Les gènes ParaHox ont-ils un mode d’expression conservé au cours de l’évolution ?

Clytia est donc le premier cnidaire chez qui l’existence des trois gènes ParaHox a été démontrée. Contrairement aux résultats de Chiori et al., nous avons pu détecter l’expression de Gsx au stade larvaire. Mises ensemble, ces deux publications montrent que les trois gènes ParaHox sont exprimés pendant le développement larvaire de Clytia dans des types cellulaires non déterminés, sans évidence pour l’existence d’une colinéarité spatiale. En revanche chez la méduse adulte, Gsx et Cdx sont exprimés dans les bulbes tentaculaires. Les cellules positives pour Gsx sont supposés correspondre à des précurseurs neuronaux ou des neurones différenciés et celles positives pour Cdx à des nématoblastes différenciés (Chiori et al., 2009). Chez le polychaete Nereis et chez l’amphioxus, les trois gènes ParaHox sont exprimés dans le système nerveux ventral (Brooke et al., 1998; Kulakova et al., 2008). En revanche, chez la souris, ils sont tous les trois détectés dans le pancréas (Rosanas-Urgell et al., 2005). L’expression pancréatique de Gsx semblerait être davantage une expression dérivée. En effet comme nous en avons discuté, la fonction de Gsx est conservée dans le développement du tube neural et du neuroectoderme chez la souris et la drosophile respectivement. Ces données s’appuient sur des analyses faites sur des lignées transgéniques. De plus, il existe

un important degré de conservation des domaines d’expression de ce gène au sein du règne animal dans les structures nerveuses (II.2-3. Chapitre 2-3). Il n’y a pour le moment aucune analyse fonctionnelle relatant le rôle de Gsx dans le pancréas. Il semble donc peut probable que l’activité des gènes ParaHox soit restreinte à la mise en place du patron endodermique comme cela a pu être suggéré (Garcia-Fernandez, 2005a).

Rôle des gènes ParaHox dans l’apparition de nouveaux types cellulaires

Il est admis désormais que la neurogénèse n’est probablement apparue qu’une seule fois au cours de l’évolution. Cette hypothèse est appuyée par les similarités qui existent entre le répertoire de gènes neurogéniques connus des vertébrés et des invertébrés. De plus, la neurogénèse aurait une origine très ancienne qui remonterait au phylum des cnidaires puisque des gènes orthologues se retrouvent également dans ce phylum (II.3. Chapitre 3). Plus que par leur aspect morphologique, les différents types cellulaires et leur évolution sont désormais abordés par le biais de leurs caractéristiques moléculaires (« fingerprinting », empreintes génétiques) (Arendt, 2008). Les gènes orthologues du répertoire neurogénique conservés des cnidaires aux bilatériens partagent des domaines d’expression dans des types cellulaires supportant une fonction dans la différentiation nerveuse. Enfin, les quelques analyses fonctionnelles qui existent chez les cnidaires corroborent la fonction neurogénique de ces gènes conservés (Miljkovic-Licina et al., 2007;

Rentzsch et al., 2008). Gsx fait partie de cette empreinte dans les précurseurs neuronaux et les neurones de cnidaires (II.2-3. Chapitre 2-3) mais aussi de bilatériens et s’intègre sans aucun doute dans un réseau de régulation complexe, probablement différent suivant les phyla, menant à la mise en place d’un système nerveux diffus (II.2. Chapitre 2) ou centralisé.

Les techniques en biologie du développement utilisées chez les cnidaires reposent principalement sur l’étude des patrons d’expression. L’accumulation de ce type de données permet déjà d’avoir une idée des empreintes génétiques des différents types cellulaires constituant les organismes de ce phylum, en particulier les types neuronaux (II.3. Chapitre 3). La comparaison avec les connaissances déjà acquises chez les bilatériens autorise à spéculer sur l’implication évolutive de certains gènes clés dans des processus developpementaux d’intérêts comme la neurogénèse, ainsi que sur l’évolution des différents types cellulaires qui existent dans le règne animal.

La combinaison de mes résultats de thèse avec les données déjà existantes nous

permet d’envisager l’importance de Gsx dans l’évolution des types cellulaires neuronaux.

Gsx pourrait faire partie des gènes recrutés dans les précurseurs neuronaux ou dans les lignées de cellules neuronales à leur apparition chez l’ancêtre commun aux eumétazoaires. Il est clair que chez les bilatériens, le gène Gsx ne s’exprime pas dans tous les types de cellules nerveuses. Le maintien de la fonction de Gsx dans une sous-population de cellules nerveuses chez les bilatériens pourrait avoir eu lieu lors du partage des fonctions d’une cellule ancestrale à des cellules filles, la fonction de Gsx étant gardée dans l’une et perdue dans les autres par ségrégation de fonction.

Ne connaissant pas les types cellulaires dans lesquels le gène Pdx est exprimé chez les cnidaires, deux hypothèses sont alors possibles. Soit Pdx est exprimé chez les cnidaires et le bilatériens dans des cellules homologues. Dans ce cas, d’une manière similaire à Gsx, la fonction de Pdx aurait pu être recrutée à l’apparition d’un nouveau type cellulaire chez les cnidaires puis ségrégée dans un type de cellule plus spécialisé descendant du type ancestral existant chez les cnidaires. Soit Pdx aurait pu être recruté de manière indépendante chez les cnidaires et les bilatériens dans des types cellulaires non-homologues. Il serait donc informatif de regarder les types cellulaires qui expriment Pdx chez les cnidaires.

Enfin Cdx, qui semble n’exister que chez les hydrozoaires, pourrait quant à lui avoir été recruté pour deux fonctions différentes chez les hydrozoaires et les bilatériens et perdu chez les anthozoaires.

Une lignée spécifique d’hydre appelée « nerve free » est dépourvue de la lignée cellulaire interstitielle. Ces hydres sont donc dans l’incapacité de différencier des nématocytes, des neurones ainsi que des cellules glandulaires et des gamètes qui sont tous des types cellulaires qui descendent de la lignée interstitielle. Hwang et al.

ont comparé le profil d’expression des gènes de cette population d’hydre avec celle d’hydre « sauvage » par le biais des puces à ADN (Hwang et al., 2007) et ils ont ainsi mis en évidence les gènes spécifiquement exprimés dans la lignée des cellules intertitielles. Pour raffiner cette approche et connaître l’empreinte génétique spécifique à chaque type de cellules neuronales, l’idéal serait de pouvoir réaliser ce type d’expériences sur des cultures cellulaires de neurones chez les cnidaires et chez les bilatériens. De tels résultats constitueraient un apport primordial pour reconstruire les homologies des types cellulaires neuronaux permettant d’inférer le

type cellulaire neuronal ancestral. Il n’existe pour le moment pas de cultures cellulaires chez les cnidaires.

Conclusions

Nous avons montré que les cnidaires possèdent de nombreux outils génétiques utilisés par les bilatériens dans la neurogénèse. Les patrons d’expression et les études fonctionnelles suggèrent une fonction conservée de ces gènes dans la neurogénèse chez ce phylum également. C’est le cas du gène ParaHox Gsx/Anthox2 dont nous avons étudié la fonction dans ce travail et qui paraît être un régulateur ancestral de la neurogénèse.

Gsx est un facteur de transcription représentant un bon candidat régulateur de la neurogénèse des cnidaires aux bilatériens. Mais d’un point de vue plus global, il serait intéressant de savoir précisément dans quelle cascade de régulation il s’intègre et quelle est sa place, par quels gènes il est régulé et quels gènes il régule.

L’utilisation des approches modernes d’analyse à grande échelle en particulier au moyen de la technique de l’immunoprécipitation de la chromatine en combinaison des puces à ADN (ChiP on chip) chez les cnidaires serait essentielle à la compréhension de l’évolution de la neurogénèse dans le monde animal.

Ce type de démarche permettrait de voir si les gènes d’identités neurales agissent également en concert chez les cnidaires et si leur régulation par la voie BMP est un mécanisme ancestral. D’une manière plus large, la comparaison des réseaux de régulation intégrant Gsx entre les cnidaires et les bilatériens permettrait de caractériser les changements d’architecture de ces réseaux et d’en déduire les changements génétiques qui ont permis l’acquisition d’un système nerveux centralisé ou des types cellulaires spécialisés. Il sera peut-être possible un jour de changer la hiérarchie des réseaux de régulation de gènes de manière expérimentale et de corréler ces modifications avec des changements morphologiques et, qui sait, de créer ainsi une méduse au système nerveux centralisé ou une souris au système nerveux diffus.

D’une manière plus restrictive, plusieurs points sont encore à développer dans notre projet :

1) Nous avons montré d’une part, qu’Anthox2/Gsx chez Nematostella était exprimé dans des cellules reconnues comme des précurseurs neuronaux et des neurones différenciés et d’autre part que son expression était nécessaire au développement correct de son système nerveux. Les analyses des types cellulaires positifs pour

Anthox2 ont été faites sur des reconnaissances morphologiques. À la vue de leur forme et de leur localisation et suivant les descriptions de Marlow et al., les cellules positives pour Anthox2 présentent dans l’ectoderme des tentacules du polype ressembleraient à des neurones sensoriels. Nous aimerions néanmoins confirmer ces résultats au moyen d’un marqueur neuronal comme les anticorps anti-GABA ou anti-(FM)RFamide (Marlow et al., 2009).

2) D’un point de vue fonctionnel, nous aimerions approfondir le rôle d’Anthox2/Gsx chez Nematostella au cours de son développement et dans le maintien de son système nerveux à l’état adulte. À l’aide des anticorps Tyrosine-tubuline ou anti-acetylated tubulin (Rentzsch et al., 2008) nous aimerions regarder si l’inhibition d’Anthox2 affecte la mise en place de la touffe apicale. Enfin nous voudrions approfondir le mode de régulation d’Anthox2 en utilisant la technique d’injection de gène rapporteur. Nous avons déjà montré qu’il existe vraisemblablement un élément répresseur situé dans la région -3kb-2kb en amont de la séquence codante. Nous souhaiterions désormais approfondir la dissection du promoteur en nous focalisant sur les types cellulaires dans lesquels nos constructions, portant des régions différentes de la région régulatrice, sont exprimées. Nous suspectons en effet la présence d’un élément régulateur neurogénique responsable de l’expression du gène Anthox2 dans les cellules neuronales.

3) La revue présentée au chapitre 3 (II.3.) témoigne du grand nombre d’outils génétiques partagés entre les cnidaires et les bilatériens au cours de la neurogénèse. Nous souhaiterions mettre en œuvre une analyse à « moyenne » échelle au moyen de la PCR (Polymerase Chain Reaction) en temps réel (Real Time PCR) pour étudier les niveaux d’expression d’une grande série de ces gènes au cours du développement de Nematostella. Puisque Anthox2/Gsx participe très certainement à la régulation de la mise en place du système nerveux, en synergie avec d’autres acteurs au sein d’un réseau de régulation génétique, nous aimerions mettre en évidence les gènes cibles régulés par Anthox2/Gsx. Pour cela, la même série de gènes pourrait être testée dans un contexte de perte de fonction (injection de morpholinos) ou de surexpression (injection de transgènes dirigeant l’expression d’Anthox2 sous le contrôle d’un promoteur à l’expression ubiquitaire) du gène Anthox2.

Par la suite, le type d’approche que nous avons développé pour l’analyse de la fonction d’Anthox2 (inhibition, gène rapporteur) ainsi que les perspectives que nous

souhaiterions suivre pourraient êtres appliqués à certains autres gènes détectés comme potentiellement impliqués dans la même cascade de régulation qu’Anthox2.

Perspectives concernant les cnidaires en tant que modèles de développement et d’évolution

Les techniques en biologie du développement utilisées chez les cnidaires reposent sur l’inhibition des gènes par le biais de l’ARN interférence ou d’injection de morpholinos, depuis peu sur la transgénèse chez l’hydre. Le travail présenté au chapitre 2 (II.2.) ouvre de nouvelles possibilités pour l’étude de la régulation des gènes grâce à l’injection de gènes rapporteurs et représente un premier pas vers l’anémone transgénique.

Selon nous une importance primordiale doit être apportée à trois volets en particulier, pour répondre plus clairement aux questions du type de celles traitées dans cette thèse :

1) Les études descriptives des types cellulaires et de la morphogénèse font défaut en particulier chez Nematostella. Des études du type de celles menées par l’équipe d’Uli Technau sur le développement embryonnaire en microscopie électronique (Kraus and Technau, 2006; Fritzenwanker et al., 2007) ou sur la description du système nerveux de Nematostella dans l’équipe de Mark Martindale (Marlow et al., 2009) sont d’une très grande utilité et méritent d’être complétées.

2) Au niveau qualitatif il faudrait davantage développer les approches à grande échelle comme les puces à ADN avec ou sans l’immunoprécipitation de la chromatine pour dégager des profils d’expression et des modes de régulation relatifs à des conditions spécifiques chez les cnidaires. L’accumulation de ce type d’analyses ainsi que des études fonctionnelles de gènes ciblés faites chez les bilatériens, chez qui les outils d’étude génétique sont mieux développés, donne déjà un répertoire de données très important sur les mécanismes de régulation du développement et les cascades génétiques qui les gouvernent. Ceci représente une base de réflexion importante sur l’évolution de ces processus. Plus il sera possible de confronter des données de ce type entre les cnidaires et les bilatériens ou entre les grands branchements du règne animal représentant des étapes fondamentales en matière d’innovations morphologiques, plus les scénarios dans ce domaine se développeront et seront pertinents.

3) Par ailleurs il est désormais primordial de privilégier les études fonctionnelles chez les cnidaires pour approfondir les rôles du nombre important de gènes rapportés ces dernières années depuis le séquençage des génomes d’Hydra magnipapillata et de Nematostella, qui sont conservés et régulateurs du développement chez les bilatériens. Les approches à grande échelle sont un moyen de présélectionner les gènes actifs dans des processus d’intérêts et les études fonctionnelles sont un moyen de raffiner leur étude. Le développement des techniques permettant la perte ou le gain de fonction ou encore la dissection des régions régulatrices des gènes, d’une manière transitoire (injection de morpholinos, d’ARN messager, de gènes rapporteurs ou de transgènes permettant la surexpression) ou stable (transgénèse) est essentiel à la compréhension des processus de développement comme la neurogénèse et à la clarification de leur histoire évolutive.

L’émergence des études fonctionnelles chez les cnidaires ainsi que le développement des approches à grande échelle visant à décrypter les transcriptomes dans de multiples espèces représentant tous les phyla animaux et dans de multiples conditions nous placent au début de la compréhension des processus de développement ancestraux qui agissent chez les cnidaires.

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