Tracing back the early evolution of ParaHox genes and the ancestral neurogenic function of Gsx/Anthox2 in the developing sea anemone, Nematostella vectensis

Thesis

Reference

Tracing back the early evolution of ParaHox genes and the ancestral neurogenic function of Gsx/Anthox2 in the developing sea anemone,

Nematostella vectensis

QUIQUAND, Manon

Abstract

The Hox/ParaHox genes are chromosomally clustered genes encoding transcription factors that regulate neurogenesis in developing bilaterians. They emerged in early eumetazoan evolution, being already expressed in cnidarians, a prebilaterian phylum where the early steps of neurogenesis can be traced back. We first performed a systematic phylogenetic reconstruction of the Hox/ParaHox families and proposed that the ProtoHox gene most likely resembled the Gsx/Pdx genes. We then made use of the sea anemone (Nematostella) cnidarian model system to investigate the developmental role of Gsx. Thanks to neuronal markers that we identified to monitor neurogenesis in developing Nematostella, we could show in loss of function assays that Gsx/Anthox2 is likely involved in nerve net formation.

Moreover Gsx/Anthox2 upstream sequences drive expression in apical neurons, suggesting that they contain a neurogenic element to be identified. Our result provide advances about the genetic circuitry involved in the differentiation of neurons in early animal evolution.

QUIQUAND, Manon. Tracing back the early evolution of ParaHox genes and the ancestral neurogenic function of Gsx/Anthox2 in the developing sea anemone, Nematostella vectensis. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2009, no. Sc. 4101

URN : urn:nbn:ch:unige-46644

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:4664

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:4664

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UNIVERSITÉ DE GENÈVE FACULTÉ DES SCIENCES

Département de Zoologie et Biologie Animale Dr. Brigitte GALLIOT

Tracing back the early evolution of ParaHox genes and the ancestral neurogenic function of Gsx/Anthox2 in the developing sea anemone, Nematostella vectensis

THÈSE

présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention biologie

par

Manon QUIQUAND de

Nemours (France)

Thèse N ° 4101 Genève

Atelier d’impression ReproMail

2009

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au département de Zoologie et Biologie Animale de l’Université de Genève et financé par le Fonds National Suisse de la Recherche Scientifique et le Département de l’Instruction Publique de la République et du Canton de Genève.

Introduction

À l’Université Pierre et Marie Curie, entre Paris, Villefranche-sur-Mer et Montpellier, je remercie ceux qui m’ont transmis leur passion, m’ont donné l’envie de réaliser une thèse, et surtout ceux qui m’y ont aidé.

Méthodes

Je tiens à présenter toute ma reconnaissance à Brigitte Galliot, ma directrice de thèse, qui m’a encadrée pendant plus de cinq années et m’a donné l’opportunité de réaliser ce travail.

Merci Brigitte pour votre disponibilité, vos conseils et votre soutien qui furent au rendez-vous.

Je remercie les membres actuels et passés du laboratoire, ceux qui sont devenus plus que des collègues. Aussi merci aux membres des autres laboratoires du département qui se comportent souvent comme si je faisais partie du leur. Plus particulièrement merci aux Dr.

Juan Montoya et Dr. Cedric Berney pour leurs conseils en phylogénie.

Résultats

Je remercie les membres de mon comité de thèse pour leur temps et l’intérêt qu’ils ont porté à mon manuscrit: Dr. Evelyn Houliston, Dr. Jean-Stéphane Joly et Prof. Ivan Rodriguez.

Discussion

Je remercie mes ami(e)s pour les moments partagés, ceux avec qui j’ai travaillé pendant cette phase de rédaction, ceux qui m’ont aidée, ceux qui ont fini par tolérer qu’une thèse à l’Université de Genève dure souvent plus de trois ans.

Enfin je remercie ma famille, particulièrement ma mère et mon père, à lui je voudrais dédier cette thèse.

Conclusion Belle experience !!

Perspective Continuons l’aventure…

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was carried out at the Department of Zoology and Animal Biology, University of Geneva. Financal support for this work was provided by le Fonds National Suisse de la Recherche Scientifique and le Département de l’Instruction Publique de la République et du Canton de Genève.

I am grateful to Brigitte Galliot for giving me the oppotunity to conduct my thesis project in her laboratory. I would like to thank her for support during these years.

I would like to thank all past and present members of the laboratory for their help and the stimulating environment that they create everyday : Marijana Miljkovic-Licina, Simona Chera, Renaud de Rosa, Gaspare Benenati, Yvan Wenger, Wanda Buzgariu, Luiza Ghila, Anne Forget, Josefina Lascano, Pierre Heuze, Han Petry, Lisbeth Muster, Kevin Dobretz, Virginie Voeffray ;-), Janina Karpinsky, Fadi Hamdan, Philippe Jean. Thank you also to the far or close neighbouring of the department.

Thank you to my friends and my family.

Futhermore, I thank the members of my thesis comittee for their time and interest : Dr. Evelyn Houliston, Dr. Jean-Stéphane Joly and Prof. Ivan Rodriguez.

INDEX

REMERCIEMENTS...I ACKNOWLEDGEMENTS ...I INDEX ...II

RESUME...1

SUMMARY ...5

INTRODUCTION ...7

Le phylum des cnidaires ...8

I.1.1. Un phylum ancestral ...8

I.1.2. Diversité et cycle de vie chez les cnidaires...10

I.1.3. Développement embryonnaire des cnidaires...12

I.1.4. Organisation générale des cnidaires ...13

I.1.4.1 Axe(s) de symétrie chez les cnidaires...13

I.1.4.2 Organisation des tissus à partir de deux feuillets: l’ectoderme, l’endoderme, (mésoderme)...13

I.1.4.3. Organisation cellulaire de l’hydre ...14

I.1.4.4. Le système nerveux des cnidaires...15

Les neurones...15

Les cnidocytes...16

La transmission synaptique ...18

I.1.5. Nematostella vectensis : un nouveau modèle...19

I.1.5.1. Mode et cycle de vie de Nematostella ...20

I.1.5.2. Développement embryonnaire de Nematostella ...21

I.1.5.3. Organisation anatomique de Nematostella...22

I.1.5.4. Système nerveux de Nematostella ...23

I.1.6. Les cnidaires comme système modèle...24

I.1.6.1. Les différents modèles de cnidaires utilisés...24

I.1.6.2. Avantages et inconvénients du modèle anthozoaire Nematostella...25

I.1.6.3. Outils génétiques disponibles chez les cnidaires...26

I.1.7. Conservation des gènes et des voies de signalisation...27

Les gènes à homéoboîte ...28

I.2.1. Les mutations homéotiques et les gènes à homéoboîte ...28

I.2.2. La classe ANTP ...29

I.2.3. Rôle des gènes Hox dans la neurogénèse...30

I.2.3.1. Organisation des gènes Hox en complexes...30

I.2.3.2. La colinéarité spatiale et temporelle et la prévalence postérieure...32

I.2.3.3. Les gènes Hox fonctionnent comme des gènes sélecteurs ...33

I.2.3.4. Fonction au cours de la mise en place du système nerveux...34

I.2.4. Rôle des gènes ParaHox...35

I.2.4.1. Phylogénie des gènes ParaHox ...35

I.2.4.2. Gènes ParaHox en complexes et notion de complexe « ProtoHOX » ancestral ...36

I.2.4.3. Fonction des gènes ParaHox au cours du développement...38

I.2.5. Les gènes Hox/ParaHox chez les cnidaires...39

I.2.5.1. Familles Hox/ParaHox représentées chez les cnidaires et leur liaison génétique...39

I.2.5.2. Patron d’expression des gènes Hox chez les cnidaires...40

I.2.6. Approche évolution-développement ...41

La neurogénèse : une innovation clé au cours de l’évolution ... 42

I.3.1. Inversion de l’axe dorso-ventral ...42

I.3.2. Développement du patron neuronal chez les bilatériens...43

I.3.2.1. L’induction neurale : la cascade de signalisation BMP...44

La cascade de signalisation BMP... 44

Patron d’expression des BMP et de leurs antagonistes ... 44

Ectoderme versus neuroectoderme ... 45

I.3.2.2. Les gènes d’identité neurale : vnd/Nkx2.2, ind/Gsh, msh/Msx1/2 ...46

Patron d’expression et fonction ... 46

Régulation par la cascade BMP ... 46

Dominance ventrale ... 47

I.3.2.3. Spécification spatiale et temporelle du destin nerveux...48

I.3.3. La neurogénèse chez les cnidaires : acteurs génétiques conservés ...49

Considération évolutive ... 50

Objectifs du travail ...51

RESULTATS ... 55

II.1. CHAPITRE 1 : Phylogénie des gènes Hox et Parahox ... 55

II.2. CHAPITRE 2 : Analyse d’un régulateur précoce de la neurogénèse chez Nematostella vectentsis, Anthox2...89

II.3. CHAPITRE 3 : Evolution de la neurogénèse...125

DISCUSSION ...151

Organisation ancestrale des gènes Hox et ParaHox ...151

III.1.1. Une méthode originale pour reconstruire l’évolution des gènes Hox et ParaHox... 151

III.1.2. Duplication en tandem d’un complexe ProtoHOX versus duplications multiples de gènes de type Hox... 154

III.1.3. Les gènes ParaHox ont-ils un mode d’expression conservé au cours de l’évolution ? .. 155

Rôle des gènes ParaHox dans l’apparition de nouveaux types cellulaires...156

Conclusions ...158

Perspectives concernant les cnidaires en tant que modèles de développement et d’évolution...160

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...163

ANNEXES... 175

Cartes des plamides / Plasmid maps...175

Séquences des gènes et amorces / Gene sequences and primers ...275

CURRICULUM VITAE………... 285

RESUME

Les cnidaires (anémone de mer, hydre, méduse) représentent un phylum ancestral, groupe frère des bilatériens. Ils sont vraisemblablement les premiers avec les cténophores à utiliser un système nerveux différencié présentant une organisation à la fois diffuse et centralisée chez les cnidaires. Ils représentent donc un modèle de choix pour l’étude des gènes et des mécanismes de régulation liés à l’apparition de la neurogénèse.

Les processus neurogéniques chez les bilatériens impliquent différentes classes de facteurs de transcription, comme les gènes des familles bHLH et à homéoboîte, et reposent sur des cascades génétiques hautement conservées. Nombre de ces acteurs sont également retrouvés chez les cnidaires. Tandis que certains sont apparus chez l’ancêtre commun aux eumétazoaires comme par exemple les gènes à homéoboîte des familles Hox et ParaHox d’autres sont apparus plus tôt chez l’ancêtre commun aux métazoaires et sont donc retrouvés chez les éponges, qui bien que possèdant des cellules sensorielles ne présentent pas encore de neurones.

Ce travail s’appuie sur l’hypothèse selon laquelle la comparaison des familles de gènes et des cascades de régulation qui régissent la neurogénèse chez les cnidaires et les bilatériens pourraient fournir des arguments permettant de mettre en place des scénarios évolutifs. Les questions que nous avons posées au cours de ce travail sont donc les suivantes : Comment les familles de gène impliquées dans la neurogénèse se sont-elles diversifiées? Est-il possible d’identifier des acteurs neurogéniques ancestraux et comment les réseaux génétiques et les modes de régulation liés à la neurogénèse ont-ils évolué? Nous avons utilisé trois approches différentes pour apporter des éléments de réponses. Tout d’abord, au moyen d’analyses phylogénétiques, nous avons porté notre attention sur l’histoire évolutive des familles Hox et ParaHox depuis leur apparition chez les eumétazoaires. Nous avons ensuite mis en place une approche fonctionnelle en nous focalisant sur le rôle du gène ParaHox Gsx/Anthox2 au cours du développement de Nematostella, représentant un acteur potentiel ancestral de la neurogénèse. Enfin dans un travail synthétique, nous avons recensé les acteurs connus pour leur fonction dans la neurogénèse chez les bilatériens qui sont également représentés chez les cnidaires.

Pour reconstruire l’histoire évolutive des familles de gènes Hox (PG1, PG2, PG3, PG4-9) et ParaHox (Gsx, Pdx, Cdx), toutes les séquences de cnidaires connues pour êtres relatés aux familles Hox et ParaHox ont été confrontées aux familles Hox et

ParaHox de nombreux phyla bilatériens au travers d’analyses phylogénétiques. Notre premier résultat fut d’identifier des séquences hautement dérivées qui se sont avérées perturbatrices du message phylogénétique. Nous avons donc mis au point une méthode permettant de tester la solidité des nœuds des familles et de mettre en évidence les relations phylogénétiques qui existent entre elles. Cette approche a permis de caractériser pour la première fois des gènes de cnidaires appartenant à la famille ParaHox Pdx impliquant donc que ces organismes possèdent en réalité les trois familles ParaHox, Gsx, Pdx, Cdx. De plus, de nombreuses séquences de cnidaires forment des groupes isolés spécifiques à ce phylum, soit orphelins, soit plus probablement relatés aux familles postérieures. Par ailleurs notre méthode a révélé que les familles Hox étaient moins bien conservées que les familles ParaHox au sein des eumétazoaires. Enfin, nous montrons que les familles ParaHox Gsx et Pdx forment un groupe monophylétique avec les familles Hox PG2 et PG3 à l’exclusion de PG1. Ces résultats nous ont mené à l’hypothèse d’un complexe ProtoHOX à trois gènes contenant les paralogues Gsx/PG2, Pdx/PG3, Cdx/PG9, qui aurait pu donner après une duplication en tandem les complexes HOX et ParaHOX primitifs présents chez l’ancêtre commun aux eumétazoaires.

La seconde partie de ce travail est consacrée à l’étude ciblée du gène ParaHox Gsx/Anthox2 chez Nematostella vectensis (anémone de mer). Ce gène ParaHox, représente un acteur potentiel de la mise en place du système nerveux, partagé par les cnidaires et les bilatériens, chez qui la structure, l’expression et la fonction sont très conservées. Son expression a été détectée au cours du développement de Nematostella dans des cellules reconnues comme des précurseurs neuronaux et dans des neurones différenciés. Nous avons suivi une approche fonctionnelle consistant tout d’abord à sélectionner des marqueurs cellulaires reflétant le développement neuronal normal chez Nematostella. Grâce à l’injection de morpholinos au stade une cellule nous avons pu montrer qu’Anthox2 était un régulateur précoce de la neurogénèse. Enfin, nous avons mis au point une technique d’injection de gènes rapporteurs pour disséquer la régulation de ce gène. Ceci nous a permis d’observer l’expression d’un transgène portant 3 kb de séquences amonts du gène Anthox2, dans des cellules dont la forme et la localisation sont évocatrices des cellules neuronales.

Nous avons également localisé une région portant un potentiel élément répresseur.

Dans la troisième partie, nous faisons une synthèse sur la mise en place du système nerveux chez les cnidaires au niveau cellulaire ainsi que sur les cascades de signalisation et les facteurs de transcription dont l’expression et la fonction chez les cnidaires suggèrent une implication dans la neurogénèse, comme chez les bilatériens.

Nous montrons que les neurones et les nématocytes, cellules qui composent le système nerveux des cnidaires, partagent un certain nombre de gènes régulateurs suggérant que ces cellules pourraient descendre de la même cellule ancestrale. La combinaison de ces résultats nous conduira à discuter de l’évolution des gènes ParaHox, des types neuronaux et des différentes étapes de la neurogénèse.

SUMMARY

Cnidarians (sea anemones, hydras, medusaes), sister group to bilaterians, are considered as an ancestral phylum. They are likely the first with Ctenophora to use a differentiated nervous system. In cnidarians this organization is both diffused and centralized. Thus, they represent a model of choice to study genes and regulation mechanisms link to neurogenesis appearance.

Bilaterians neurogenic processes involve different classes of transcription factors as bHLH and homeobox genes and rely on genetic cascades highly conserved. Many of those actors are found in cnidarians as well. While some of them appeared in the common ancestor of eumetazoans as homeobox genes belonging to Hox and ParaHox families, others appeared earlier in the common ancestor of metazoans as they are found in sponges, that do not present neurons but already sensory cells.

This work relies on the hypothesis that the comparisons of gene families and regulation cascades, which govern neurogenesis in both cnidarians and bilaterians could provide evidences allowing to propose evolutive scenarios. The following questions were addressed in this work: How gene families involved in neurogenesis were diversified ? Is it possible to identify ancestral neurogenic actors and how genetic regulatory networks and regulation mechanisms evolved? We used three different approaches to provide answer elements. First, by using phylogenetic analysis, we focused on the evolutive history of Hox and ParaHox families since their appearance in eumetazoans. Then, though a functional analysis, we focused on the role of the ParaHox Gsx/Anthox2 gene in developing Nematostella. This gene is a putative ancestral actor involved in neurogenesis. At last though a synthetic work, we made a census of actors known for their function in neurogenesis in bilateriens and that are also present in cnidarians.

To reconstruct the evolutive history of Hox (PG1, PG2, PG3, PG4-9) and ParaHox (Gsx, Pdx, Cdx) families, all cnidarian sequences related to Hox and ParaHox families were compared to Hox and ParaHox sequences from numerous bilaterian phyla through phylogenetic analyses. The first result identified highly derived sequences that blurred the phylogenetic signal. Therefore we set up a method to test robustness of node families and to highlight phylogenetic relations that exist between them. By this way, we characterized for the first time cnidarian genes belonging to the ParaHox Pdx family meaning that in fact cnidarians possess the three ParaHox gene families, Gsx, Pdx, Cdx. In addition, many cnidarian sequences appeared as isolated groups specific

to this phylum either orphans or the most likely related to posterior families. Moreover, our method revealed that cnidarian Hox families were less conserved than ParaHox ones. At last, we showed that Gsx and Pdx ParaHox families branched as monophyletic groups with the PG2 and PG3 Hox families excluding the PG1 one.

From those results we proposed a model of a three genes ProtoHOX cluster bearing Gsx/PG2, Pdx/PG3, Cdx/PG9 paralog genes. The primitif HOX and ParaHOX cluster existing in the commun ancestor of eumatazoan arosed after tandem duplication of the ProtoHOX cluster.

The second part of this work consisted in the specific study of the Gsx/Anthox2 ParaHox gene in Nematostella (sea anemone). This ParaHox gene is a putative actor involved in the nervous system development and shared by cnidarians and bilaterians, where the structure, the expression and the function are sonserved. Its expression was detected during Nematostella development in cells recognized as neuronal precursors or differentiated neurons. We followed a functional approach consisting first in the selection of cellular markers reflecting the normal neuronal development in Nematostella. Thanks to the morpholino injections at the one cell stage we showed that Anthox2 was a precocious regulator of the neurogenesis. At last, we set up the reporter gene injections in Nematostella to dissect the regulation of this gene. That allowed us to observed the expression of a transgene carrying 3 kb of the upstream sequences of the Anthox2 gene, in cells whose the shape and the localization evoked neuronal cells. We also charaterized a region carrying a putative repressor element.

In the third part, we did a synthesis of the cellular processes taking place in cnidarian neurogenesis as well as the cascades of signalisation and transcription factors, whose expression and function in cnidarians suggest that they are implicated in neurogenesis, as in bilaterians. We showed that neurons and nematocytes, cells that composed the nervous system in cnidarians, shared many regulatory genes suggesting that they could come from a common ancestral cell. Taken together those results will lead us to discuss ParaHox genes and neuronal types evolution as well as the different steps of neurogenesis.

INTRODUCTION

Les processus neurogéniques reposent sur des mécanismes qui impliquent des cascades génétiques et des facteurs de transcription conservés chez les bilatériens.

Les familles de facteurs de transcription qui interviennent dans la neurogénèse sont diversifiées et comprennent des homéoprotéines, des protéines basic-helix-loop-helix (bHLH – basique-hélice-boucle-hélice), zinc finger (doigt de zinc), Sox, Fox, basic leucin zipper (b-ZIP – basique-fermeture leucine) ou encore Runx. L’étude de ces gènes chez les cnidaires et en particulier la comparaison de ces gènes et de leur fonction avec ceux présents chez les bilatériens, offre la possibilité d’élucider leur diversification génétique qui a eu lieu précocement au cours de l’évolution ainsi que la fonction ancestrale de ces familles de gènes. Les gènes Hox et ParaHox (Gsx, Pdx, Cdx) codent pour des homéoprotéines, dont les séquences sont hautement affiliées et très conservées au cours de l’évolution. Chez les bilatériens, les gènes Hox participent à la détermination de la polarité antéro-postérieure embryonnaire, particulièrement du cerveau postérieur en développement. Le gène Gsx est impliqué dans la mise en place du patron dorso-ventral du système nerveux, dans la prolifération et la détemination des précurseurs neuronaux. Les cnidaires sont les premiers animaux du règne animal avec un système nerveux différencié leur permettant d’avoir des comportements actifs. Par ailleurs, ils sont aussi les premiers à posséder des gènes Hox et ParaHox. Ils représentent donc un modèle particulièrement informatif pour retracer les premières étapes qui ont permis l’apparition de la neurogénèse et de mettre en évidence les acteurs génétiques clés qui ont mené à cette innovation dans le règne animal.

Nous avons utilisé des représentants du phylum des cnidaires pour répondre à trois questions. 1) Quelle est l’origine des gènes Hox et ParaHox ? (Résultats-Chapitre 1) (Quiquand et al., 2009). 2) Le gène ParaHox Anthox2/Gsx a-t-il un rôle ancestral dans les mécanismes de neurogénèse ? (Résultats-Chapitre 2). 3) Quels acteurs clés de la neurogénèse connus des bilatériens sont représentés chez les cnidaires ? (Résultats- Chapitre 3) (Galliot et al., 2009).

Dans cette introduction, nous verrons pourquoi les cnidaires sont des systèmes modèles intéressants pour étudier divers mécanismes développementaux qui dépassent leur propre phylum. Nous décrirons l’aspect fonctionnel des gènes Hox et ParaHox chez les bilatériens en nous focalisant d’avantage sur leur implication dans la mise en place du système nerveux. Nous nous pencherons ensuite sur l’origine de ces

gènes à travers le phylum des cnidaires. Enfin, nous décrirons les mécanismes intervenant précocement au cours de la mise en place des territoires nerveux chez les bilatériens et nous verrons quels acteurs sont également connus chez les cnidaires.

Le phylum des cnidaires

Les cnidaires actuels sont les repésentants d’un phylum ancestral qui a divergé avant l’apparition des bilatériens. Après avoir relaté leur grande diversité morphologique et de mode de vie, nous regarderons plus précisement la manière dont ces organismes sont organisés avec une attention plus particulière pour l’anthozoaire Nematostella vectensis. Nous regarderons les différents modèles cnidaires utilisés et nous intéresserons aux différents outils de biologie moléculaire déjà disponibles permettant de disséquer les mécanismes développementaux. Bien que moins complexes que les bilatériens, les cnidaires possèdent néanmoins de nombreux gènes et cascades de régulations connus chez les bilatériens.

I.1.1. Un phylum ancestral

Les métazoaires forment un groupe monophylétique comprenant tous les descendants de l’ancêtre commun aux éponges et aux eumétazoaires (Medina et al., 2001). La plus grande majorité des représentants de cet embranchement appartient au phylum des bilatériens dont l’ancêtre commun possédait une symétrie bilatérale.

Les cnidaires (du grec knide= ortie et du latin aria= qui ressemble, comme) comprenant les anémones de mer, les coraux, l’hydre ainsi que les méduses et les cténophores (Ctenophora, du grec ktenos, « peigne » et phorein, « porter) sont les deux phyla d’eumétazoaires n’appartenant pas aux bilatériens regroupés sous le nom de Radiata. Les manuels de zoologie distinguent les radiaires des bilatériens en comparant les axes de leur corps, leur symétrie et le nombre de couches tissulaires germinales. Tandis que les bilatériens sont des organismes triploblastiques, c’est-à- dire dérivant de trois couches tissulaires embryologiques (endoderme, ectoderme et mésoderme), présentant une symétrie bilatérale, avec deux axes principaux de polarité (antéro-postérieur et dorso-ventral), les radiaires sont des organismes à symétrie radiaire, diploblastiques, dérivant de deux couches tissulaires (endoderme et ectoderme) et ne possédant qu’un seul axe de polarité (oral-aboral). Nous verrons plus loin que cette définition est pour le moins simpliste (voir I.1.4.1-2, I.1.5.3.).

Des données fossiles indiquent que le phylum des cnidaires est apparu très tôt au cours de l’évolution (Chen et al., 2000; Chen et al., 2002; Cartwright et al., 2007), avant l’explosion Cambrienne (-543 millions d’années). Le modèle de l’horloge

moléculaire estime par ailleurs l’émergence des eumetazoaires à environ -725 millions d’années et celle des bilatériens à environ -700 millions d’années (Peterson et al., 2008). Les cnidaires sont donc apparus il y a environ 700 millions d’années, avant l’émergence des bilatériens (protostomiens et deutérostomiens) (Figure 1).

Figure 1: Phylogénie du monde animal modifié à partir de (Adoutte et al., 1999). La position des cnidaires et des cténaires par rapport aux bilatériens est incertaine. Les organismes bilatériens sont divisés en trois branches principales : les ecdysozoaires (invertébrés à mues comme les arthropodes ou les nématodes), les lophotrochozoaires (invertébrés sans mues comme les mollusques ou les annélides) et les deutérostomiens incluant les chordés, les hémichordés et les échinodermes (Mieko Mizutani and Bier, 2008). Les eumétazoaires regroupent les cnidaires, les cténophores et les bilatériens. Les placozoaires ne sont pas représentés sur cet arbre. Une étude phylogénétique récente les place en position basale des eumétazoaires, avant le séparation cnidaires-bilatériens mais après la divergence des éponges (Srivastava et al., 2008). Schéma pris de (Miller et al., 2005).

Cette position phylogénétique, comme groupe frère aux bilatériens, fait des cnidaires un modèle de choix pour des études comparatives visant à reconstruire l’histoire évolutive (Collins, 1998; Medina et al., 2001). L’extrapolation la plus exacte possible de l’organisation et des mécanismes de développement existant chez l’ancêtre commun aux cnidaires et aux bilatériens est un élément indispensable, nécessaire pour reconstruire les changements évolutifs fondateurs dans l’histoire des

eumétazoaires. Ils précèdent l’élaboration d’organismes de plus en plus complexes présentant des innovations spécifiques aux bilatériens comme des modifications de l’organisation du plan du corps (Martindale et al., 2002). Un groupe externe aux bilatériens est essentiel pour comprendre la condition ancestrale, la diversité et la complexité des organismes à symétrie bilatérale (Miller and Ball, 2000). L’étude des cnidaires devrait permettre d’identifier les caractères anatomiques ou génomiques déjà présents chez l’ancêtre commun des eumétazoaires. De plus, dans le cadre de la biologie du développement, les informations apportées par ce phylum sont uniques puisque ces animaux se développent de manière sexuée et asexuée, régénèrent et maintiennent par ailleurs constamment leurs conditions homéostatiques (Galliot and Schmid, 2002; Holstein et al., 2003; Darling et al., 2005; Reitzel et al., 2007) (voir I.1.2., I.1.5.1.).

Pour le premier travail consacré aux gènes Hox et ParaHox (II.1. Chapitre 1), nous avons utilisé les cnidaires comme modèle de la condition existante chez l’ancêtre commun aux eumétazoaires, pour retracer les étapes évolutives de ces gènes, jusqu’à la condition bilatérienne. Le deuxième travail consacré à l’étude spécifique du gène ParaHox Anthox2/Gsx chez Nematostella (II.2. Chapitre 2) cherche à retracer la fonction ancestrale de ce gène chez les cnidaires, donc lors de l’apparition de la neurogénèse. Dans la troisième partie, relative à l’origine de la neurogénèse (II.3.

Chapitre 3), les cnidaires sont là encore utilisés comme représentants de l’état primitif qui existait lors de la mise en place du premier système nerveux chez les animaux.

I.1.2. Diversité et cycle de vie chez les cnidaires

Les cnidaires se distribuent en deux classes : les anthozoaires, exclusivement polypes (anémone de mer, corail), et les médusozoaires qui alternent la forme méduse et la forme polype au cours de leur cycle de vie et auraient inventé la forme méduse (Collins, 2002; Marques and Collins, 2004). Parmi les médusozoaires, on distingue classiquement les hydrozoaires (hydre, méduses de type Clytia, Cladonema – avec yeux -, Podocoryne), les scyphozoaires (méduses de type Aurelia) et les cubozoaires (méduses de type Tripedalia). Des données moléculaires indiquent que les anthozoaires sont apparus les premiers (Bridge et al., 1995; Odorico and Miller, 1997). Ils sont supposés avoir divergé des autres cnidaires il y a environ 575 millions d’années (Chen et al., 2002; Peterson and Butterfield, 2005) (Figure 2).

Figure 2: Relations phylogénétiques au sein du phylum des cnidaires. Les anthozoaires sont les seuls représentants de ce groupe à ne posséder qu’un seul stade : le stade polype.

Les hydrozoaires, les cubozaoires et les scyphozoaires ont un cycle de vie qui alterne entre un stade polype fixé et un stade méduse libre. L’importance de chacun des stades varie suivant le groupe considéré. Schéma pris de (Miller et al., 2005).

Composés d’environ 11 000 espèces (Figure 3), les cnidaires sont pour 99% d’entre eux des organismes marins. Cependant certaines espèces, comme l’hydre ou la méduse Craspedacusta sowerbyii (deux hydrozoaires), vivent en eau douce (Bouillon, 1994). Leurs cycles de vie et donc leurs modes de reproduction sont complexes et variés. Classiquement, ils alternent entre un stade polype et un stade méduse. Le polype fixé peut être solitaire ou colonial et bourgeonne par reproduction asexuée des méduses. Ces dernières vivent sous forme pélagique et accomplissent la reproduction sexuée externe. La larve nageuse produite après fécondation, appelée planula, se posera sur le substrat pour se métamorphoser en polype (Figure 4). Et ainsi de suite…

Figure 3 : Diversité des cnidaires. A) Le corail rouge et B) l’anémone de mer sont des anthozoaires. C) L’hydre est un hydrozoaire. D) Méduse cubozoaire. E) Méduse scyphozoaire.

Figure 4 : Cycle de vie complet d’un hydrozoaire (Clytia hemisphaerica) avec une alternance entre deux phases : méduse et polype. A) Stade méduse. B) Cycle de vie (Tardent, 1978). C) Stade polype.

Il existe cependant des alternatives à ce schéma classique. Chaque classe de cnidaires est définie par l’importance relative de chacun des stades de vie. Les deux stades de vie sont souvent capables d’accomplir des cycles de reproduction asexuée (bourgeonnement et régénération). Certaines espèces vivent uniquement sous l’une des deux formes. Chez les hydrozoaires et les cubozaoires, les deux stades sont la plupart du temps représentés (sauf chez l’hydre par exemple) et de prévalence similaire. L’hydre est un cas particulier puisqu’elle a perdu le stade méduse et présente d’étonnantes capacités de régénération. Chez les scyphozoaires, le stade méduse est prédominant, le polype bourgeonne des méduses par strobilation (division segmentée transversale le long de l’axe au stade polype). Les anthozoaires vivent uniquement à l’état de polype et la reproduction sexuée s’effectue directement à partir de celui-ci. Il relâche des gamètes dans l’eau. Ces polypes qui peuvent pour certains se multiplier aussi par fission possèdent en plus des capacités de régénération.

Les nouveaux gènes rapportés dans la première partie (II.1. Chapitre 1) ont tous été isolés à partir d’hydrozoaires à cycle complet (Clytia, Turritopsis, Cladonema). Par ailleurs, le modèle principal d’étude qui a été utilisé lors de cette thèse (Nematostella) (II.2. Chapitre 2) appartient au groupe des anthozoaires. Comme tous les anthozoaires, cette anémone ne vit que sous forme de polype et se reproduit de manière sexuée.

I.1.3. Développement embryonnaire des cnidaires

Les œufs pondus par les cnidaires possèdent déjà une polarité qui se définit par la position du pronoyau femelle, l’emplacement des globules polaires et parfois par la distribution de composants cytoplasmiques et de symbiontes. Il s’agit de la polarité animale-végétale. La fertilisation a lieu lors de la deuxième division de maturation.

C’est au pôle animal que s’initie le premier sillon de clivage qui deviendra par la suite

la partie orale de la planula. Les modalités de clivages et de gastrulation sont très variables chez les cnidaires même au sein d’une espèce (références voir (Fritzenwanker et al., 2007).

I.1.4. Organisation générale des cnidaires

I.1.4.1 Axe(s) de symétrie chez les cnidaires

La méduse et le polype s’organisent autour d’un axe oral-aboral unique et présentent une symétrie radiaire. Les cnidaires ne possèdent qu’un seul orifice, relié à une cavité gastrovasculaire, faisant office à la fois de bouche et d’anus (Figure 5A). Cette extrémité orale entourée de tentacules est appelée l’hypostome chez l’hydre.

L’extrémité opposée est définie comme le pôle aboral et il s’agit du pied chez le polype. D’une manière étonnante, c’est en fait l’extrémité antérieure de la planula, définie par la direction de la nage de celle-ci, qui se fixe au substrat pour donner, après la métamorphose, le pied du polype. Par la suite, l’extrémité postérieure de la larve génèrera la bouche.

Nous allons voir que la morphologie larvaire peut être regardée comme présentant une symétrie bilatérale à deux axes (voir I.1.5.3. axe primaire et secondaire de la larve de Nematostella) (Finnerty et al., 2004). Par analogie, il est donc également possible d’extrapoler ces deux axes sur le polype. Cependant le nombre d’axes définissant le plan du corps des cnidaires est à l’heure actuelle toujours un débat. Combien et lesquels ?

I.1.4.2 Organisation des tissus à partir de deux feuillets: l’ectoderme, l’endoderme, (mésoderme)

Classiquement les cnidaires sont définis comme des organismes diploblastiques c’est-à-dire constitués de deux feuillets embryonnaires, l’ectoderme et l’endoderme, séparés par la mésoglée (Bode, 1996) (Figure 5B). Ils sont les premiers animaux à arborer un système neuromusculaire différencié ainsi que des organes sensoriels (Kozmik et al., 2003; Nordstrom et al., 2003; Seipel et al., 2004; Hwang et al., 2007).

Cependant des évidences morphologiques et moléculaires (voir I.1.7.) conduisent à reconsidérer le statut des cnidaires comme des animaux triploblastiques (Seipel and Schmid, 2005, 2006) oú l’état diploblastique du polype d’hydrozoaire serait considéré comme un caractère dérivé. En effet, de nombreux cnidaires possèdent des muscles striés qui pourraient correspondre à des dérivés mésodermiques (Seipel and Schmid, 2006).

I.1.4.3. Organisation cellulaire de l’hydre

Figure 5: Organisation anatomique et cellulaire de l’hydre. A) Coupe transversale schématique d’une hydre. Ne sont pas représentées les cellules de la lignée interstitielle. B) Coupe transversale schématique dans les deux couches cellulaires qui constituent les parois du corps de l’hydre. Le positionnement des cellules de la lignée interstitielle dans les interstices des cellules épithéliales est représenté. Les différents types cellulaires de la lignée interstitielle sont schématisés. Pour les correspondances voir le schéma C. Les processus musculaires des cellules épithéliales de chacune des deux couches cellulaires, qui s’allongent de manière adjacente à la mésoglée, ne sont pas représentés sur ce schéma. C) Les voies de différentiation des trois classes de produits somatiques. Les cellules interstitielles incluent les cellules souches (stem cells) ainsi que les cellules déjà engagées dans une voie déterminée (commited cells). Les produits intermédiaires de différentiation incluent les cellules en division et en cours de différentiation. Schémas pris de (Bode, 1996).

C’est chez l’hydre que l’organisation et le lignage cellulaire sont les mieux documentés. Chacun des feuillets se compose uniquement d’une couche cellulaire : les cellules myoépithéliales ectodermales en contact avec l’extérieur et les cellules myoépithéliales endodermales qui tapissent la cavité gastrique de l’animal. Ces deux types de cellules dérivent respectivement des cellules souches épithéliales

ectodermales et endodermales. Les autres types cellulaires composent la lignée des cellules interstitielles et se localisent dans les interstices des cellules épithéliales de l’ectoderme et de l’endoderme (Figure 5B). Elles dérivent des cellules souches interstitielles (Figure 5C). L’hydre possède donc trois lignées de cellules souches (les cellules souches épithéliales ectodermales et endodermales et les cellules souches interstitielles).

Les cellules souches épithéliales de l’hydre accomplissent, en plus, des fonctions physiologiques. Les cellules épithéliales ectodermales ont une fonction de protection et d’osmorégulation quant aux cellules épithéliales endodermales, elles sont impliquées dans les processus digestifs. Les cellules souches interstitielles forment une population de cellules multipotentes à l’origine de trois classes différentes de produits somatiques, cellules sécrétrices (cellules glandulaires et muqueuses), neurones (sensoriels et ganglionaires), cnidocytes ainsi que des gamètes. Les cellules engagées dans la voie de différentiation de l’une des trois classes de produits somatiques subissent tout d’abord un ou plusieurs cycles de division cellulaire amplifiant ainsi le nombre de cellules différenciées produites à terme (Bode, 1996) (Figure 5C).

I.1.4.4. Le système nerveux des cnidaires

Le système nerveux des cnidaires est constitué de deux réseaux nerveux diffus, en association avec l’endoderme ou l’ectoderme. Il est composé de neurones et de cellules mécanoréceptrices appelées les cnidocytes (Marlow et al., 2009).

Les neurones

Les neurones de cnidaires sont divisés en deux catégories : les cellules ganglionaires (grandes, bipolaires ou multipolaires) et les cellules sensorielles (généralement multipolaires et ciliées) (Bode, 1996) qui se distribuent entre les cellules éptihéliales des deux couches cellulaires de l’animal constituant ainsi un système nerveux diffus. Les cellules sensorielles sont en contact avec l’environnement (Westfall et al., 2002). Comme chez les bilatériens, les cellules nerveuses de cnidaires sont des cellules excitables généralement ramifiées qui génèrent et propagent des potentiels d’action. Cependant les neurones de cnidaires sont dépourvus des cellules gliales qui accompagnent les neurones des bilatériens. De plus, les cnidaires ne présentent pas de différentiation dans la ramification de leurs cellules nerveuses en dendrites (réception du signal) et axones (propagation du signal) comme chez les

bilatériens. Tous les prolongements nerveux des cnidaires sont appelés neurites. Ils conduisent des messages nerveux dans les deux directions (Anderson, 1985).

Chez certaines espèces d’hydres, il existe une concentration plus importante de neurones à la base de la bouche arrangée en un anneau nerveux (Figure 6). Cet arrangement, de part sa structure et sa localisation est proposé comme étant un système nerveux central primitif (Koizumi, 2007). En comparaison, les méduses d’hydrozoaires possèdent deux anneaux nerveux faisant le tour de l’ombrelle, un anneau interne, moteur, et un anneau externe, sensoriel (Grimmelikhuijzen et al., 1989).

Figure 6 : Anneau nerveux chez Hydra oligactis observé en immunomarquage avec l’anticorps anti-RFamide. A) Vue de côté de la tête montrant l’hypostome et la partie basale des tentacules. A l’apex de l’hypostome se trouve la bouche. B) Vue du dessus de l’hypostome qui montre la bouche au centre entourée de nombreuses cellules épidermiques sensorielles.

L’anneau nerveux entourre la bouche. Échelles : A) 200 µm, B) 100 µm. Phtographies adaptées de (Koizumi et al., 1992).

Les cnidocytes

Les cnidocytes, organite explosif servant à la défense, la locomation et la nutrition de l’animal, sont des cellules urticantes spécifiques aux cnidaires et sont à l’origine du nom de ce phylum. Hautement différenciées, elles contiennent une capsule appelée cnidocyste dont la nature morphologique permet de classifier les différents types de cnidocytes en trois groupes structuraux différents : les nématocytes, les spirocytes et les ptychocytes (Kass-Simon and Scappaticci, 2002). Ils sont considérés comme des

cellules neurosensorielles ciliées répondant à des stimuli externes, ils sont responsables de la mécanoréception et de la chémoréception. Ces cellules sont intégrées au sein du système nerveux par l’intermédiaire de synapses (Westfall, 2004). Chez l’hydre, elles dérivent des cellules interstitielles tout comme les neurones (Bode, 1996) (Figure 5C).

La complexité nerveuse des cnidaires peut s’illustrer au travers de l’organisation cellulaire d’un tentacule d’anémone de mer. Les cellules sensorielles sont orientées perpendiculairement au plexus nerveux et aux cellules musculaires de l’épiderme.

Elles sont dispersées parmis de nombreux spirocytes et nématocytes. Les cellules ganglionaires sont situées au-dessus ou dans le plexus nerveux qui longe les fibres musculaires basales (Westfall et al., 2002) (Figure 7).

Figure 7: Aiptasia pallida. Section d’un tentacule représentant une cellule sensorielle allongée (S) orientée perpendiculairement à une cellule ganglionaire (G) située au-dessus du plexus nerveux (N) et longitudinal aux cellules musculaires (M). De nombreux spirocystes (SP) et quelques nématocystes (NS) sont situés perpendiculairement au plexus nerveux. La mésoglée acellulaire sépare l’épiderme épais du gastroderme (GA) fin et du lumen (L) du tentacule creux. Échelle: 3 µm. Photographie prise de (Westfall et al., 2002)

Par ailleurs, les cnidaires possèdent une grande variété de structures sensorielles comme les rhopalies ou les statocystes impliquée dans la photoréception et l’équilibration.

La transmission synaptique

Chez les anémones, les projections des neurones sensoriels peuvent établir des synapses avec les spirocytes, les cellules musculaires et les cellules ganglionaires.

Leur rôle est de coordonner un signal arrivant des cellules ou structures sensorielles avec un signal de sortie dirigé vers une cellule cible (épithéliomusculaire par exemple) (Westfall et al., 2002; Marlow et al., 2009). Les projections des cellules ganglionaires établissent des synapses avec les cellules sensorielles, les spirocytes, les cellules musculaires et avec d’autres neurones. Les neurones sensoriels et ganglionaires fonctionnent donc comme des motoneurones. Lorsqu’une cellule sensorielle forme une synapse directement avec un spirocyte la cascade de transmission est à deux cellules. En revanche, lorsqu’une cellule ganglionaire fait l’intermédiaire entre une cellule sensorielle et une cellule effectrice alors la cascade de transmission est à trois cellules (Westfall et al., 2002) (Figure 8).

Figure 8: Schéma hypothétique indiquant des cascades de transmission synaptique à deux ou trois cellules dans l’épiderme des tentacules de l’anémone de mer. Les cellules sensorielles forment des synpases directement sur des spirocystes et/ou des cellules musculaires pour former une cascade de transmission à deux cellules. Une cascade à trois cellules est définie quand une cellule ganglionaire fait l’intermédiaire entre des cellules sensorielles et des cellules effectrices. Schéma tiré de (Westfall et al., 2002).

La transmission synaptique s’opère par l’intermédiaire de synapses à la fois chimiques et électriques via des jonctions gap (Satterlie and Spencer, 1987) où des potentiels post-synaptiques excitateurs et inhibiteurs ont pu être enregistrés (Anderson and Spencer, 1989). La neurotransmission synaptique s’effectue grâce à des transmetteurs rapides (acetylcholine, glutamate, GABA, glycine) ou lents (catecholamine, sérotonine) et des neuropeptides (RFamide, RWamide par exemple) (Kass-Simon and Pierobon, 2007).

Ainsi les cnidaires sont capables de percevoir des informations sensorielles. Celles-ci sont à l’origine de mouvements coordonnés des tentacules et du corps, permettant la capture de nourriture ainsi que l’activité de l’ombrelle de la méduse nécessaire à ses déplacements. En tant que cellules mécanoréceptrices, les nématocytes entre en contact avec la proie par le biais de leur cnidocil. La décharge d’un venin toxique sur la proie va provoquer une réponse de nutrition de l’animal qui se traduit par le mouvement des tentacules vers la bouche qui s’ouvre. Le peptide glutathion agit comme un activateur du comportement de nutrition.

La mise en place du système nerveux diffus de l’hydre est bien élucidée au niveau cellulaire (Grimmelikhuijzen et al., 1989; Koizumi et al., 1990). Cependant la connaissance des mécanismes génétiques qui régulent son développement est encore relativement sommaire. De plus, les contextes de neurogénèse chez les cnidaires sont pour le moins complexes puisque le phénomène doit prendre place au cours du développement embryonaire, au cours du bourgeonement en enfin lors de la régénération.

I.1.5. Nematostella vectensis : un nouveau modèle

Depuis quelques années, l’anémone de mer Nematostella vectensis est devenue un modèle prisé, en particulier pour l’étude de l’embryogenèse et du développement larvaire. Cet anthozoaire, appartenant à l’ordre des Actiniaires, se place phylogénétiquement comme groupe frère aux médusozoaires (Bridge et al., 1995;

Odorico and Miller, 1997). Si le stade méduse est une invention des médusozoaires, alors le stade polype unique de Nematostella représenterait au mieux la condition primitive des cnidaires (Collins et al., 2006). Cette position phylogénétique particulière relative aux autres cnidaires, en fait un modèle de choix pour les approches évolutives au sein de ce phylum (Darling et al., 2005).

I.1.5.1. Mode et cycle de vie de Nematostella

Figure 9 : Différents stades de développement représentatifs de la reproduction sexuée de Nematostella. A) Œuf au stade une cellule avant les premières divisions. Les œufs sont expulsés dans une large masse gélatineuse B) Embryon en division. C) Photographie prise dans (Darling et al., 2005). Larve planula nageuse. La flèche indique la direction de la nage (touffe apicale vers le bas). D) Jeune polype nouvellement métamorphosé. E) Animal adulte ayant atteint la maturité sexuelle. L’astérisque montre le pôle oral.

Figure 10 : Reproduction asexuée chez Nematostella. A) La régénération suivant une blessure représente un mode de reproduction asexué. Cependant, le rôle joué par ce mode de reproduction dans les populations naturelles est inconnu. B) Le mode de reproduction asexué le plus utilisé chez Nematostella est la fission transverse: la contraction du corps de l’animal conduit finalement à la séparation de la partie aborale qui par la suite régénère la structure de la tête. C) D’une manière alternative (mais ceci arrive moins fréquemment), la reproduction asexuée peut survenir par le biais d’une inversion de polarité où une nouvelle tête se forme, typiquement à la partie aborale de l’anémone et l’animal se divise en deux en son milieu et régénère alors un nouveau pied. Photographies prises dans (Darling et al., 2005).

Nematostella est un animal solitaire vivant en eaux saumâtres. Carnivore, elle capture du plancton. Elle se distribue principalement le long des côtes pacifiques et atlantiques du nord de l’Amérique. Les sexes sont séparés mais indistinguables

morphologiquement. Les œufs sont pondus dans une masse gélatineuse par dizaines voir par centaines. Ces derniers sont larges (environ 240 µm). La fécondation est externe. Après la fécondation, une larve planula ciliée nageuse se forme. Environ sept jours après la fertilisation, la larve se métamorphose en un polype juvénile dont la bouche se trouve au centre de quatre tentacules (Hand and Uhlinger, 1991, 1992;

Kraus and Technau, 2006). La maturité sexuelle s’acquiert au bout d’environ quatre mois (Figure 9).

En plus du cycle de reproduction sexuée décrit ci-dessus, Nematostella possède également des capacités de reproduction asexuée: la fission (Hand and Uhlinger, 1995), l’inversion de polarité et la régénération (Reitzel et al., 2007) (Figure 10).

I.1.5.2. Développement embryonnaire de Nematostella

La fertilisation externe est suivie par des divisions cellulaires synchrones dont le patron de clivage est variable d’un embryon à l’autre. Il en résulte, au stade 32-64 cellules, une coeloblastula creuse organisée. En corrélation avec les cycles de division cellulaire, celle-ci subit quatre à cinq cycles de mouvements d’invagination et d’évagination. Ce processus prend fin environ quatre heures avant que les divisions cellulaires cessent d’être synchrone (13 heures après la fertilisation). Des cils se forment sur l’embryon qui commence la gastrulation environ 20 heures après la fertilisation (Figure 11).

Le pôle animal de l’œuf correspond à la fois au site du premier sillon de clivage, au côté concave de la blastula et donc aux sites d’invagination, au blastopore de la gastrula et au pôle oral du polype. Cet hémisphère contient une activité organisatrice nécessaire à la formation d’un polype normal (Fritzenwanker et al., 2007).

Figure 11 : Stade du développement embryonnaire de Nematostella. Schéma pris de (Fritzenwanker et al., 2007).

I.1.5.3. Organisation anatomique de Nematostella

Chez la larve, le pôle antérieur arbore une touffe, nommée « touffe apicale » dirigée dans la direction de la nage de l’animal (Figure 12A). Le blastopore, situé au pôle postérieur, deviendra la bouche de l’animal adulte. L’axe primaire du corps de la larve correspond à l’axe apical-blastopore. Comme tous les polypes de cnidaires, la structure du corps de Nematostella se compose de deux épithéliums: un ectoderme externe et un endoderme interne, séparés par la mésoglée acellulaire. Le pharynx connecte la bouche à l’intestin. Il correspond à une invagination de l’ectoderme au pôle oral. L’axe secondaire, appelé l’axe directif, traverse le pharynx à angle droit avec l’axe primaire (Finnerty et al., 2004) (Figure 18).

Figure 12 : Organisation anatomique de la larve et du polype adulte de Nematostella. A) Larve au stade de planula. B) Polype adulte. A-B) Coupes longitudinales à travers l’axe oral- aboral. C) Section dans la région du pharynx. Schémas pris de (Finnerty et al., 2004).

Le polype juvénile présente une structure endodermique particulière appelée les mésentéries. Au nombre de deux après la métamorphose, elles divisent l’intestin et augmentent sa surface permettant la production et le stockage des gamètes dans des poches (Figure 12B). L’animal adulte a la forme d’un tube de 5 – 10 cm de long (Putnam et al., 2007). Le pharynx s’attache à la structure du corps par le biais de huit mésentéries endodermiques. Chacune d’entre elles porte un muscle rétracteur (Finnerty et al., 2004) (Figure 12C). L’extrémité orale s’ouvre sur une bouche entourée d’une vingtaine de tentacules. La région aborale est fermée (Putnam et al., 2007) (Figure 12).

I.1.5.4. Système nerveux de Nematostella

Figure 13: Anatomie du système nerveux de Nematostella au stade polype et planula. A) Demi-coupe longitudinale d’un stade polype montrant la morphologie neuronale. Les anneaux nerveux oral et pharyngial sont surlignés en violet. B) Demi-coupe longitudinale d’un stade stade planula montrant la morphologie neuronale. C-H) Représentation schématique de la morphologie individuelle des neurones et des cnidocytes : trois ganglions, deux cnidocytes et deux cellules de type sensoriel sont représentés. Shémas modifiés de (Marlow et al., 2009).

Comme tous les cnidaires, Nematostella possède un réseau nerveux diffus. La différentiation nerveuse s’effectue dans la totalité du corps de l’animal et s’initie avant la fin de la gastrulation. Contrairement à beaucoup de métazoaires, elle prend place aussi bien dans l’ectoderme que dans l’endoderme. Les cellules neuronales sont localisées en différents domaines des deux couches cellulaires et sont produites à des stades spécifiques du développement de l’anémone. Elles se répartissent en différents territoires distribués le long de l’axe oral-aboral. Ces territoires subissent des modulations à la métamorphose. La larve présente une région neuronale, située au pôle antérieur, représentée par l’organe sensoriel apical portant la touffe apicale. La

formation de cet organe est sous le contôle du facteur de signalisation FGF (Fibroblast growth factor) (Rentzsch et al., 2008). Le réseau nerveux diffus du polype quant à lui est plus dense au niveau des anneaux nerveux oral et pharyngial où les mésentéries sont innervées ainsi que dans l’extrémité des tentacules (Figure 13).

Le réseau neuronal de Nematostella se compose de cellules ectodermiques sensorielles et effectrices et de cellules ganglionaires endodermales multipolaires (Grimmelikhuijzen et al., 2002; Koizumi, 2002). Il est constitué de multiples classes de cellules neuronales et de cnidocytes, qui se caractérisent par leur morphologie et par l’expression de neuropeptides et de neurotransmetteurs (Marlow et al., 2009). Néanmoins certaines cellules morphologiquement identiques n’expriment pas toujours les mêmes combinaisons de neurotransmetteurs. Le réseau nerveux n’est donc pas homogène, mais possède des cellules avec des potentiels multifonctionnels, distribuées dans les deux couches tissulaires de l’animal et dépendantes d’un patron moléculaire bien défini (Figure 13).

Marlow et al proposent qu’une ou deux populations de cellules souches localisées en des domaines déterminés (ectodermal ou alors ectodermal et endodermal) puissent produire des précurseurs qui migreraient et se positionneraient par la suite dans les régions neuronales spécifiques de la larve et du polype (Marlow et al., 2009).

I.1.6. Les cnidaires comme système modèle

L’utilisation de ce phylum comme système modèle vise à répondre à un certain nombre de problématiques : comprendre l’émergence, l’élaboration et le déploiement des cascades génétiques qui contrôlent la spécification des axes (Gauchat et al., 2000; Hobmayer et al., 2000; Yanze et al., 2001; Ball et al., 2004; Finnerty et al., 2004;

Lee et al., 2006; Rentzsch et al., 2006), la mise en place des patrons d’expression selon les axes de polarité (Gauchat et al., 2000; Hobmayer et al., 2000; Yanze et al., 2001; Ball et al., 2004; Finnerty et al., 2004; Lee et al., 2006; Rentzsch et al., 2006), la transdifférenciation du tissu musculaire strié (Schmid et al., 1998; Technau and Scholz, 2003) le développement des yeux (Kozmik et al., 2003; Stierwald et al., 2004) ou encore l’alloimmunité (Frank et al., 2001).

I.1.6.1. Les différents modèles de cnidaires utilisés

L’hydre (hydrozoaire) découverte en 1740 par Abraham Trembley, est un modèle historique utilisé entre autre pour l’étude de la régénération dès les années 50 (Sturtevant et al., 1951). Cette espèce est néanmoins un représentant des hydrozoaires hautement dérivé (Collins et al., 2000). En effet, la plupart des

hydrozoaires sont marins et possédent un stade méduse alors que l’hydre est un animal d’eau douce qui ne vit qu’à l’état de polype (Steele, 2002). De plus, la reproduction sexuée chez l’hydre est rare et imprévisible en laboratoire, il est donc difficile d’en étudier le développement embryonnaire. L’embryogenèse de l’hydre implique en plus une période de dormance (Martin et al., 1997). D’autres hydrozoaires sont utilisés en biologie du développement en particulier Podocoryne (Momose and Schmid, 2006) ou Clytia (Momose and Houliston, 2007). Les modèles d’anthozoaires sont principalement Acropora (corail) (de Jong et al., 2006; Shinzato et al., 2008) et Nematostella qui représente le modèle le plus utilisé maintenant avec l’hydre.

I.1.6.2. Avantages et inconvénients du modèle anthozoaire Nematostella

Nematostella (anthozoaire) est un nouveau modèle en pleine émergence ces dernières années (Hand and Uhlinger, 1992; Darling et al., 2005). Cette anémone présente de nombreux avantages pratiques. Les cultures se maintiennent très facilement en laboratoire et la ponte peut être induite une fois par semaine dans des conditions de nourriture, de lumière et de température données. Ainsi les embryons sont disponibles toute l’année (Hand and Uhlinger, 1991, 1992; Fritzenwanker and Technau, 2002). Les œufs sont pondus en grand nombre et leur taille les rend facilement manipulables après retrait de la gélatine (Putnam et al., 2007). Le temps de génération de cet organisme est relativement court. Par ailleurs, Nematostella possède des modalités de développement asexué qui permettent d’étudier l’implication des gènes du développement dans des contextes diversifiés (Burton and Finnerty, 2009). Grâce à la contribution du laboratoire d’Uli Technau nous avons pu développer et maintenir une culture de Nematostella pendant 5 années à Genève.

Nous avons profité des avantages liés à l’induction de la ponte pour mener à bien notre approche fonctionnelle du gène Gsx/Anthox2 au cours du développement embryonnaire de l’animal (II.2. Chapitre 2). D’un point de vue génomique, Nematostella possède un génome relativement compact (environ 450 millions de paires de bases contre environ 1100 chez l’hydre) désormais disponible et annoté (Putnam et al., 2007) dans lequel la plupart des familles de gènes impliquées dans les grandes cascades de signalisation et les processus de développement sont représentées (voir I.1.7., I.2.5., I.3.3.). Ces caractéristiques font de Nematostella un modèle d’étude offrant la possibilité de disséquer des mécanismes fondamentaux représentatifs de l’état primitif des eumétazoaires.

Nematostella présente donc de nombreuses qualités pratiques mais comme tout nouveau modèle, les études descriptives font encore défaults. Il existe maintenant