alimunium
Introduction générale
………...………...1Chapitre I :Les flavonoїdes
І-1-Introduction.……….4І-2-Structure chimique et classification des flavonoїdes.………...4
I-2-1-Flavones……….6
I-2-2-Flavonols………...9
I-2-3- -Flavanones et dihydroflavonols ……….………..12
I-2-4- Flavan-3-ols, flavan-3,4-diols et anthocyanidols ………...12
I-2-5-Chalcones et aurones……….……...13
І-3-Distribution et localisation ………..13
I-4- Proprietés des flavonoїdes ………...17
І-5- Activités biologiques des flavonoїdes ………...17
I-6- La biosynthèse des flavonoїdes………...18
І-7-Les principales substitutions du squelette flavoniques ………...19
I-7-1-L’hydroxylation ………..……...19
I-7-2- La méthoxylation ou méthylation ………...19
I-7-3- La O-glycosylation ...20
I-7-4- La C-glycosylation…...……….…...…...20
І-8- Méthodes de séparation et d’analyse des flavonoϊdes………..………..20
І-8-1- Méthodes de séparation ………...20
І-8-1-a-La chromatographie liquide sur colonne (CC)………...21
I-8-2- Méthodes d’analyse……….21
I-8-2-a- La fluorescence sous lumière de Wood ………..22
I-8-2-b- Facteur de retardement et comportement chromatographique……….22
I-8-2 -c-La spectrophotométrie UV-Visible………..23
I-8-2 -c-1- Addition de réactifs……….24
• l’addition de AlCl3 et AlCl3 + HCl………...25
• l’addition de NaOAc + H3BO3……….25
• l’addition de NaOH et de NaOAc……….25
I-8-2-d-La Spectrométrie de masse ………....…..27
I-8-2-e- La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) ………...…….27
I-8-3 - L’hydrolyse acide des hétérosides………...28
Chapitre II :Les lactones sesquiterpéniques
II-1-Introduction ...………30II-2-Structure chimique des lactones sesquiterpéniques ...……….………...30
II-3-Classification des lactones sesquiterpéniques ..……….…...………….31
II-3-1-Les germacranolides ………..31
II-3-2-Les élémanolides ………...32
II-3-3-Les eudesmanolides ………...33
II-3-4-Les guaianolides ………...34
II-3-5-Les héliangolides ………34
II-4-Biosynthèse des lactones sesquiterpéniques ………...35
II-5-Activités biologiques des lactones sesquiterpéniques ………...36
II-6- Les méthodes de séparation et d’analyse des lactones sesquiterpéniques ………...37
II-6-1- b- Chromatographie sur couche mince ……….39
II-6- 2- Les méthodes d’analyse ………...40
Chapitre III : Partie expérimentale
III-1 - Etude phytochimique de Centaurea nicaeensis ………42III-1.1 - Place dans la systématique ………..42
III-1.2 - Description de l’espèce Centaurea nicaeensis ………...42
III-1.3 - Travaux antérieurs………...44
III-2- Travaux personnels ……….46
III-2-1-Extraction de Centaurea nicaeensis ….………..46
III-2-2-Séparation chromatographique de l’extrait acétate d ’éthyle………..48
III-2-2-1-Séparation chromatographique sur colonne ………..48
III-2-2-2-Séparation et purification des fractions………..51
III-3-Conclusion………...….52
Chapitre VI : Résultats et Discussion
VI-1-Identification du produit F9-3-1………..55 VI-2-Identification du produit F10-1………...66 VI-3-Identification du produit F16-1 ………...72 VI-4-Identification du produit F16-4……….………..94 VI-5-Identification du produit F17-2……….………..………..103Références bibliographiques
……….………..111Conclusion générale
……….………...……119Introduction générale
:
Le 21ème siècle s’ouvre e t de nombreuses maladies à fort taux de mortalité restent encore sans traitement. Dans certains cas, on devrait plutôt dire sans traitement adapté, car les malades du paludisme ou du SIDA meurent souvent faute de ne pas avoir accès à des traitements trop coûteux. Des résistances aux médicaments les plus utilisés ( e t les moins chers) se répandent. La recherche de nouvelles molécules, plus actives, bon marché, sans e f f e t s secondaires trop marqués, est aujourd’hui une urgence pour l’homme.
Les plantes sont depuis toujours une source essentielle de médicaments. Aujourd’hui encore une majorité de la population mondiale, plus particulièrement dans les pays en voie de développement, se soigne uniquement avec des remèdes traditionnels à base de plantes. De l’aspirine au Taxol, l’industrie pharmaceutique moderne elle-même s’appuie encore largement sur la diversité des métabolites secondaires végétaux pour trouver de nouvelles molécules aux propriétés biologiques inédites. Cette source semble inépuisable puisque seule une petite partie des 400 000 espèces végétales connues ont été étudiées sur les plans phytochimique et pharmacologique, et que chaque espèce peut contenir jusqu’à plusieurs milliers de constituants différents [1]. En Algérie il en existe 3000 espèces appartenant à plusieurs familles botaniques dont 15% sont endémiques [2] .
La diversité des espèces utilisées e t des métabolites secondaires déjà isolés l ai sse présager de l'ampleur de ce qui reste à découvrir. On considère effectivement que, jusqu’à ce jour, moins de 10 % des espèces de végétaux supérieurs qui peuplent actuellement la planète ont été explorées pour leurs propriétés chimiques e t biologiques.
On peut classer les métabolites secondaires en plusieurs grands groupes : parmi ceux ci, les composés phénoliques, les terpènes e t stéroïdes e t les composés azotés dont les alcaloïdes. Chacune de ces classes renferme une très grande diversité de composés qu i possèdent une très large gamme d'activités biologiques [3-5].
Parmi les milliers de plantes médicinales recensées à ce jour, ceux de la famille des astéracées (composées) l'une des plus grandes familles des angiospermes, avec environ 1100 genres et 25 000 espèces sont présentes dans pratiquement toutes les régions du globe.
Le genre Centaurea de la famille des composées , comptant environ 700 espèces et 600 sous-espèces, est très repandu en Algérie où il est représenté par 45 espèces dont 7 au sud [6,7].
Les espèces de ce genre sont utilisées dans la médecine traditionnelle pour leurs activités stimulante, tonique [8,9], antidiabétique [10,11], diurétique [12] et antirhumatismale [13].
Le genre Centaurea a fait l’objet d’un grand nombre d’études phytochimiques qui ont révélé la présence de sesquiterpènes [14-19], de triterpènes [20], de stéroïdes [21], d’alcaloïdes [22], de lactones sesquiterpéniques [23,24] et de composés phénoliques notamment les flavonoïdes [25-27].
Vu l’importance de ces plantes médicinales, plusieurs centaurées ont été étudiées dans notre laboratoire de recherche. Dans le but de continuer ces investigations, nous avons choisi de poursuivre l’étude de Centaurea nicaeensis All. variété walliana Maire.
Les principales parties de ce travail constituant quatre chapitres, sont traitées comme suit :
Le premier chapitre, consacré à l’étude bibliographique des flavonoїdes, renferme une présentation de leurs différentes structures chimiques , leur biosynthèse ainsi que leur intérêt thérapeutique. Il reporte également toutes les démarches et les méthodes nécessaires à la séparation, la purification et l’établissement de structures de cette famille de substances naturelles.
Dans le deuxième chapitre nous reportons sur un autre type des métabolites secondaires ; les lactones sesquiterpéniques. Cette étude inclut : leur difinition et leur classification, leur biosynthèse, leurs activités biologiques ainsi qu’une présentation des méthodes nécessaires à leur séparation, leur purification et l’établissement de leur structure.
Le troisième chapitre concerne la partie expérimentale relative à nos travaux ainsi qu’une présentation des techniques d’isolement et d’analyse utilisées.
Le quatrième chapitre reporte les résultats obtenus suivis de discussions et d’une conclusion générale.
І-1-Introduction :
Les flavonoïdes ont constitué un intérêt global croissant pendant la dernière décennie et, en raison de cette croissance dans la recherche, le nombre de flavonoïdes connus a augmenté considérablement. En effet, au début des années 90, le nombre de structures de flavonoïdes repportées était d’environ 4000 (Harborne,1994) [28], durant cette dernière decennie, ce nombre avoisine les 6500 structures différentes (Harborne et Baxter1999) [29].
І-2-Structure chimique et classification des flavonoϊdes :
Structuralement parlant, les flavonoïdes ont un squelette de base commun, constitué de 15 atomes de carbone répartis sur deux noyaux benzéniques (A et B) qui sont reliés par une chaîne linéaire de 3 atomes de carbone (Schéma 1) [30] formant en général un hétérocycle après condensation avec un OH phénolique du noyau A [31].
A
B
Schéma 1 : Squelette de base des flavonoïdes.
Tous les flavonoïdes peuvent être classés en plusieurs groupes selon le degré d’oxydation du cycle pyranique central (la chaîne en C3) [32], le noyau B est relié à l’hétérocycle C dans les positions 2, 3 ou 4 (Schéma 2) .
O
1
2
3
4
5
6
7
8
A
2
'
3
'
4
'
5
'
6
'
B
C
Schéma 2 :Différentes positions du cycle B sur l’hétérocycle C.
Selon la structure du cycle intermédiaire (cycle C), les flavonoïdes se répartissent en plusieurs classes de molécules dont les plus importantes sont : les flavones, les flavonols, les flavanones, les dihydroflavonols, les flavan-3-ols et les flavan-3,4-diols (Schéma 3).
O O O O OH O O OH O OH O A C 1 4 5 6 7 8 O O CH O O O OH O O OH O OH OH 3 3 3 3 4 Chalcones Flavanones Flavones Dihydroflavonols Dihydrochalcones Flavonoïdes Isoflavones Flavonols Aurones Anthocyanidines Flavan-3-ol Flavan-3,4-diol O 2 3 1' 2' 3' 4' 5' 6' B OH O 3
I-2-1-Flavones:
O
O
H
Schéma 4 : Structure chimique de base des flavones.
Tous les types des flavonoïdes dérivent de la 4,2’,4’,6’-tétrahydroxychalcone et par conséquent, possèdent tous au moins trois hydroxyles phénoliques en C-5, C-7 et C-4’, cela étant, l’un d’entre eux peut être absent.
Dans plus de 90% des cas, le cycle A des flavones est substitué par deux hydroxyles phénoliques en C-5 et en C-7. Ces hydroxyles peuvent être libres ou éthérifiés. D’autres substitutions sont possibles avec des fréquences variables: hydroxyles libres ou éthérifiés en C-7 et/ou en C-8, méthylation en C-7 ou en C-8, implication du C-6 et/ou C-8 dans une liaison carbone-carbone avec un sucre.
D’autre part, dans plus de 80% des cas, le cycle B est substitué en C-4’ ou disubstitué en C-3’ et C-4’, ou moins fréquemment trisubstitué en C-3’,C-4’et C-5’; ces substituants peuvent être des groupes hydroxyles (OH) comme ils peuvent être des methoxyles (OCH3). Les autres positions (C-2’ et C-6’) ne sont qu’exceptionnellement substituées.
Le tableau 1 rassemble quelques exemples de ce type de flavonoïdes isolés dans notre laboratoire de quelques centaurées algériennes.
Les centaurées Flavones Structures Réf C. incana 7,3’,4’,5’-tetramethoxy tricétine 7,3’,5’-trimethoxy tricétine 2’’-O-glucosyl-6-C-glucosyl apigénine 6-methoxy apigénine 6-methoxy lutéoline
7-O-methyl glucuronosyl apigénine 7-O-glucosyl hispiduline Vicénine-2 01 02 17 03 04 05 06 18 [27] C. pullata Jacéosidine Cirsilinéol 07 08 03 09 06 [33] Hispiduline Cirsimaritine 7-O-glucosyl hispiduline [34] C. parviflora Eupatorine Eupatiline Cirsilinéol 5,7,4’-trihydroxy-6,3’-dimethoxyflavone 10 11 08 07 12 13 19 [35] Genkwanine 5-hydroxy-6,7,3’,4-’tetramethoxyflavone 7,4’-dihydroxy-5-methoxyflavone [36] C. sphaerocephala Apigénine 3’- methoxy apigénine Lutéoline 6-methoxy lutéoline 14 15 16 04 [37]
Les structures des flavones de 01 à 16 sont les suivantes : O H O R2O R1 R3 OR4 R5 OH Structures R1 R2 R3 R4 R5 01 H Me OMe Me OMe 02 H Me OMe H OMe 03 OMe H H H H 04 OMe H OH H H 05 H Megluc H H H 06 OMe Glc H H H 07 OMe H OMe H H 08 OMe Me OMe H H 09 OMe Me H H H 10 OMe Me OH Me H 11 OMe H OMe Me H 12 H Me H H H 13 OMe Me OMe Me H 14 H H H H H 15 H H OMe H H 16 H H OH H H
Les structures des flavones de 17 à 19 sont les suivantes: O O OH H OH H H H H OH O OH H HO H H HO H OH O H O OH HO O O HO GlcC OH OH CGlc 17 18 O O HO OH O CH3 19
I-2-2-Flavonols:
O O A C B OHLes flavonols se distinguent des flavones par la présence d’un groupement OH en position C-3. Les variations structurales sont de même nature que celles décrites pour les flavones.
Le tableau 2 reporte quelques exemples de molécules de ce groupe et isolées dans notre laboratoire à partir de centaurées algériennes.
Les centaurées Flavonols Structures Réf
C. incana
6-methoxy quercetine
6-methoxy 7-O-glucosyl quercetine Rutine 6-methoxy kaempférol 7-O-glucosyl-3-methoxy myricétine 3,5’-dimethoxy-7-O-glucosyl myricétine 20 21 23 24 30 31 [27] C. pullata Kaempférol 7-O-glucosyl patulétine 3-O-glucosyl-6-methoxy kaempférol 25 21 26 [34] C. calcitrapa L. Kaempférol 6-methoxy kaempférol 7-O-glucosyl-6-methoxy kaempférol 3-O-rutinosyl kaempférol 3-O-glucosyl-6-methoxy kaempférol 3-O-glucosyl quercétine 3-O-glucosyl kaempférol 25 24 29 27 26 22 28 [38]
Les structures des flavonols de 20 à 23 sont les suivantes :
Les structures des flavonols de 24 à 28 sont les suivantes :
Les structures des flavonols de 29 à 31 sont les suivantes :
O O OH OH OH GlcO H3CO O O OH OCH3 OH GlcO OH OH 29 30 O O OH OCH3 OH GlcO OH OCH3 Structures R1 R2 R3 20 OMe H H 21 OMe Glc H 22 H H Glc 23 H H RhamGlc Structures R1 R2 24 OMe H 25 H H 26 OMe Glc 27 H Rut 28 H Glc O O OH OR3 OH OH R2O R1 O O OH OR2 OH HO R1
I-2-3 -Flavanones et dihydroflavonols :
O O HO OH OH O O HO OH OH OH Flavanone 32 dihydroflavonol 33Schéma 6 : Structures chimiques de base des flavanones et dihydroflavonols.
Les flavanones et les dihydroflavonols sont caractérisés par l’absence de la double liaison C-2 - C-3 et par la présence de centres d’asymétrie. Les variations structurales sont de même nature que celles décrites pour les flavones et les flavonols.
Les dihydroflavonols se distinguent des flavanones par l’ hydroxylation de la position C-3. Cette classe de flavonoïdes semble un peu moins fréquente que son homologue insaturé rassemblant les flavones et flavonols.
Les composés les plus distribués dans ces deux groupes de flavonoïdes sont la naringénine 32 et le dihydrokaempférol 33.
I-2-4- Flavan-3-ols, Flavan-3,4-diols et Anthocianidols :
O OH O OH OH O +
Flavan-3-ol Flavan-3,4-diol Anthocyanidol
Schéma 7 : Structures chimiques de base des Flavan-3-ols, flavan-3,4-diols et anthocyanidols.
A la différence des flavonoïdes ci-dessus décrits, ces trois groupes de molécules sont toujours hydroxylés en position C-3 et se caractérisent par l’absence du groupe carbonyle en C-4. Cette
position peut être libre (cas des 3-ols et anthocyanidols) ou hydroxylée (cas des flavan-3,4-diols).
Les flavan-3-ols et les flavan-3,4-diols sont à l’origine des polymères flavaniques appelés proanthocyanidols ou tanins condensés.
I-2-5- Chalcones et Aurones:
O O CH 2' 3' 4' 5' 6' 2 3 4 5 6 1' 4 5 6 7 O 2' 3' 4' 5' 6' 2 3 1 Aurone Chalcone β α
Schéma 8 : Structures chimiques de base des chalcones et aurones.
Les chalcones sont différents des autres types de flavonoïdes cités au-dessus. De par l’ouverture du noyau pyranique central, elles sont constituées par deux unités aromatiques reliées par une chaîne tricarbonée, cétonique, α, β-insaturée (Schéma 8). Le noyau B est assez fréquemment non substitué, alors que les substitutions sur le cycle A sont le plus souvent identiques à celles des autres flavonoïdes.
Les aurones sont caractérisées par une structure de 2-benzylidène-coumarone.
Pour ces deux types de molécules, la numérotation des positions est différente de celle des autres flavonoïdes décrits précédemment.
І-3-Distribution et localisation :
Les flavonoïdes sont largement abondants dans les légumes feuilles (salade, choux, épinards, etc…, ainsi que dans les téguments externes des fruits. Ils sont également présents dans le vin rouge et le thé.
Les céréales, les épices et les herbes aromatiques (persil, thym, céleri) sont considérés aussi comme des sources importantes de flavonoïdes. De nombreux travaux ont montré que certains
fruits et légumes sont très riches en flavonols, flavones et flavanones [39-41]. Le tableau 3 regroupe la distribution des flavonoïdes dans des sources alimentaires.
Flavonoïdes Aliments Flavanones
Naringénine 32 fruits du genre citrus
Flavones
Chrysine 34 apigénine 14 lutéoline 16
peau des fruits
persil, thym, romarin, céleri persil, céleri
Flavonols
Kaempférol 25 Quercétine 35 Myricétine 36
radis, brocoli, thé noir
oignon, pomme, olive, vin rouge, tomate canneberge, vin rouge
Flavan-3-ols Epicatéchine 37 catéchine 38 épigallocatéchine 39 thé vert, thé noir thé vert, thé noir vin rouge Anthocyanidols Cyanidol 40 Malvidol 41 Apigénidol 42 cassis, myrtilles raisins, fraises, cassis framboises, fraises
Tableau 3 : Sources alimentaires des flavonoïdes .
Les flavones apigénine 14 et lutéoline 16 sont très spécifiquement détectées dans les herbes aromatiques comme le persil, le thym, le romarin et le céleri. Pour ce dernier, les concentrations de ces deux flavones sont largement supérieures à celles présentes dans les tiges. Dans les tomates, il y a autant de naringénine 32 que de quercétine 35. Cette dernière se retrouve de façon majoritaire dans la quasi-totalité des végétaux. Le kaempférol 25, autre flavonol, y est également largement détecté.
Parmi les autres flavonoïdes souvent étudiés, les anthocyanes confèrent aux fruits et légumes leurs teintes rouges ou bleutées. Ils se trouvent surtout dans les myrtilles, cassis, airelles, groseilles, mais également, à un degré moindre, dans tous les autres fruits rouges comme les raisins, les fraises et les framboises. On peut aussi les trouver dans certains légumes comme le chou rouge et les radis.
Le monde animal est lui aussi concerné par les flavonoïdes. On trouve par exemple de la chrysine 34, de la quercétine 35 et de la galangine 43 dans la propolis des abeilles. Ces insectes les synthétisent à partir des sécrétions de bourgeons de nombreux arbres comme le bouleau, l’aulne, le sapin, et les modifient grâce à leurs enzymes salivaires.
O OH HO O 34 OH O OH HO O OH OH 35 OH O OH HO O OH OH OH 36 OH OH HO O OH OH 37 OH OH HO O OH OH 38 OH O OH HO O 43 OH OH HO O OH OH OH 39 OH OH HO O OH OH 40 OH OH HO O CH3 OH CH3 41 OH HO O OH 42
I-4- Propriétés des flavonoïdes :
Une des propriétés majeures des flavonoïdes est de contribuer à la couleur des plantes et notamment à celle des fleurs. Or, c’est par la couleur de ses fleurs que la plante exerce un effet attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs, ce qui assurent par ce biais, une étape fondamentale de sa reproduction.
On peut également noter que les flavonoïdes, en repoussant certains insectes par leur goût désagréable, peuvent jouer un rôle dans la protection des plantes.
Les flavonoïdes montrent d’autres propriétés intéressantes dans le contrôle de la croissance et du développement des plantes en interagissaant d’une manière complexe avec les diverses hormones végétales de croissance. Certains d’entre eux jouent également un rôle de phytoalexines, c’est-à-dire de métabolites que la plante synthétise en grande quantité pour lutter contre une infection causée par des champignons ou par des bactéries.
Par ailleurs, les flavonoïdes présentent un intérêt thérapeutique qui date de la découverte de la vitamine C par Szent Gyorgyi (Prix Nobel, 1937), chercheur de l’Université de Szeged (Hongrie), qui a constaté que les symptômes hémorragiques du scorbut, liés à la fragilité ou l’hyperperméabilité des vaisseaux, étaient guéris par des extraits de paprika ou de jus de citron, riches en vitamine C et flavonoïdes. Cette action a été appelée propriété vitaminique P (P étant la première lettre du mot perméabilité).
Malgré ces premiers résultats prometteurs, les recherches ne permirent pas ensuite d’attribuer un rôle essentiel aux divers polyphénols du monde végétal. A partir des années quatre-vingt, c’est la découverte du rôle des radicaux libres dans les processus pathologiques qui a relancé l’intérêt pour ces molécules dont les propriétés antioxydantes sont très marquées.
І-5- Activités biologiques des flavonoïdes :
Des études épidémiologiques ont montré qu’une consommation régulière de fruits frais et de légumes diminue le risque de développement des maladies cardiovasculaires et d’apparition de certains cancers [42]. Ces effets sont attribués, en partie, aux concentrations relativement importantes des flavonoïdes présents dans les fruits et les légumes.
Les flavonoïdes sont également reconnus pour leurs nombreuses activités biologiques, citons par exemple les activités : anti-allergiques et antivirales [43-45], anti-inflammatoires [46-48]. Ces activités sont en général attribuées à leur capacité à piéger les radicaux libres, chélater les ions métalliques ou inhiber les enzymes responsables de la formation des radicaux.
І-6- La biosynthèse des flavonoϊdes:
L’enzyme clé pour la formation du squelette flavonoique est la chalcone synthase (CHS) qui catalyse l’étape de condensation de trois unités acétate à partir de malonyl-CoA avec la 4-coumaroyl-CoA pour donner l’intermédiaire en C15, la 4,2’,4’,6’-tétrahydroxychalcone [49]. Cette chalcone est l’intermédiaire caractéristique de la synthèse des différentes classes de flavonoïdes (Schéma 9).
Les flavonoïdes peuvent ensuite être modifiés par des réactions d’hydroxylation, méthylation, glycosylation et acylation [50]. OH CoAS O COOH H2C CO-S-CoA 3 Malonyl-CoA 4-Coumaroyl-CoA Chalcone Synthase O 2',4',6',4-tetrahydroxychalcone OH HO OH OH Chalcone Isomérase O HO OH OH O Flavone Synthase Flavanone (naringénine ) O OH HO O OH Flavone (apigénine )
І-7- Principales substitutions du squelette flavonique :
Les composés flavoniques de chaque sous classe se distinguent par le nombre, la position et la nature des substituants (groupes hydroxyles, méthoxyles et autres) sur les deux noyaux aromatiques A et B et l’hétérocycle C.
I-7-1- L’hydroxylation :
D’une manière générale pour les flavones et les flavonols, et, d’après les réactions de biogenèse les hydroxyles en positions 5 et 7 du noyau A et l’hydroxyle en position 4’ du noyau B sont considérés comme originaux et existent avant la constitution du noyau chalcone [51].
L’hydroxylation du noyau B dans la position 3’ se fera après la fermeture de l’hétérocycle C, c'est-à-dire après la formation du squelette chalcone, tandis que la polyhydroxylation sur le noyau B (les positions 3’, 5’) se fera par le biais des enzymes (hydroxylases) [52, 53].
Les positions 2’ et 6’ du cycle B sont rarement hydroxylées [52].
I-7-2- La méthoxylation ou méthylation :
La méthylation par l’intermédiaire d’une jonction C-C se fait uniquement en C-6 et ou en C-8 par contre la fixation du groupement méthyle pour former un groupement methoxyle, se fait après celle du groupement hydroxyle et nécessite la présence d’une enzyme (O-methyltransferase) qui joue le rôle de transporteur à partir de la S-adenosyl-methionine (SAM) qui représente le donneur du radical méthyle. Cette transformation se fera avant la formation du noyau chalcone [54, 55].
Cette réaction de méthylation peut se faire sur le noyau A (carbones 5, 6, 7, 8), sur le noyau B (carbones 2’, 3’, 4’, 5’) et l’hétérocycle C (carbone 3) après la formation du noyau chalcone dans le cas de flavones et flavonols [54].
I-7-3- La O-glycosylation :
Elle s’effectue entre un hydroxyle du squelette flavonique et un hydroxyle alcoolique du sucre (glucose, rhamnose, xylose, galactose et arabinose). La O-glycosylation se fait en présence de l’enzyme Glycosyltransferase et un donneur de sucre comme UDP-Glu (Uridine diphosphate glucose).
L’hydroxyle de la position 7 constitue le site préférentiel de la glycosylation dans le cas des flavones alors que dans le cas des flavonols c’est l’hydroxyle de la position 3 [56].
I-7-4- La C-glycosylation :
Les flavonoïdes C-glycosylés ne sont pas rares, on y trouve plus de 350 hétérosides [57]. Dans ce type de composés, le sucre est lié directement au cycle benzénique par une liaison carbone-carbone. Cette liaison résiste à l’hydrolyse acide [58].
D’une manière générale, la liaison carbone-carbone est rencontrée souvent en position C-6 et ou en position C-8 .
І-8-Méthodes de séparation et d’analyse des flavonoϊdes :
І-8-1- Méthodes de séparation :
La séparation des composés flavoniques commence d’abord par l’extraction d’une quantité importante de plante macérée dans du méthanol ou de l’éthanol (solvant polaire) en présence ou non d’eau. Après filtration et concentration, l’extrait obtenu additionné d’eau distillée subit des affrontements successifs par des solvants de polarité croissante menant ainsi à une séparation partielle en fonction de la polarité des constituants. En général, ce travail débute par le chloroforme qui permet l’extraction des aglycones méthoxylés et hydroxylés, puis par l’acétate d’éthyle qui permet l’extraction des aglycones polyhydroxylés et monoglycosylés, et en dernier par le n-butanol qui accède aux hétérosides polyglycosylés. Les phases organiques ainsi obtenues sont séchées, concentrées et soumises à la batterie chromatographique pour la séparation. Les techniques usuelles utilisées pour la séparation des flavonoïdes sont en général :
І-8-1- a-La chromatographie liquide sur colonne (CC) :
Elle est basée sur l’utilisation d’une phase stationnaire comme le gel de silice, la cellulose ou le polyamide et une phase mobile constituée par divers systèmes de solvants comme éluant. Elle est la plus utilisée pour la séparation des quantités de mélanges importantes et complexes [59].
І-8-1-b- La chromatographie préparative sur papier (CP) :
Basée sur l’utilisation d’une surface plane de cellulose considérée comme support maintenant par imprégnation une phase stationnaire liquide, les systèmes de solvants les plus utilisés dans cette technique sont [60] :
• L’acide acétique 15 et 30 % constituant des systèmes aqueux.
• Le n-butanol / Acide acétique/ Eau (BAW) 4 /1/ 5 constituant un système organique.
І-8-1-c- La chromatographie préparative sur couche mince (CCM) :
Cette méthode est très simple et très rapide, elle est utilisée aussi bien pour la séparation que pour la purification. Elle se sert de diverses phases stationnaires et de systèmes d’élution solvants appropriés.
La purification ultime des composés phénoliques isolés se fait généralement sur une colonne de Sephadex LH20 en utilisant du méthanol pur comme éluant.
I-8-2- Méthodes d’analyse :
La fluorescence sous lumière UV, la valeur de Rf dans différents systèmes de solvants, les résultats de la spectrométrie de masse (SM) avec différents modes d’ionisation : impact éléctronique (IE), ionisation chimique (IC), electrospray (ESI) et bombardement par des atomes accélérés (FAB), la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) avec ses différentes expériences monodimensionnelles (1H, 13C, DEPT) et bidimensionnelles (COSY, HSQC, HMBC, COLOC, NOESY…) et la spectrophotométrie UV-Visible qui donne des indications importantes sur la nature du flavonoïde et son mode de substitution, sont les techniques utilisées pour l’identification et la détermination des structures flavoniques .
I-8-2-a- La fluorescence sous lumière de Wood :
L’absorption des substances flavoniques sous lumière de Wood à la longueur d’onde de 365 nm donne des renseignements préliminaires sur la structure chimique. Le tableau 4 montre la relation entre la fluorescence et la structure chimique [60].
La fluorescence Les structures possibles
Violette noire Flavones avec 5-OH
Flavonol avec 3-OR, 5-OH, 4’-OH Chalcones.
Bleue Flavone ou flavonol sans OH libre en 5. Flavanone avec OH en 3 ou flavanol. Flavonol avec 3-OH et sans 5-OH.
Jaune ou jaune terne Flavonol avec 3-OH, et avec ou sans 5-OH Orange fluorescente Isoflavones
Jaune-verte Aurones Bleue-verte Flavanone sans 5-OH
Tableau 4 : Relation entre la fluorescence sous lumière de Wood et les stuctures flavoniques
I-8-2-b- Facteur de retardement et comportement chromatographique :
La valeur du Rf est définie comme suit :
Distance entre l’origine et la tache du produit après élution Rf =
Distance entre l’origine etle front du solvant après élution
Cette valeur varie avec la nature du solvant utilisé (organique ou aqueux), le type de support chromatographique (gel de silice, polyamide, cellulose), la nature du produit lui-même (aglycone ou glycosyle), ainsi que de la disposition des différents substituants sur le squelette flavonique [59-61]. Le tableau 5 montre l’influence de la substitution du squelette flavonique sur la valeur du Rf.
Structure flavonique Rf
Augmentation des groupes hydroxyles Rf diminue dans les systèmes de solvants organiques et augmente dans les systèmes de solvants aqueux
Methylation des groupements hydroxyles Rf augmente dans les systèmes de solvants organiques et diminue dans les systèmes de solvants aqueux
Glycosylation
Rf diminue dans les systèmes de solvants organiques et augmente dans les systèmes de solvants aqueux.
Tableau 5 :
La relation entre le R
f et la structure flavonique.I-8-2 -c-La spectrophotométrie UV-Visible :
C’est la méthode la plus importante pour l’identification des structures flavoniques. Elle est basée essentiellement sur l’enregistrement d’un spectre dans un milieu alcoolique (méthanol ou éthanol) qui sera caractérisé par deux bandes d’absorption principales, la bande I et la bande II [62].
Ces deux bandes représentent les absorptions dans le proche UV, des chromophores composant le squelette flavonique. Ainsi, la bande I présentant un maximum d’absorption entre 300 et 400 nm, est attribuée à l’absorption du système cinnamoyle qui résulte de la conjugaison du groupement carbonyle avec la double liaison (C2-C3) et le noyau B, elle donne donc, des renseignements sur les variations structuralesdu cycle B et l’hétérocycle C (Schéma 10). La bande II, présentant un maximum d’absorption entre 240 et 280 nm, est attribuée à l’absorption du système benzoyle qui dérive de la conjugaison du groupement carbonyle avec le noyau A et donne des informations sur les variations structurales du cycle A [59] (Schéma 10).
O
O
A C
Absorption de la partie cinnamoyle bande I
Absorption de la partie benzoyle bande II
B
Schéma 10: Les bandes caractéristiques d’un squelette flavonique
Le tableau 6 donne l’intervalle du maximum d’absorption des deux bandes en milieu méthanolique pour quelques types de flavonoïdes.
Type de compose flavonique Bande I Bande II
Flavones 320-350
250-270
Flavonols 352-385
250-280
Flavanones 300-330
245-275
Tableau 6 : Relation entre le maximum d’absorption en UV et le type de flavonoïdes.
Le maximum d’absorption d’une telle ou telle bande dépend du nombre et de la position des groupements hydroxyles ou méthoxyles sur le squelette flavonique. L’augmentation du nombre de groupements hydroxyles fait déplacé le maximum d’absorption vers des longueurs d’onde plus élevées, par contre la substitution des groupements hydroxyles par des groupements méthoxyles ou glycosyles fait déplacé ce maximum vers des longueurs d’onde plus courtes [63].
I-8-2 -c-1-Addition de réactifs :
Le spectre méthanolique d’un composé flavonique sera modifié par addition d’un certain nombre de réactifs tels que NaOH, AlCl3, AlCl3+HCl, NaOAc et NaOAc+H3BO3. Ces réactifs réagissent avec les groupements hydroxyles par formation de sels et de complexes qui se
traduiront sur le spectre UV par des déplacements bathochromiques ou hypsochromiques des bandes d’absorption, permettant la localisation des hydroxyles libres sur le squelette flavonique.
• l’addition de AlCl
3et AlCl
3+ HCl :
L’addition de AlCl3 à la solution du flavonoïde dans le méthanol mène à la formation de complexes entre les hydroxyles ortho, l’hydroxyle en 3 et la fonction carbonyle et l’hydroxyle en position 5 et la fonction carbonyle [64]. Ce qui entraîne un effet bathochrome de la bande I. L’addition de HCl dans ce même échantillon provoque la disparition des complexes instables (complexe formé entre deux hydroxyles) et le maintien des complexes stables (hydroxyle et carbonyle). Ceci se manifeste par un déplacement hypsochrome de la bande I par rapport à celui en présence de AlCl3 et bien évidement un effet bathochrome moins important par rapport au spectre dans le méthanol pris comme référence.
• l’addition de NaOAc + H
3BO
3:
Le H3BO3 est additionné à l’échantillon en présence de NaOAc et les informations apportées indiquent l’existence ou l’absence de systèmes ortho dihydroxyle sur le cycle B ou sur le cycle A (6, 7 ou 7, 8) à cause des complexes formés. l’effet qui observé est un déplacement bathochrome de la bande I par rapport au spectre enregistré dans le méthanol [65].
•
l’addition de NaOH et de NaOAc :
NaOH :
L’addition du NaOH indique le nombre et la position des hydroxyles libres sur le squelette flavonique essentiellement les OH des positions 7, 4’et 3 par un effet bathochromique de la bande I, accompagné ou non d’une augmentation d’intensité renseignant ainsi sur un 4’-OH libre ou substitué. Dans ce spectre, la présence d’un 7-OH libre est déduite de l’apparition d’une nouvelle bande entre 320 et 335 nm. Par contre la décomposition de l’échantillon après cinq minutes indique la présence simultanée d’un 3-OH et d’un 4’-OH libres.
NaOAc :
Ce réactif sert à détecter les groupements hydroxyles essentiellement celui de la position 7 par un léger effet bathochrome de la bande II, il ionise les OH les plus acides comme les hydroxyles des positions 3, 7 et 4’ [65]. Le tableau 7 donne les informations obtenues des spectres en présence de réactifs [59, 66, 67]
Tableau 7 : Informations obtenues des séries spectrales UV-Vis
Réactifs Bande I Bande II Déplacement en nm Interprétation
MeOH 304-350 250-280 352-385 250-280 350-380 250-280 Flavones Flavonols (3-OH) Flavonols (3-OR) NaOH +44 à 65
1)- avec stabilité ou augmentation d’intensité 2)-avec diminution d’intensité une nouvelle bande entre 320-335
4’-OH 3-OH et 4’-OR 7-OH AlCl3/MeOH + 20 à 45 + 60 5- OH 3- OH AlCl3+HCl/AlCl3 -20 à -40 -20 à -25 Ortho di OH (noyau B) Ortho di OH (noyau A) +ortho di OH (noyau B) AlCl3 +HCl/MeOH + 17 à 20 + 35 à 55 + 50 à 60 5- OH (avec 6- oxygénation) 5-OH flavone et 3-OMe flavone 3- OH avec ou sans 5- OH NaOAc /MeOH + 5 à 20 Déplacement très faible Diminution d’intensité avec le temps Le spectre se décompose avec le temps 7- OH 7- OR 6, 7 ; 7, 8 ou 3’, 4’ di OH 5, 6, 7 ; 5, 7, 8 ou 3, 3’ ,4’ – tri OH NaOAc + H3BO3 + 12 à 36 + 5 à 10 3 ’, 4’ di OH 6, 7, ou 7, 8 di OH
I-8-2-d-La Spectrométrie de masse :
Cette technique permet la détermination du pic moléculaire des aglycones qui donne globalement le nombre et la nature des substituants hydroxyles ou méthoxyles [68, 69].
Les pics de fragmentation caractéristiques fournissent des renseignements utiles, notamment sur les structures des substituants des noyaux A et B [70]. Cette technique connaît un véritable succès dans ce domaine avec le développement de divers mode d’ionisation permettant l’analyse des structures glycosylés à l’état natif tels que la FAB, et l’électro-spray.
De nos jours, la spectrométrie de masse trouve diverses applications grâce au couplage avec les techniques chromatographiques. Ces techniques de couplage permettent des analyses très rapides et très rigoureuses.
I-8-2-e- La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) :
Très précise et très efficace, elle est couramment utilisée et permet entre autre : La localisation des protons de la molécule [70].
De déterminer le nombre, la nature et la position des sucres [71,72]. D'identifier les liaisons C-sucre et O-sucre.
D’identifier les substituants acylés et leur sites d’acylation. L’identification des substituants oxygénés.
Les tableau 8 et 9 contiennent quelques déplacements chimiques et constantes de couplage des protons du noyau A et du noyau B [73].
Protons du noyau A Nature du flavonoïde (H-5) δ, ppm J, Hz (H-6) δ, ppm J, Hz (H-8) δ, ppm J, Hz 5, 7 – OH 6,0-6,2 d 2,5 6,3-6,5 d 2,5
5-OH, 7-OR (R=Gluc.) 6,2-6,4 d 2,5 6,5-6,9 d 2,5
7-OR (R=H, sucre) 8,0 d 9 6,7-7,1 dd (9,0 ; 2,5) 6,7-7,0 d 2,5
5, 6, 7-OR R=H, sucre
5, 7, 8-OR 6,3 s
6,3 s
Protons du noyau A Nature du flavonoïde (H-5) δ, ppm J, Hz (H-6) δ, ppm J, Hz 5, 7 – OH 6,0-6,2 d 2,5
5-OH, 7-OR (R=Gluc.) 6,2-6,4 d 2,5
Tableau 9 : Les déplacements chimiques et constantes de couplage des protons du noyau B.
I-8-3 - L’hydrolyse acide des hétérosides :
Cette manipulation concerne dans un premier temps les flavonoïdes O-glycosylés, elle renseigne sur la nature du sucre qui peut être étudié une fois détaché ainsi que celle de l’aglycone. L’identification du sucre se fait par co-chromatographie avec des solutions authentiques.
Les hétérosides C-glycosylés résistent à l’hydrolyse acide, cette propriétés permet de différencier ce type de liaison dans les flavonoïdes glycosylés.
II-1-Introduction :
La famille des lactones sesquiterpéniques est très représentée dans la nature. Depuis les années 70, le nombre de structures élucidées n’a cessé d’augmenter pour dépasser, les 2500 molécules [74]. Plus de 5000 structures sont connues [75,76].
Les lactones sesquiterpéniques constituent un grand et divers groupe de métabolites secondaires, qui se distinguent dans leurs propriétés et leurs structures, elles sont appelées aussi les principes amers à cause de leur gout amer.
On les trouve dans plus de 15 familles de plantes et très majoritairement chez les Asteraceae [77]. Les lactones sesquiterpéniques sont fréquement localisées dans des poils sécréteurs situés au niveau des feuilles, des tiges et des bractées de l’inflorescence [78].
Les lactones sesquiterpéniques sont connues depuis 1830, date à laquelle le premier d’entre eux, l’α-santonine a été isolée sous forme cristalline [79].
O O
O Schéma 11
: α-santonine
II-2-Structure chimique des l actones sesquiterpéniques :
Les lactones sesquiterpéniques ont comme base un squelette de 15 atomes de carbone qui contient généralement au moins le groupe γ-lactonique, sa formation vient de trois unités isopronèques qui sont liées ensemble sous forme" tête-queue" en formant le composé 2,6,10-triméthyldodécane (Schéma 12).
Schéma 12 : Squelette de base des lactones sesquiterpéniques.
II-3- Classification des lactones sesquiterpéniques :
Les lactones sesquiterpéniques majoritaires dans le genre Centaurea sont: les germacranolides, les élémanolides, les eudesmanolides, les guaianolides et les héliangolides [80].
II-3-1-Les germacranolides :
Ce sont des composés monocycliques, leur squelette de base est un cycle à 10 atomes de carbone, avec deux doubles liaisons l’une entre C-1 et C-10 et l’autre entre C-4 et C-5. Ce cycle est attaché à un autre cyclique formé de 5 atomes caractérisant la fonction γ-lactone qui peut être fermée en 6 ou en 8 .
Le schéma 13 montre un exemple de germacranolide isolé de Centaurea lippi et de plusieurs autres centaurées dans notre laboratoire: la cnicine [81].
O O OH HO O O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 12 13 Schéma 13: La cnicine .
Des études réalisées sur les germacranolides ont montré que ce type de lactones sesquiterpéniques est constitué essentiellement de trois classes différentes : 6α,12-olide; 8α,12-olide et furanogermacrane [82]. Unité d’isoprène (x 3) Combinaison linéaire « tête-queue » 2,6,10-triméthyldodécane
II-3-2-Les élémanolides :
Ce sont des lactones sesquiterpéniques qui ont comme squelette de base un monocycle à 6 atomes de carbone, comme le montre le schéma 14, ce squelette est caractérisé par la stéréochimie α de la liaison C1-C10 et la stéréochimie β de la liaison C4-C5.
O O X 1 2 3 4 5 14 15 6 7 8 9 10 11 13 12
Schéma 14: Squelette de base des élémanolides.
Ils dérivent par un réarrangement de Cope des germacra-1(10),4(5)-diènolides [83,84] (Schéma 15). O O (CH3)2NH,MeOH O O NMe2 205ºC,N2,5min O O NMe2 1.CH3I 2.NaHCO3 O O
II-3-3-Les eudesmanolides :
Ils sont aussi appelés les sélinanolides, et ont comme squelette de base deux cycles hexagonaux, comme le montre schéma 16. La fermeture de la fonction γ-lactone peut s’effectuer aussi bien en 6 qu’en 8 avec une jonction cis comme avec une jonction trans.
O H O X 1 2 3 4 5 6 7 9 10 8 11 13 12 14 15
Schéma 16 :Exemple de squelette de base des eudesmanolides.
Ils dérivent généralement de la cyclisation trans annulaire entre C-5 et C-10 du système cyclodécadiène des germacra-1,5-diènes ou de leurs dérivés 1,10 et 4,5 époxydes [85], ces réactions peuvent être catalysées par un acide de Lewis.
Le schéma 17 montre la cyclisation du germacra-1,5-diène [86,87], formant un mélange de deux eudesmanolides via un cation intermédiaire.
Schéma 17: Formation d’élémanolide via le costunolide. + O H O O O O H O O H O + +H+ -H+ H+ β- cyclocostunolide α-cyclocostunolide Cation intermédiaire
II-3-4-Les guaianolides :
Les guaianolides constituent un large groupe de lactones sesquiterpéniques, ils ont comme squelette de base un cycle pentagonal et un autre heptagonal, comme le montre schéma 18 . Ce type de lactones sesquiterpéniques se distingue par la stéréochimie α des protons des positions 1 et 5.
O
O
HO
H
OH
H
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Schéma 18 : Deacylcynaropicine.II-3-5-Les héliangolides :
Ce sont des germacranolides avec des doubles liaisons de configuration E pour C-1, C-10 et Z pour C-4, C-5. Le squelette de base de ce type de composés est représenté dans le schéma 19 .
O O 1 2 3 4 15 10 9 8 7 12 5 11 6 13 14
II-4- Biosynthèse des lactones sesquiterpéniques :
La biosynthèse des α-méthylène-γ-lactones sesquiterpéniques serait la suivante: ces composés proviendraient de la cyclisation du trans,trans-farsényl-pyrophosphate. Une série de fonctionnalisations du cyclodécadiène obtenu permettrait ensuite de former une grande diversité de sesquiterpènes (Schéma 20). OPP co2Me O O O O O O HO HO HO O O O O HO O O ou Trans, trans-Farnésyl Pyrophosphate germacranolides guaianolides eudesmanolides
II-5-Activités biologiques des lactones sesquiterpéniques :
Plusieurs études ont tenté d’identifier le lien entre l’activité biologique et la structure de ces sesquiterpènes lactones[88-93].Celles-ci ont démontré que les α-méthylène-γ-butyrolactones alkyleraient, par réaction de Michael, des nucléophiles biologiques tels que la L-cystéine ou des enzymes contenant des thiols (Schéma21).
O O
O O
S-Enz
+ Enz-SH
Schéma 21: mode d’action supposé des α-méthylène-γ-lactones.
La réactivité des α-méthylène-γ-lactones insaturées avec les thiols et les amines, en particulier la cystéine[94-96], est bien établie et peut suggérer que la cytotoxicité des lactones sesquiterpéniques résulte de l’alkylation des centres nucléophiles de systèmes biologiques. Mais les γ-lactones α,β-insaturées endocycliques réagissent lentement avec la cystéine et certains adduits sont même inertes.
Un grand nombre de lactones sesquiterpéniques, dont la vernolépine, l’aromaticine, et l’éléphantopine, peuvent inhiber la prolifération des tumeurs. Elles présentent toutes une lactone α ,β-insaturée dont la double liaison conjuguée est exocyclique (Schéma 22).
O OH O O O H O O O O O O O O O O
En général, les lactones sesquiterpéniques possèdent des propriétés d’inhibition de la Farnésyl Protéine Transférase (FPTase).
La protéine Ras joue un rôle important [97] puisqu’elle régule le cycle de vie des cellules. Une altération de cette protéine entraîne une prolifération excessive de cellules, formant des tumeurs. Ce phénomène a été identifié dans plus de 30% des cancers humains.
La FTPase permet la farnésylation des protéines Ras. Cette étape est indispensable avant leur ancrage dans la membrane plasmatique. La FTPase est donc nécessaire à l’expression de la protéine Ras: inhiber la FTPase des cellules cancéreuses revient à annihiler le développement de tumeurs. Les agents inhibiteurs de FTPase, tels que les lactones sesquiterpéniques, sont donc des agents thérapeutiques pour le traitement des cancers.
Parmi les autres activités biologiques des lactones sesquiterpéniques ,on peut citer : l’activité inflammatoire [98-100], antimigraineuse [101], antioxydante [102], antifonqique [103-105], cytoprotectrice gastrique [106] et antimicrobienne[107].
Malgré l’importance des lactones sesquiterpéniques ces substances peuvent aussi être allergisante [108] et neurotoxique [109], car des allergies peuvent apparaître lors d'un contact direct ou indirect avec la plante. Des études ont montré que leur présence dans des plantes est responsable d’empoisonnement de mammifères.
II-6-Les méthodes de séparation et d’analyse des lactones
sesquiterpéniques :
II-6-1- Les Méthode de séparation :
Les travaux de la littérature montrent que plus de 90% des lactones sesquiterpéniques isolées et déterminées l’ont été à partir d’espèces de la famille des composées. Cependant, bien que certaines plantes soient de grandes accumulatrices de ces métabolites, le passage par des techniques de séparations chromatographiques différentes est obligatoire pour les atteindre.
Chercher des lactones sesquiterpéniques et faire leur séparation commence d’abord par l’extraction d’une quantité importante de plante macérée dans du méthanol ou de l’éthanol (solvant polaire) en présence ou non d’eau. Après filtration et concentration, l’extrait obtenu
additionné d’eau distillée subit des affrontements successifs par des solvants de polarité croissante menant ainsi à une séparation partielle en fonction de la polarité des constituants. En général, ce travail débute par de l’hexane ou de l’éther de pétrole pour récupérer les cires et les hydrocarbures suivi par au moins trois extractions au chloroforme pour avoir les lactones sesquiterpéniques moyennement polaires. Ces deux étapes sont suivies par une extraction à l’acétate d’éthyle dont l’extrait pourrait contenir des lactones sesquiterpéniques trop fonctionnalisées et enfin par des affrontements au n-butanol pour rechercher les produits beaucoup plus polaires tels les hétérosides souvent de type flavonoïde.
Les phases organiques ainsi obtenues sont séchées, concentrées et soumises à la batterie chromatographique pour la séparation. Les techniques usuelles utilisées pour la séparation des lactones sesquiterpéniques sont en général la chromatographie sur colonne et la chromatographie sur couche mince.
II-6-1- a- La chromatographie sur colonne :
Les lactones sesquiterpéniques ont des polarités similaires. En effet, leur séparation en produits purs est souvent complexe et consomme énormément de temps et de solvants.
L’étape initiale pour leur séparation est la chromatographie sur colonne utilisant le gel de silice comme phase stationnaire éluée par des systèmes de solvants en mode gradient ou en mode isocratique. Cette étape doit être précédée par une analyse par chromatographie sur couches minces pour rechercher l’éluant donnant la meilleure séparation.
Le tableau 10 rapporte quelques systèmes de solvants utilisés pour séparer les lactones sesquiterpéniques sur colonne.
Systèmes de solvant Proportions CHCl3- Me2CO 9:1; 7:1; 5:1; 3:1, 3:2; 1:1; 2:3; 1:3 Hexane-AcOEt 9:1; 4:1; 2:1; 1:1; 2:3; 1:3 Haxane-CHCl3- AcOEt 1:1:1; 1:1:2; 2:2:1 CHCl3-MeOH 99.5:0.5; 99:1; 98:2; 95:5; 50:1; 10:1 CHCl3-AcOEt 1:1 Hexane-Et2O 1:3 CH2Cl2-Me2CO 1:1 CH2Cl2-isPrOH 99:1; 98:2; 97:3; 19:1; 9:1; 3:1 Et2O-Toluène-CH2Cl2 1:1:1
Tableau 10 : Systèmes de solvants utilisés pour séparer les lactones sesquiterpéniques sur
colonne.
II-6-1- b- Chromatographie sur couche mince :
Cette méthode utilisée de manière analytique donne une idée sur la composition de l’extrait à étudier. De manière preparative, elle permet des séparations correctes suivies de purifications. Dans notre cas pour les lactones sesquiterpéniques le support fréquemment utilisé reste le gel de silice 60 avec indicateur fluorescent. La révélation des plaques preparatives se fait sous lumière UV à 254 nm.
Les plaques analytiques, peuvent être révélées sous lumière UV à 254 nm ou par pulvérisation de l’acide sulfurique suivie de chauffage à 100 °C pendant 3 minutes.
Cette dernière technique de révélation peut donner des informations sur la nature et la position de certains substituants sur le squelette sesquiterpénique de type guaianolide de la lactone en question en fonction de la couleur que prennent les spots après chauffage. Par exemple, une couleur verte indique la présence d’un groupement chlorométhylène en C-4 et un groupement hydroxyle en C-3 [110].
II-6- 2- Les Méthodes d’analyse :
Le développement des méthodes d’analyse de nos jours a facilité l’investigation structurale des molécules complexes, notamment celles des lactones sesquiterpéniques.
a- La spectroscopie d’absorption infrarouge (IR) montre la présence de la fonction γ – lactoneα, β-saturée ou α, β- insaturée par l’existence de bandes caractéristiques à 1780 ou 1755 cm-1 respectivement. Les bandes à 1740, 1735 et 1720 cm-1 respectivement confirment la présence d’un groupement acétate [111,112], esters saturés et esters insaturés.
Cette étape est définie comme étape initiale de l’identification des lactones sesquiterpéniques. b- La spectrométrie de masse avec ses divers modes d’ionisation permet en plus de la visualisation d’un pic pseudo moléculaire (ionisation douce) permettant d’arriver à la masse moléculaire [113], la détermination de la nature des substituants sur le squelette sesquiterpénique.
c- La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire est la technique la plus performante dans la recherche structurale des lactones sesquiterpéniques. En effet, les expériences multiimpulsionnelles et bidimensionnelles homo et hétéronucléaires permettent non seulement d’arriver à la structure mais peuvent donner d’excellentes informations sur la stéréochimie des centre asymétriques.
d- La diffraction des rayons X est également très utilisée. Elle donne toutes les informations nécessaires à l’établissement de la structure y compris la stéréochimie des centres chiraux mais exige une bonne cristallisation de l’échantillon.
III-1 - Etude phytochimique de Centaurea nicaeensis :
III-1.1 - Place dans la systématique :
III
-1.2 - Description de l’espèce Centaurea nicaeensis :
Centaurea nicaeensis est une plante bisannuelle à fleurs nettement jaunes et des tiges bien
marquées (Schéma 23). Elle est très polymorphe à feuilles inférieures pétiolées et lyrées, les supérieures sont sessiles et amplexicaules. Les capitules sont de 1-1,5 cm de large sur 2,5-3 cm de long, les akènes sont pâles de 3 mm de long et à aigrettes deux fois plus courtes.
Cette plante est assez répandue sur tout le Tell, dans les forêts claires et les pâturages arides [2]. Elle possède deux sous-espèces :
• Les bractées à appendices dont l’épine médiane est très marquée jusqu’à 2 cm et de couleur claire, elle est accompagnée de courtes épines en nombre variable (Schéma 24) ssp.
nicaeensis Q. et S. Embranchement Angiospermes Classe Dicotylédones Ordre Astérales Famille Compositae Sous-famille Tubiflores Tribu Cynarées Genre Centaurea
Schéma 24 : La fleur de Centaurea nicaeensis Q. et S.
• Les bractées à appendices dont l’épine médiane est très courte 3-4 mm et de couleur noire (Schéma 25) ssp. nicaeensis walliana M.
Schéma 25 : La fleur de Centaurea nicaeensis var. walliana M.
Nous nous sommes intéressés dans ce travail à la sous espèce nicaeensis var. walliana M.
III
-1.3- Travaux antérieurs:
Trois études sur Centaurea nicaeensis All. ont été effectuées au sein de notre laboratoire. La première concerne C. nicaeensis var.Q. et S. Cette étude a permis d’isoler 12 flavonoïdes, parmi lesquels 8 de type flavone et 4 de type flavonol [114]. Il s’agit de:
• 6-methoxy lutéoline (Népétine) 04 • 7-O-glucosyl hispiduline 06
• 6-O-methoxy chrysoeriol (Jacéosidine) 07 • 6, 7-dimethoxy chrysoeriol ( cirsilinéol) 08 • 3'-methoxy salvigenine 13
• 6, 8-di-glucosyl apigénine (Vicénine-2) 18 • 6-methoxy quercetine 20
• 7-O-glucosyl patulétine 21 • 6-methoxy kaempférol 24 • 7-O-glucosyl isoorientine 44 • 6-O-glucosyl isoorientine 45
• 7-O-glucosyl- 6 –methoxy isorhamnétine 46
O O OH OH OH R3O R2 R1
La deuxième étude également effectuée sur Centaurea nicaeensis var. Q. et S. reporte l’isolement de quatre lactones sesquiterpéniques [115] , il s’agit de:
Structures R1 R2 R3
44 H CGlc Glc
45 H CGlcOGlc H
• 11β-H, 13-dihydrocnicine : O O OH HO O O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 12 13 H 16 17 18 19 20 • 11β-H, 13-dihydrosalonitenolide : O HO H OH 1 2 3 4 15 5 10 9 8 7 6 11 13 12 O 14 • La mélitensine : O O OH 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 14 11 12 15 H H CH3 HO 13 • 5α,6β,7α,8β,11β-15-hydroxy-8-(1’, 2’-dihydroxyethyl)-acryloelema-1,3-dien-6,12-olide : O O 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 14 11 12 15 H H CH3 HO O OH O OH 13 16 18 17 19 20
La troisième a été effectuée sur Centaurea nicaeensis var. walliana M., soit la variété qui a fait l’objet de ce travail. Cette étude concernant l’investigation de la phase chloroforme de l’extrait hydro alcoolique a mené à la séparation de 2 composés flavoniques de type flavone [116]. Il s’agit de :
• 5,7,4’-triihydroxy 6, ,3’-dimethoxyflavone (Jacéosidine) 07 • 5,4’-dihydroxy 6,7,3’-trimethoxyflavone ( cirsilinéol) 08
III-2- Travaux personnels :
III-2-1- Extraction de Centaurea nicaeensis :
La plante a été récoltée au mois de juin 1998, des montagnes de Souk-Ahras. Après séchage dans un endroit sec et aéré à l’abri de la lumière directe du soleil, les parties aériennes broyées (feuilles et fleurs) sont pesées (m=1,95 kg).
Le matériel végétal a subit une macération dans un mélange hydroalcoolique (Ethanol/Eau) dans les proportions (70/30; v/v) pendant 24 heures. Cette macération est répétée 3 fois avec renouvellement du solvant. Les 3 extraits hydroéthanoliques sont réunis, concentrés à une température n’excédant pas environ 35 ºC.
La solution obtenue diluée avec de l’eau distillée à raison de 400 ml pour 1kg de matière sèche, est additionnée d’acétate de plomb [(CH3COO)4Pb] pour éliminer la chlorophylle par précipitation. Après filtration, la solution devenue rouge-brune, subit des extractions successives de type liquide-liquide en utilisant des solvants de polarité croissante en commençant par le chloroforme, puis l’acétate d’éthyle et en dernier le n-butanol.
Les trois phases organiques ainsi obtenues (chloroforme, acétate d’éthyle et n-butanol) sont séchées par du sulfate de sodium anhydre (Na2SO4), puis filtrées et concentrées à sec sous pression réduite.
Extrait chloroforme m = 35 g Extrait AcOEt m =23 g Phase organique
• Séchage par Na2SO4 anhydre
• Filtration
• Concentration à t = 35°C • Extraction par
Le n-butanol (x3) • Décantation
• Séchage par Na2SO4 anhydre
• Filtration
• Concentration à 60°C
• Extraction par de l’AcOEt (x1) • Décantation
Phase aqueuse
Phase organique
• Concentration non à sec (t = 35°C) • Dilution avec 760 ml de H2O
distillée.
• Précipitation de la chlorophylle par le (CH3COO)4Pb.
• Filtration
• Extraction par du CHCl3 (x3)
• Décantation
• Macération à froid dans un mélange EtOH/H2O (70 : 30 ; v/v) 3 fois 24h
• Filtration
Extrait éthanolique
Filtrat
• Séchage par Na2SO4 anhydre
• Filtration • Concentration à t = 35°C Extrait n-butanol m = 68 g m = 1950 g. Phase organique Phase aqueuse Phase aqueuse
L’investigation de l’extrait acétate d’éthyle a débuté par l’enregistrement d’un spectre de RMN de proton (spectre 1). Ce spectre montre la présence de signaux dans la zone attribuée aux terpenoïdes et également dans celle attribuée aux flavonoïdes.
Spectre 1 : Spectre de RMN du proton de l’extrait acétate d’éthyle.
III-2-2-Séparation chromatographique de l’extrait acétate d’éthyle :
III-2-2-1- Séparation chromatographique sur colonne :
La séparation sur colonne a débuté par une recherche sur plaques analytiques de gel de silice 60, du meilleur système d’élution. Les tests effectués ont montré que la meilleure séparation est obtenue avec le système (CHCl3/MeOH) dans les proportions (9/1) comme le montre le chromatogramme suivant (schéma 27).
Schéma 27 : Chromatogramme de l’extrait acétate d’éthyle dans le système CHCl3/MeOH (9: 1). Révélateur : L’acide sulfurique.
Ainsi, cette étude a débuté sur une colonne de gel de silice préparée dans le chloroforme où environ 14 g de l’extrait acétate d’éthyle y ont été déposés.
L’élution a été faite par du chloroforme avec un gradient de méthanol et un fractionnement tous les 25 ml. Le suivi de la composition des fractions a été effectué par chromatographie sur couche mince de gel de silice 60 sur support aluminium.
Les plaques sont visualisées sous lumière UV (λ=254 et 365nm) puis révélées par l’acide sulfurique et chauffées à 100 °C pendant 3 min. Les pots de même composition sont rassemblés, on obtient ainsi 28 fractions, le tableau 11 rassemble les résultats de cette colonne.
