Action des acides hydroxycinnamiques libres et estérifiés sur la croissance des bactéries lactiques
A.G. SALIH, J.-M. LE QUÉRÉ*, J.-F. DRILLEAU
SUMMARY Effect of hydrocinnamic acids on the growth of lactic bacteria.
Hydroxycinnamic acids, their quinic esters and quinic acid are present in apple juice and cider. Effects of each of these compounds and of two mixtures on the growth of one strain of two lactic acid bacteria species were studied by a four level factorial design. Each design involved three factors. Thus sixteen designs were required to achieve the work described in the present paper. The compounds were the following hydroxycinnamic acids: Ferulic acid, p-Couma- ric acid, Caffeic acids, p-Coumaroyl quinic acid, 5’-Caffeoyl quinic acid and the non-phenolic acid: Quinic acid. The two mixtures on an equimolecular basis were: p-Coumaric acid/Quinic acid and Caffeic acid/Quinic acid. The lactic bacteria species were: Oenococcus oeni and Lactobacillus plantarum. The fac- tors involved were: pH, tested compound concentration and pitching rate. Two growth parameters were examined: apparent growth rate and biomass produc- tion. Results showed that esters and Quinic acid were not active and that bac- terial growth was only affected by hydroxycinnamic acid concentrations. A decreasing inhibitory effect was shown from Ferulic acid to p-Coumaric acid and Caffeic acid. The two strains behaved differently: both apparent growth rate and biomass production decreased for Oenococcus oeni while only the apparent growth rate was affected for Lactobacillus plantarum.
Key-words: lactic acid bacteria, bacterial growth, phenolic compounds, pH, cider.
RÉSUMÉ
Les dérivés des acides hydroxycinnamiques (AHC) sont naturellement présents dans les jus de fruits, vins et cidres. Au cours de ce travail nous avons déter- miné, à l’aide de plans d’expérience, les effets de ces composés sur la crois- sance d’une souche de Oenococcus oeni et d’une souche de Lactobacillus plantarum. Les plans d’expérience comprennent trois facteurs : pH, taux d’ino- culation et concentration en composés phénoliques. Ces composés sont : l’acide quinique, les AHC libres (acides férulique, p-coumarique et caféique),
Station de recherches cidricoles, Biotransformation des fruits et légumes, Institut national de la recherche agronomique, B.P. 29, 35650 Le Rheu, France.
* Correspondance [email protected]
les formes estérifiées (acides 5’-caféoyl-quinique et p-coumaroyl-quinique) ainsi que deux mélanges équimolaires (acide caféique / acide quinique et acide p-coumarique / acide quinique). Les résultats ont montré que les AHC libres sont inhibiteurs vis-à-vis des bactéries lactiques, alors que leurs esters n’ont que peu ou pas d’effet. Les AHC libres peuvent être classés par ordre d’ac- tions inhibitrices décroissantes : acide férulique, acide p-coumarique et acide caféique, c’est-à-dire dans l’ordre décroissant de leur hydrophobicité. Les deux bactéries examinées réagissent différemment vis-à-vis de la toxicité des AHC : pour Oenococcus oeni, on observe à la fois une baisse du µ apparent et de la quantité de la biomasse produite. En revanche, pour Lactobacillus planta- rum, l’effet des AHC concerne surtout la réduction du µ apparent.
Mots clés : composé phénolique, bactérie lactique, croissance bactérienne, pH, cidre.
1 - INTRODUCTION
Dans les boissons fermentées telles le vin et le cidre, les bactéries lactiques jouent un rôle important. Leur développement peut être considéré comme favo- rable si leurs actions se limitent à la transformation de l’acide L-malique en acide L-lactique (Transformation Malo-Lactique ou TML). Malheureusement ces bacté- ries sont souvent du type hétéro-fermentaire et donc capables de métaboliser les sucres résiduels en divers composés dont l’acide acétique, ce qui peut entraîner une altération de la boisson connue sous le nom de « piqûre lactique ».
Au cours de leurs travaux sur la fermentation de divers cidres dans des conditions naturelles, SALIHet al. (1988) ont observé la disparition des bactéries au bout de trois semaines dans un des échantillons sans qu’il y ait eu le moindre début de TML. Il s’agissait d’un cidre élaboré à partir de variétés amères c’est-à-dire riches en composés phénoliques ; la concentration initiale du moût en composés phénoliques totaux était de 2,7 g·L–1. Ces mêmes auteurs (SALIHet al., 1987) avaient déjà montré qu’effectivement la présence de composés phénoliques dans le moût jouait un rôle significatif sur le délai d’ap- parition de la TML et sur sa vitesse lorsque le taux d’inoculation était faible. Or ces deux critères sont corrélés à la croissance bactérienne.
Dans le fruit « Pomme à Cidre », on rencontre principalement des acides hydroxycinnamiques sous la forme d’esters quiniques et des tanins c’est-à-dire des flavan 3-ols, catéchines (oligo et polymères de catéchines) ainsi que des chalcones.
Périodiquement, quelques auteurs tentent de faire le point sur l’action de composés phénoliques sur le comportement de diverses populations micro- biennes. C’est ainsi que FORNACHON (1943) et KUNKEE (1967) pensent que les tanins n’ont qu’une influence mineure sur la croissance des bactéries lactiques, alors que DOMERCQet al. (1959) montrent que l’enrichissement du vin en com- posés phénoliques venant du fût de bois neuf rend la TML difficile. De même, BENARDet JOURET(1962) soulignent que la richesse en tanins du raisin pourrait inhiber la croissance de la flore lactique ce qui fut confirmé par RADLER(1963), HUSFELD(1964) et VIVASet al. (1995) ; ces derniers observèrent une forte inhibi-
tion de la croissance de Leuconostoc oenos (aujourd’hui nommée Oenococcus oeni) et de la décarboxylation du malate en présence de procyanidols.
Si quelques auteurs ont étudié l’effet des procyanidols sur des bactéries de contamination telles que Clostridium, Pseudomonas et Enterobacter (SCALBERT, 1991) l’activité antimicrobienne des composés phénoliques a surtout été recherchée du côté des dérivés des acides cinnamiques. C’est ainsi que LEIFER- TOVAet al. (1975) ont observé une activité antimicrobienne vis-à-vis de Staphy- lococcus pyrogenes et Escherichia coli, de divers composés phénoliques, en particulier de dérivés de l’acide benzoïque, du benzaldéhyde, mais pas des deux acides hydroxycinnamiques, l’acide p-coumarique et l’acide férulique. Ces dernières observations sont contraires à celles de HERALDet DAVIDSON (1983) qui, eux, ont montré que les AHC ont une activité inhibitrice vis-à-vis du déve- loppement d’Escherichia coli, de Staphylococcus aureus et de Bacillus cereus.
Tout récemment, MACIEJEWICZet MERESTA(1999) ont mis en évidence une acti- vité bactériostatique de l’acide férulique, l’acide caféique et l’acide p-couma- rique vis-à-vis de Staphylococcus aureus.
L’activité anti-microbienne n’est d’ailleurs pas limitée aux bactéries de contamination ; en effet BARANOWSKIet al. (1980) ont constaté que l’acide féru- lique, à forte concentration (250 mg·L–1) inhibait la croissance de Saccharo- myces cerevisiae.
Dans le domaine des boissons, des travaux plus tardifs ont mis en évidence l’action des acides hydroxycinnamiques sur les bactéries lactiques qui y sont habituellement rencontrées. STEAD (1993, 1994) signale l’effet des acides caféique, p-coumarique, férulique et 5’-caféoyl-quinique. Il montre que les acides p-coumarique et férulique en concentration supérieure à 500 mg·L–1inhibent la croissance de souches de bactéries lactiques : Lactobacillus brevis et Lactobacil- lus collinoides ; dans les mêmes conditions l’effet de l’acide caféique était moindre tandis que celui de l’acide 5’-caféoyl-quinique était plutôt stimulant.
CAVINet al. (1993) constatent que l’acide férulique (100 mg·L–1) exerce une activité inhibitrice sur les souches de Lactobacillus sp., de Pediococcus sp. et surtout de Oenococcus oeni. Cette inhibition de croissance se traduit notam- ment par une prolongation de la phase de latence.
Plus récemment, COWAN(1999), signale que l’acide caféique, contenu dans l’estragon et dans le thym, exerce un effet inhibiteur contre les virus, les bacté- ries et les moisissures.
L’inhibition de la croissance n’est pas d’ailleurs la seule activité des compo- sés phénoliques, il peut y avoir stimulation. C’est le cas des anthocyanes libres selon VIVASet al. (1995) sur Oenococcus oeni et de l’acide gallique sur des bac- téries lactiques (STEAD, 1994 ; VIVASet al., 1995).
Les différentes conditions d’études seraient responsables des contradic- tions rencontrées quant aux activités plus ou moins inhibitrices ou stimulantes des divers acides hydroxycinnamiques et de leurs esters vis-à-vis des diverses composantes de la microflore. C’est pourquoi, dans le présent travail, nous avons cherché à préciser les conditions favorisant la croissance de souches de bactéries lactiques éventuellement utilisables dans le domaine du cidre de consommation ; en effet cette boisson est caractérisée par l’emploi d’une matière première le plus souvent composée de variétés de pommes à cidre riches en composés phénoliques et par une fermentation partielle. Les contra-
dictions relevées dans la littérature concernant les effets inhibiteurs ou activa- teurs de certains composés résulteraient de la présence d’interactions entre facteurs. Il a donc été pris soin de choisir des plans d’expérience permettant la mise en évidence de ces interactions.
2 - MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1 Microorganismes et milieux de culture
Deux espèces de bactéries lactiques ont été utilisées pour réaliser cette étude : Oenococcus oeni et Lactobacillus plantarum commercialisées par la firme danoise CHR Hansen, sous forme lyophilisée, respectivement sous la marque VinifloraTMoenos et VinifloraTMplantarum. Dès l’ouverture du sachet, le levain est reconditionné en flacon stérile sous gaz carbonique et congelé à – 30 °C.
L’ensemencement des bactéries lactiques s’effectue à partir du levain lyo- philisé qui est mis en suspension dans de l’eau physiologique (tryptone 1 g·L–1, NaCl 8,5 g·L–1) stérile pour ensemencer les plaques de microtitratation comme décrit plus loin. L’ensemencement a été effectué sans propagation, pour des raisons de reproductibilité des manipulations et pour se reprocher de la réalité industrielle où l’ensemencement est direct.
Le milieu FT 80 (Fructose Tween 80) dérivé de celui du CAVINet al. (1988) a servi pour la croissance des bactéries. Ce milieu est composé de (en g·L–1) : casaminoacids -Difco (5) ; extrait de levures -Difco (4) ; D (+) glucose (5) ; D (-) fructose (3,5) ; acide L (-) malique -Sigma®(4) ; KH2PO4(0,6) ; KCl (0,45) ; CaCl2 (0,13); MgSO4(0,13); MnSO4(0,003) et Tween 80 (1 mL). La modification a porté sur le remplacement de l’acide DL (-) malique (10 g·L–1) par l’acide L (-) malique (4 g·L–1). Le pH a été ajusté à 4,5 par NaOH 10 N. Le milieu est stérilisé par autoclavage 10 min. à 110 °C.
2.2 Composés phénoliques
Différents acides hydroxycinnamiques libres et estérifiés et un acide orga- nique ont servi à cette étude : les acides férulique, p-coumarique, caféique, qui- nique, 5’-caféoyl-quinique, ont été fournis par Sigma®. En revanche, l’acide p-coumaroyl-quinique (p-CQ) qui n’est pas disponible dans le commerce, a été isolé et purifié au laboratoire de la Station de recherches cidricoles — Inra — Le Rheu à partir d’un cidre au moyen d’une extraction liquide / liquide par l’acétate d’éthyle suivie d’une chromatographie à l’échelle préparative sur une colonne Lichrospher®éluée par un mélange eau acidifiée avec l’acide acétique / acéto- nitrile. Le rendement d’extraction est de 32 mg d’acide p-CQ pour 1 L de cidre.
La pureté de l’acide p-CQ a été vérifiée après son hydrolyse acide en met- tant en évidence l’acide quinique formé par chromatographie sur papier selon la méthode décrite par RIBEREAU-GAYONet al. (1982). L’acide p-coumarique libéré a été identifié par chromatographie en phase inverse d’après son spectre UV/Visible et de son temps de rétention par comparaison avec l’acide p-cou- marique standard du commerce. La structure de l’acide p-CQ a été confirmée
par spectrométrie de masse à ionisation electrospray (ESI, MS-MS). Les résul- tats obtenus sont comparables à ceux déjà observés par POON (1998) réalisés dans des conditions équivalentes.
Au moment de l’utilisation, les divers composés phénoliques sont dissous dans l’éthanol absolu (99,8 %) ; les solutions obtenues sont filtrées sur mem- brane stérile (Millex®-HV, 0,45 µm) qui n’absorbe pas les composés utilisés. La concentration éthanolique de la solution mère est de 20 % v/v (avec 80 % d’eau déminéralisée stérile). La concentration finale d’éthanol dans le milieu sera de 5 % vol.
2.3 Planification
Au moyen des plans d’expérience, le comportement de chacune des deux bactéries (Oenococcus oeni et Lactobacillus plantarum) a été étudié en pré- sence des différents composés phénoliques ou mélanges suivants :
– ester quinique de l’acide caféique (acide 5’-caféoyl-quinique) ;
– ester quinique de l’acide p-coumarique (acide p-coumaroyl-quinique : p- CQ) ;
– mélange équimolaire : acide caféique / acide quinique ; – mélange équimolaire : acide p-coumarique / acide quinique ; – acide férulique, acide p-coumarique, acide caféique, acide quinique.
Bien que l’objectif principal de ce travail soit d’étudier l’effet des composés phénoliques nous avons ajouté deux autres facteurs — le pH et le taux d’inocu- lation — afin de vérifier la présence d’une éventuelle interaction.
Tableau 1
Modalités des facteurs testés dans les plans factoriels Table 1
Quantitative levels of the experimental designs factors
Facteurs Niveaux
Code – 3 – 1 1 3
pH P 3,3 3,8 4,3 4,8
Teneur en composés phénoliques (mM) F 0 1 2 3
Taux d’inoculation (UFC·mL–1) I 103 104 105 106
Les expérimentations ont été planifiées sous la forme de plans factoriels correspondant chacun à une combinaison d’une bactérie avec un composé phénolique. Pour chaque plan nous avons attribué aux trois facteurs (pH, concentration en composé phénolique, taux d’inoculation) quatre modalités codées – 3 ; – 1 ; + 1 ; + 3 (tableau 1) ce qui conduit à 64 individus différents.
Les plaques de microtitration comportant 96 puits, il a été tiré profit des 32 puits résiduels pour répéter 50 % des individus du plan complet. Les individus supplémentaires ont été choisis de la même façon que pour la réalisation d’un plan fractionnaire selon CLIQUETet al. (1994).
2.4 Suivi de la croissance en plaques de microtitration
La croissance de bactéries, a été réalisée dans des plaques de microtitration FALCON® (Becton Dickinson, France) à fond plat stérilisées aux rayons gamma et comportant 96 puits. Ces plaques sont munies de couvercles stériles pour réduire l’évaporation du milieu et la contamination liée. La croissance des bac- téries lactiques a été déterminée en suivant l’évolution de la Densité Optique (DO à 690 nm) du milieu de culture dans chaque puits. La DO a été mesurée au moyen d’un lecteur de plaque de microtitration UVmaxTM (Kinetic Microplate Reader, Molecular Devices Corporation-Menlo Park, California, USA). Selon le constructeur, à 690 nm, l’absorbance est linéaire de 0 à 2,500 DO et la préci- sion de l’appareil est de ± 1 %.
Le remplissage des puits est effectué en quatre étapes successives :
– 90 µL de milieu FT80 double concentration, tamponné et ajusté aux pH du plan ;
– 45 µL de solution de composés phénoliques dans un mélange hydro- alcoolique à 20 % ;
– 45 µL de suspension bactérienne dans de l’eau physiologique ; – 20 µL d’huile de vaseline préalablement autoclavée.
Au final chaque puits contient 180 µL de milieu de croissance à 5% d’étha- nol. Les 20 µL d’huile de vaseline contribuent à limiter l’évaporation. Les plaques de microtitration sont incubées à 25 °C ; la lecture de la DO est effec- tuée sans couvercle, à intervalles réguliers (une à deux fois par jour, pendant trois semaines environ).
2.5 Exploitation des résultats
Les résultats bruts (DO) ont été traités par étapes successives :
1. Pour chaque espèce bactérienne, les valeurs de DO ont été transformées en biomasse à l’aide d’une gamme étalon établie selon la relation, Y = aX2+ bX, avec :
Y = la biomasse sèche (exprimée en g·L–1)
X = DO du milieu de croissance – DO du milieu stérile.
2. Les courbes de croissance en biomasse [biomasse = f(t)] ont été construites pour chaque combinaison de facteur (soit 2 ×8 ×96 cas). Ces courbes tracées sur une échelle logarithmique montrent une augmentation de la croissance suivie d’un arrêt. La biomasse atteint alors sa valeur maximale puis reste constante jusqu’à la fin de l’expérience. Nous avons fixé une valeur seuil (DO = 0,01) qui correspond à la limite de sensibilité de la mesure de DO. Les valeurs inférieures à ce seuil ont été éliminées des calculs ultérieurs. Le point initial de la courbe a été calculé à partir de la biomasse initiale inoculée dans le milieu.
3. À partir de chaque courbe, deux critères (ou variables expliquées) ont été déterminés pour décrire la courbe de croissance des bactéries ; il s’agit de :
– la pente de la droite reliant la biomasse initiale et la biomasse en fin de croissance (exprimées en logarithme népérien) ;
– la quantité de la biomasse produite, obtenue par la différence entre la bio- masse finale et la biomasse initiale.
Les valeurs de ces deux critères constituent les réponses des plans d’expé- rience. Lors des étapes suivantes ces valeurs sont traitées par des procédures statistiques pour déterminer les effets des facteurs du plan.
4. Le traitement statistique est réalisé à l’aide du logiciel SAS®par la procé- dure GLM (General Linear Model) selon la méthode décrite par NOEL et al., 1991. Il consiste à exprimer chacune des réponses (µ apparent et biomasse produite) sous forme d’un polynôme d’ordre 2 en fonction des trois facteurs du plan :
µ apparent = a1.(P) + a2.(P)2+ b1.(F) + b2.(F)2 + c1.(I) + c2.(I)2+ g.(P).(F) + h.(P).(I) + i. (F).(I) + e
Biomasse produite = α1.(P) + α2.(P)2+ β1.(F) + β2.(F)2+ γ1.(L) + γ2.(I)2+ δ.(P).(F) + ε.(P).(I) + ϕ.(F).(I) + e
où P, F et I représentent les polynômes orthogonaux normés correspondant respectivement au pH du milieu, à la concentration du composé phénolique (mM) et au taux d’inoculation (UFC.mL–1) et e l’erreur par rapport au modèle.
Les coefficients polynomiaux a1, a2, b1, b2, ... et α1, α2... β1, β2... définissent ainsi les effets des facteurs.
5. Afin de visualiser l’action des trois facteurs, nous avons représenté, sous forme d’histogrammes, les valeurs simulées des deux réponses à l’aide d’un sous-modèle impliquant uniquement les valeurs vraies des facteurs ayant un effet significatif.
3 - RÉSULTATS
Bien que l’acide férulique soit peu représenté dans la pomme et dans le cidre, il a été inclus dans ce travail pour pouvoir en comparer ses effets avec ceux de la littérature, généralement obtenus dans le vin qui contient une quan- tité non négligeable de cet acide.
3.1 Signification des résultats
Ce travail est constitué de 16 plans d’expérience qui se caractérisent par le choix de la bactérie et du composé phénolique ainsi que l’indique le tableau 2.
L’objectif des expérimentations est de déterminer l’effet de la concentration des composés phénoliques sur la croissance des bactéries, dans différentes condi- tions de pH et de taux d’inoculation.
Du fait de la faible sensibilité de la mesure de la DO le début de la crois- sance n’est pas observable. En conséquence il est impossible de déterminer le temps de latence et la vitesse spécifique de croissance. Nous avons donc quantifié la croissance des bactéries à l’aide de deux paramètres : le µ apparent qui correspond à la pente de la droite reliant la biomasse initiale et la biomasse en fin de croissance (exprimées en logarithme népérien), et la quantité de la bio- masse produite, obtenue par la différence entre la biomasse finale et la bio- masse initiale.
Tableau 2
Intitulé des plans d’expérience Table 2
Names of the experimental designs
Plan Bactérie Composé phénolique utilisé dans le plan d’expérience
OAF Oenococcus oeni Acide férulique
OAP Acide p-coumarique
OAC Acide caféique
OAQ Acide quinique
OEC Ester quinique de l’acide caféique
OEP Ester quinique de l’acide p-coumarique
OMC Mélange d’acide caféique et d’acide quinique
OMP Mélange d’acide p-coumarique et d’acide quinique
PAF Lactobacillus plantarum Acide férulique
PAP Acide p-coumarique
PAC Acide caféique
PAQ Acide quinique
PEC Ester quinique de l’acide caféique
PEP Ester quinique de l’acide p-coumarique
PMC Mélange d’acide caféique et d’acide quinique
PMP Mélange d’acide p-coumarique et d’acide quinique
Dans un premier temps la signification des effets a été calculée. Si l’on retient le degré de confiance de 95 % (α= 0,05), habituellement utilisé dans les interprétations statistiques, on observe que même des effets très faibles appa- raissent significatifs, compte tenu du nombre de degrés de liberté élevé. En conséquence, pour ne retenir que les effets les plus importants, la probabilité d’erreur de 1reespèce a été abaissée à α= 0,001 (effets très hautement signifi- catifs). De plus, pour chaque effet retenu le coefficient du sous-modèle a été calculé. Les plans d’expérience se différencient par le composé phénolique (ou le mélange des composés) dont on fait varier la concentration. Dans la suite ils seront désignés à l’aide de sigles dont la signification est indiquée dans le tableau 2. Les résultats du traitement statistique sont reportés sur le tableau 3 (Oenococcus oeni) et le tableau 4 (Lactobacillus plantarum).
3.2 Effets des facteurs sur la croissance de Oenococcus oeni
3.2.1 Effet du pH
Le tableau 3 montre que, pour tous les plans d’expérience réalisés, le pH (P) a un effet significatif tant sur le µ apparent que sur la biomasse formée : l’aug- mentation du pH provoque une augmentation de ces deux critères. Dans cinq des huit expérimentations (OAC, OAQ, OEC, OEP et OMC), cet effet est qua- dratique, ce qui indique l’existence d’une zone optimale de pH voisine de 4,3.
Dans les trois cas restant, OAF, OAP et OMP, seul un effet linéaire a été mis en évidence. Cet effet du pH peut être visualisé sur la figure 1 et la figure 2.
Tableau3 Probabilités d’erreur de 1reespèce et coefficients du sous modèle pour Oenococcus oeni Table 3 Probability of type I error and coefficients of the reduced model for Oenococcus oeni Bactérie:Facteurs et interactions Oenococcus oeniCoefficients du sous modèle EssaiParamètrePFIP.PF.FI.IP.FP.IF.I CoefficientkPkFkIkP.PkF.FkI.IkP.FkP.IkF.ICste OAFµapparent0,00080,00000,00730,02380,0131———0,0046 0,0063– 0,0133– 0,0113 Biomasse0,00030,0000—0,08000,0000—0,0010—— 0,0344– 0,18610,0411– 0,0573 OAPµapparent0,00000,0000—0,00800,02940,02010,0129—— 0,0207– 0,0180– 0,0321 Biomasse0,00000,0000—0,00020,00040,09020,0030—— 1,0776– 0,1673– 0,12190,0290– 2,0759 OACµapparent0,00000,00000,00000,00000,0020———0,0731 0,2907– 0,0086– 0,0036– 0,0330– 0,5270 Biomasse0,00000,0000—0,00000,0888———— 1,8241– 0,0549– 0,2115– 3,6052 OAQµapparent0,00000,00340,00000,0000————— 0,4881– 0,0032– 0,0576– 0,9320 Biomasse0,0000—0,00030,00000,05210,03290,0931—— 1,9739– 0,0103– 0,2257– 3,9133 OECµapparent0,00000,00770,00000,00000,00140,09930,0168—— 0,4879– 0,0036– 0,0584– 0,9055 Biomasse0,00000,0041—0,00000,0000———— 1,50000,1477– 0,1661– 0,0409– 3,1443
Tableau3 (suite) Probabilités d’erreur de 1reespèce et coefficients du sous modèle pour Oenococcus oeni Table 3 (continued) Probability of type I error and coefficients of the reduced model for Oenococcus oeni Bactérie:Facteurs et interactions Oenococcus oeniCoefficients du sous modèle EssaiParamètrePFIP.PF.FI.IP.FP.IF.I CoefficientkPkFkIkP.PkF.FkI.IkP.FkP.IkF.ICste OEPµapparent0,0000—0,00000,0000—0,08600,0167—0,0450 0,4320– 0,0029– 0,0513– 0,8020 Biomasse0,0000——0,0000———0,00290,0182 1,9094– 0,2208– 3,7971 OMCµapparent0,00000,00000,00000,00000,0086———0,0457 0,2804– 0,0099– 0,0042– 0,0320– 0,4934 Biomasse0,00000,0000—0,0000————— 1,7200– 0,0658– 0,1930– 3,4539 OMPµapparent0,00000,00000,03630,01060,0000———— 0,0150– 0,03870,0071– 0,0039 Biomasse0,00000,0000—0,00240,0000—0,0001—— 0,1254– 0,00730,0296– 0,0375– 0,2899 Les probabilités d’erreur de 1reespèce (P) permettant de tester la signification des effets des facteurs (P, F, I, PP, FF, II) et des interactions (P.F, P.I et F.I) sont indi- quése en caractère gras. Les zones grisées mettent en évidence les effets significatifs à 0,001 (ou P est inférieur à 0,001). Pour les effets et interactions significatifs les coefficients du sous-modèle «k»sont indiqués en italique. Probability of type I error for signifiance determination of the effect of the different factors (P, F, I, PP, FF, II) and their interactions(P.F, P.I et F.I) are written in bold. The grey areas are related to the significatant effects (P <0,001). When significaant, italic numbers give the coefficient “k” of the reduced model.
Tableau4 Probabilités d’erreur de 1reespèce et coefficients du sous modèle pour Lactobacillus plantarum Table 4 Probability of type I error and coefficients of the reduced model for Lactobacillus plantarum Bactérie:Facteurs et interactions Lactobacillus plantarumCoefficients du sous modèle EssaiParamètrePFIP.PF.FI.IP.FP.IF.I CoefficientkPkFkIkP.PkF.FkI.IkP.FkP.IkF.ICste PAFµapparent0,00000,0000—0,03730,0000—0,0000—— 0,28660,14400,0156– 0,0666– 0,8673 Biomasse0,00000,00000,00000,0000————— 5,4482– 0,23630,0605– 0,5701– 11,923 PAPµapparent0,00000,00000,09560,00000,0751—0,0000—0,0756 0,70780,0909– 0,0545– 0,0348– 1,6674 Biomasse0,00000,00550,00000,00040,00310,0308—0,0545— 4,70980,0545– 0,4606– 10,759 PACµapparent0,00000,00000,00000,00000,0983—0,00000,00630,0034 1,26700,0780– 0,0090– 0,1279– 0,0231– 2,6516 Biomasse0,0000—0,0126————0,0968— 0,5834– 1,4865 PAQµapparent0,00000,0010—0,0000———0,0871— 1,5096– 0,1527– 3,2912 Biomasse0,0000—0,00000,0003—0,0031——— 4,26870,0820– 0,4293– 9,9602 PECµapparent0,00000,00550,05450,0000———0,0030— 1,3204– 0,1269– 2,9472 Biomasse0,0000—0,00000,0125—0,08580,0651—— 0,59480,0835– 2,3419
Tableau4 (suite) Probabilités d’erreur de 1reespèce et coefficients du sous modèle pour Lactobacillus plantarum Table 4 (continued) Probability of type I error and coefficients of the reduced model for Lactobacillus plantarum Bactérie:Facteurs et interactions Lactobacillus plantarumCoefficients du sous modèle EssaiParamètrePFIP.PF.FI.IP.FP.IF.I CoefficientkPkFkIkP.PkF.FkI.IkP.FkP.IkF.ICste PEPµapparent0,00000,00020,00000,0000—0,00050,00010,00000,0175 0,56510,0629– 0,1219– 0,05420,0019– 0,01790,0220– 0,9370 Biomasse0,0000—0,00000,0553———0,0261— 0,81650,1006– 3,1854 PMCµapparent0,00000,00000,00000,00000,0223—0,0000—0,0000 0,98480,14370,0006– 0,0913– 0,0301– 0,0043– 2,2150 Biomasse0,0000—0,00000,00000,0713———— 6,38270,0732– 0,6816– 14,247 PMPµapparent0,00000,00000,05720,0270——0,00000,04910,0006 0,33190,23270,0094– 0,0623– 0,0045– 1,1304 Biomasse0,00000,00010,00580,00020,05150,0602——— 5,6870– 0,1407– 0,6010– 11,780 Les probabilités d’erreur de 1reespèce (P) permettant de tester la signification des effets des facteurs (P, F, I, PP, FF, II) et des interactions (P.F, P.I et F.I) sont indiquése en caractère gras. Les zones grisées mettent en évidence les effets significatifs à 0,001 (ou P est inférieur à 0,001). Pour les effets et interactions significatifs les coefficients du sous-modèle «k»sont indiqués en italique. Probability of type I error for signifiance determination of the effect of the different factors (P, F, I, PP, FF, II) and their interactions(P.F, P.I et F.I) are written in bold. The grey areas are related to the significatant effects (P <0,001). When significaant, italic numbers give the coefficient “k” of the reduced model.
Figure 1
Effet de la concentration des esters — acide 5’-caféoyl-quinique (OEC) et acide p-coumaroyl-quinique (OEP) — sur le µ apparent (a, c) et sur la production
de biomasse (b, d) de Oenococcus oeni
Effect of 5’-cafeoyl-quinic acid (OEC) and p-coumaroyl-quinic acid (OEP) concentrations on Oenococcus oeni specific growth rate (a, c)
and biomass production (b, d)
Seule l’expérimentation OMP montre une interaction significative entre pH et concentration en composé phénolique pour le critère « biomasse produite ».
Cette interaction s’exprime par une réduction de l’effet du pH lorsque la concentration en composés du mélange augmente mais, quelle que soit cette concentration, l’augmentation du pH entraîne toujours celle de la biomasse pro- duite.
3.2.2 Effet du taux d’inoculation
Le tableau 3 montre que le taux d’inoculation (I) présente un effet significatif sur le µapparent pour cinq des huit expérimentations (OAC, OAQ, OEC, OEP et OMC) ainsi que sur la quantité de biomasse produite dans un cas (OAQ). Les coefficients de l’effet I sont tous négatifs ce qui signifie que l’augmentation du taux d’inoculation entraîne la diminution du paramètre concerné.
3.2.3 Effet de la concentration des composés phénoliques
Les composés et mélanges que nous avons étudiés peuvent être classés en deux catégories principales selon leur effet :
– d’une part l’acide quinique (OAQ) et les esters quinique des acides hydroxy- cinnamiques, (OEC et OEP – figure 1) pour lesquels l’augmentation de la concentration n’entraîne en général aucune modification significative du µ apparent ni de la biomasse produite. À noter cependant que l’expérimenta- tion OEC (ester quinique de l’acide caféique) se singularise par une produc- tion plus élevée de biomasse pour les concentrations centrales c’est-à-dire 1 et 2 mM (effet quadratique négatif sans effet linéaire significatif) ;
– d’autre part les acides hydroxycinnamiques libres (OAF, OAP et OAC – figure 2) et les mélanges équimolaires d’acides hydroxycinnamiques / acide quinique (OMP et OMC) pour lesquels l’augmentation de la concen-
Figure 2
Effet de la concentration des acides férulique (OAF), p-coumarique (OAP), et caféique (OAC) sur le µ apparent (a, c, e) et sur la production de biomasse (b, d, f)
de Oenococcus oeni
Effect of ferulic acid (OAF), p-coumaric acid (OAP) and cafeic acid (OAC) concentrations on Oenococcus oeni specific growth rate (a, c, e)
and biomass production (b, d, f)
tration entraîne une diminution significative du µ apparent et de la bio- masse produite. À titre d’exemple la figure 2 permet de visualiser ces effets significatifs. Pour les expérimentations OAC et OMC (contenant de l’acide caféique) les effets sur le µ apparent et sur la biomasse produites sont linéaires, alors que pour les expérimentations OAF et OAP (acides férulique et p-coumarique) on observe un effet quadratique sur la bio- masse formée. Pour OMP (mélange acide p-coumarique / acide quinique) il existe un effet quadratique aussi bien sur la biomasse formée que sur le µ apparent. Tant pour les expérimentations concernant les AHC libres (OAF, OAP et OAC) que pour celles concernant les mélanges (OMP et OMC), on observe que l’effet de la concentration en composés phéno- liques varie selon les acides concernés : fort pour l’acide férulique (OAF), il est nettement plus faible pour l’acide caféique (OAC et OMC).
3.3 Effets des facteurs sur la croissance de Lactobacillus plantarum
3.3.1 Effet du pH
Comme pour Oenococcus oeni le tableau 4 montre que, dans tous les plans d’expérience réalisés, le pH présente un effet significatif tant sur le µ apparent que sur la biomasse formée : l’augmentation du pH provoque celle de ces deux critères. Dans trois des huit expérimentations (PAP, PAQ et PMC) cet effet est quadratique vis-à-vis des deux paramètres ce qui traduit également la présence d’une zone optimale. Cependant le pH optimum serait plus élevé pour cette bactérie (pH >4,8). Dans les cinq autres cas l’effet du pH est qua- dratique pour un seul des deux critères : le µapparent pour PAC, PEC, PEP et la biomasse produite pour PAF PMP. Les figures 3 et 4 permettent de visuali- ser ces effets.
Dans six des huit expérimentations (PAF, PAP, PAC, PEP, PMC et PMP) le pH présente une interaction significative avec la concentration en composé phénolique pour le critère µapparent. Comme pour Oenococcus oeni ces inter- actions s’expriment par une réduction de l’effet du pH lorsque la concentration augmente mais, quelle que soit la concentration des composés ou du mélange, le sens de l’effet est toujours le même : l’augmentation du pH entraîne toujours l’augmentation de la biomasse produite.
En outre pour l’expérimentation PEP il existe une interaction significative entre pH et taux d’inoculation ; comme précédemment, l’effet du pH reste dominant. L’interaction se traduit par une forte augmentation de l’effet du pH sur le µapparent lorsque le taux d’inoculation est à son niveau le plus élevé.
3.3.2 Effet du taux d’inoculation
Le tableau 4 montre que le taux d’inoculation (I) a un effet significatif sur la quantité de biomasse produite dans six des huit expérimentations (PAF, PAP, PAQ, PEC, PEP et PMC). Les coefficients de l’effet I sont positifs ce qui signifie que l’augmentation du taux d’inoculation entraîne celle de la biomasse produite.
Le taux d’inoculation (I) a également un effet significatif sur le critère µappa- rent pour trois des huit expérimentations (PAC, PEP et PMC), mais il peut exis- ter des interactions avec la concentration en composé phénolique (PMC) ou le pH (PEP). Dans ces deux cas l’effet du taux d’inoculation doit être calculé en
Figure 3
Effet de la concentration des esters — acide 5’-caféoyl-quinique (PEC) et acide p-coumaroyl-quinique (PEP) — sur le µ apparent (a, c) et sur la production
de biomasse (b, d) de Lactobacillus plantarum
Effect of 5’-cafeoyl-quinique acid (PEC) and p-coumaroyl-quinique acid (PEP) on Lactobacillus plantarum specific growth rate (a, c) and biomass production (b, d)
Tableau 5
Effet du taux d’inoculation (dµ/dI) sur le µ apparent de Lactobacillus plantarum (constant pour PAC) en fonction de la concentration en composés phénoliques
(pour PMC) et en fonction du pH (pour PEP) Table 5
Effect of pitching rate (dµ/dI) on Lactobacillus plantarum apparent specific growth rate (constant for PAC) as a fonction of phenolic compounds concentration (PMC)
and as a fonction of pH (PEP)
PAC – 0,0090
Concentration en composés phénolique (mM)
0 1 2 3
PMC – 0,0006 – 0,0037 – 0,0080 – 0,0123
PMP – 0,0094 – 0,0049 – 0,0005 – 0,0040
pH
3,3 3,8 4,3 4,8
PEP – 0,0095 – 0,0015 – 0,0125 – 0,0235
dérivant l’expression du µapparent (dans le modèle statistique) par rapport au taux d’inoculation (dµ/dI). Les valeurs de l’effet (I) regroupées dans le tableau 5, indiquent que le sens de l’effet est variable :
– soit il est constant et faiblement négatif pour PAC (sans interaction) ; – soit il varie en fonction de la concentration en composés phénoliques
(PMC et PMP) ; l’effet est variable et faible ;
– soit il varie en fonction du pH (PEP) ; l’effet est variable et faible.
Figure 4
Effet de la concentration des acides férulique (PAF), p-coumarique (PAP), et caféique (PAC) sur le µ apparent (a, c, e) et sur la production de biomasse (b, d, f)
de Lactobacillus plantarum
Effect of ferulic acid (PAF), p-coumaric acid (PAP) and cafeic acid (PAC) on Lactobacillus plantarum specific growth rate (a, c, e)
and biomass production (b, d, f)
3.3.3 Effet de la concentration des composés phénoliques
Seules deux expérimentations (PAF et PMP) ont présenté des effets signifi- catifs de la concentration en composés phénoliques sur la biomasse produite.
Dans les deux cas l’effet est négatif et il n’est pas accompagné d’interaction.
L’effet est quadratique uniquement dans l’expérimentation PAF.
On observe, contrairement aux expérimentations portant sur Oenococcus oeni, qu’en ce qui concerne le µ apparent, les effets significatifs de la concen- tration en composés phénoliques sont toujours associés à une ou plusieurs interactions (pH, taux d’inoculation). Comme dans le paragraphe précédent, du fait de la présence de ces interactions, les coefficients du modèle donnés dans le tableau 4 n’indiquent pas directement l’effet. Seuls les résultats du calcul de la dérivé du µ apparent par rapport à la concentration en composé phénolique (tableau 6) permettent de compléter les résultats en indiquant l’évolution de l’ef- fet pour les différents composés en fonction du pH.
Tableau 6
Effet de la concentration en composés phénoliques sur le µ apparent de Lactobacillus plantarum en fonction du pH
Table 6
Effect of the concentration of phenolic compounds on Lactobacillus plantarum apparent specific growth rate as a fonction of pH
pH 3,3 3,8 4,3 4,8
Expérimentation
PAF* – 0,0289 – 0,0623 – 0,0956 – 0,1289
PAP – 0,0239 – 0,0413 – 0,0587 – 0,0761
PAC – 0,0019 – 0,0096 – 0,0212 – 0,0327
PAQ — — — —
PEC — — — —
PEP – 0,0037 – 0,0052 – 0,0142 – 0,0231
PMC** – 0,0000 – 0,0150 – 0,0300 – 0,0450 PMP** – 0,0191 – 0,0030 – 0,0814 – 0,1125
(*) Les effets indiqués pour PAF sont des valeurs moyennes (effet à la concentration moyenne) car l’effet de la concentration est quadratique.
(**) Les effets indiqués pour PMC et PMP sont des valeurs moyennes (pour un taux d’inoculation moyen) car il existe également une interaction taux d’inoculation / concentration.
(*) Indicated effect for PAF are mean values (at mean concentration) because of the quadratic effect of the concentration.
(**) Indicated effect for PMC and PMP are mean values (at mean pitching rate) because of the inter- action effect of pitching rate with concentration.
Globalement, comme pour Oenococcus oeni, les composés et mélanges que nous avons étudiés peuvent être classés, selon leurs effets, en deux caté- gories principales :
– d’une part, les expérimentations PAQ (acide quinique), PEC et PEP (esters quinique des acides hydroxycinnamiques – figure 3), où l’augmentation de la concentration ne modifie pas (ou peu) le µapparent et la biomasse pro- duite. L’expérimentation PEP présente certes un effet significatif mais il est très faible par rapport aux autres effets mis en évidence ;
– d’autre part les expérimentations PAF, PAC et PAP (acides hydroxycinna- miques libres – figure 4) et les expérimentations PMC et PMP (mélanges équimolaires d’acides hydroxycinnamiques / acide quinique) où l’augmen- tation de la concentration entraîne la diminution significative du µapparent et, dans le cas de PAF et de PMP, de la biomasse produite.
La figure 4 permet d’observer, comme pour Oenococcus oeni que l’effet de la concentration en composés phénoliques varie selon les acides concernés : forte pour l’acide férulique (PAF), elle est nettement plus faible pour l’acide caféique dans PAC et PMC. De plus, l’effet porte essentiellement sur le µapparent : seuls PAF et PMP font exception mais, même dans ces cas l’effet de la concentration en phénol sur la biomasse ne conduit cependant pas à une inhibition totale.
4 - DISCUSSION
Le pH initial du milieu joue un rôle capital sur la croissance de Oenococcus oeni et de Lactobacillus plantarum. L’augmentation du pH accroît à la fois le µ apparent et la biomasse formée. Pour Oenococcus oeni, on observe un µappa- rent compris entre 0,6 et 0,8 h–1 lorsque les pH sont supérieurs à 4,3, alors qu’à pH 3,3 le taux de croissance est plus faible (0,2-0,3 h–1). De même, les valeurs cor- respondantes de la biomasse produites passent respectivement de 0,2-0,3 g·L–1 à moins de 0,1 g·L–1lorsque que le pH baisse de 4,8 à 3,3. Pour Lactobacillus plan- tarum le µ apparent est compris entre 0,40 et 0,60 h–1 à pH 4,8, et entre 0,02 et 0,03 h–1 à pH 3,3. Les valeurs des biomasses passent de 1,2-1,8 g·L–1 à 0,2-0,6 g·L–1quand le pH baisse de 4,8 à 3,3. Ces observations confirment de nombreux travaux antérieurs effectués dans différents milieux (dans le vin : BIDAN, 1967 ; PEY- NAUD, 1967 ; CASTINOet al., 1975 ; DAVISet al., 1986, ou dans un milieu à base de jus de pomme : CHAMPAGNEet al., 1989). EKLUND(1989) explique l’action du faible pH du milieu sur la croissance des bactéries par des perturbations du pH interne (pH du cytoplasme) de la cellule bactérienne. Pour Oenococcus oeni, il semble que le pH optimum soit situé entre pH 4,3 et 4,8, confirmant ainsi les travaux de CHAMPAGNEet al. (1989) qui indiquaient un pH optimal voisinant 4,5 dans le cas d’une souche de Oenococcus oeni. En revanche, pour Lactobacillus plantarum le µ apparent et la biomasse continuent d’augmenter au-delà de pH 4,8 ; il aurait donc fallu élargir le domaine d’étude du présent travail ce qui n’avait plus d’intérêt dans le domaine des boissons fermentées.
Le taux d’inoculation a été considéré comme un facteur du plan pour tenir compte de la variation des situations rencontrées dans l’industrie cidricole. Il présente un effet significatif pour les deux souches étudiées. Pour Oenococcus oeni, ce facteur agit négativement sur le µapparent, tandis que pour Lactobacil- lus plantarum, il influence essentiellement la production de la biomasse en l’aug- mentant. L’effet significatif du taux d’inoculation sur la croissance de Oenococcus oeni est difficile à interpréter sur le plan physiologique du fait que le paramètre µ apparent est influencé à la fois par la vitesse spécifique de crois- sance et par le temps de latence : la présence d’un temps de latence diminuerait davantage le µapparent dans le cas d’un fort ensemencement. Inversement, la sous-estimation sera d’autant plus forte que le taux d’inoculation sera élevé.
L’augmentation de biomasse pour Lactobacillus plantarum, peut être expliquée
par l’apport d’un facteur nutritionnel résultant de l’inoculation initiale sous forme de lyophilisat ou par la présence d’une substance permettant sa survie.
L’effet de la concentration en composés phénoliques est très variable selon le composé considéré. Dans les diverses expérimentations, l’acide quinique n’exerce aucun effet sur la croissance de Oenococcus oeni et de Lactobacillus plantarum. STEAD (1994) a cependant mis en évidence un effet stimulant de l’acide quinique sur la croissance de deux espèces de Lactobacillus (Lactobacil- lus collinoides et Lactobacillus brevis). En accord avec d’autres auteurs (WHITING et CARR, 1957 ; WHITING, 1975), STEADexplique cette stimulation par la capacité des bactéries étudiées à réduire, dans des conditions anaérobies, l’acide qui- nique qui est un puissant accepteur d’hydrogène, en acide dihydroshiquimique qui lui-même joue un rôle dans le métabolisme énergétique de bactéries (apport d’énergie). Ces derniers auteurs signalent que cette réduction se déroule après la transformation malolactique. À ce stade il n’y a pratiquement plus de sucre, du moins dans le travail des auteurs (WHITINGet CARR, 1957 ; WHITING, 1975) qui ont utilisé des cidres anglais i.e. ayant subi une fermentation alcoolique totale. En revanche dans notre travail, le milieu employé (FT80) contient 8,5 g·L–1 du mélange glucose / fructose, ce qui peut expliquer en partie que nous ayons obtenu des résultats contradictoires. Cet effet stimulant de l’acide quinique n’a pas été confirmé chez les levures et les moisissures (KALLIOet al., 1985).
En ce qui concerne les esters quiniques, pour Lactobacillus plantarum, l’effet des deux esters est pratiquement négligeable. Tandis que pour Oenococcus oeni l’ester quinique de l’acide caféique (acide 5’-caféoyl-quinique) a un effet quadratique significatif. Les concentrations intermédiaires augmenteraient légè- rement la production de la biomasse. Ces esters ont été peu étudiés, seul STEAD(1994) a examiné l’effet de l’ester quinique de l’acide caféique (acide 5’- caféoyl-quinique) sur la croissance bactérienne. Ses résultats sont également en contradiction avec ceux obtenus dans le présent travail car l’auteur a montré que cet ester stimulait la croissance de Lactobacillus collinoides et de Lactoba- cillus brevis. Il explique cette action par le fait que certains lactobacilles peu- vent, au moyen d’une hydroxy cinnamoyl quinate estérase (HCQE), hydrolyser l’ester en acides quinique et caféique. Ceci nous ramène à l’effet positif de l’acide quinique décrit par ce même auteur.
Comme nous l’avons vu précédemment, les effets des formes estérifiées des AHC sont faibles ou nuls dans notre travail. Cependant, dans le vin ou dans le cidre, ces esters peuvent être été hydrolysés par l’enzyme HCQE apportée soit par certaines moisissures, soit par emploi de préparations commerciales d’enzymes de clarification, de liquéfaction, d’extraction de la couleur qui sont éventuellement riches en HCQE (BARBE, 1995). C’est pour cette raison que nous avons examiné l’effet des mélanges équimolaires acide caféique / acide qui- nique et acide p-coumarique / acide quinique qui résulteraient d’une telle hydrolyse. Ceux-ci donnent des résultats comparables à ceux des AHC libres correspondants. Compte tenu de l’absence de l’effet de l’acide quinique sur la croissance des deux bactéries, nous limiterons la discussion à la seule fraction acide hydroxycinnamique du mélange.
Les acides hydroxycinnamiques libres c’est-à-dire l’acide caféique et surtout l’acide férulique et l’acide p-coumarique ont un effet négatif très significatif sur la croissance des deux bactéries étudiées. L’augmentation de la concentration de ces trois acides entraîne la diminution du µ apparent des deux bactéries. En
outre, elle diminue nettement la biomasse formée par Oenococcus oeni alors que celle de Lactobacillus plantarum est peu ou pas affectée. Ces résultats concor- dent avec ceux de STEAD(1993) qui, examinant l’effet de ces AHC libres sur Lac- tobacillus collinoides et Lactobacillus brevis, constate que l’inhibition de la croissance exercée par l’acide férulique et l’acide p-coumarique est supérieure à celle due à l’acide caféique. Des résultats similaires ont été obtenus par CAVINet al. (1993) lors de l’étude de l’action de l’acide férulique et de l’acide p-coumarique sur quatre espèces de bactéries lactiques : Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus et Oenococcus oeni. Ces auteurs ont constaté, que l’acide férulique était plus inhibiteur que l’acide p-coumarique.
Nos observations concernant l’activité inhibitrice des composés phénoliques confirment les travaux antérieurs. AALTO et al. (1953), BARANOWSKIet al. (1980), HERALDet DAVIDSON, (1983) et STEAD, (1993) s’accordent sur le fait que l’action inhibitrice des AHC libres sur la croissance des bactéries lactiques serait inver- sement liée à la polarité de ces acides. L’acide férulique (le moins polaire) est plus inhibiteur que l’acide p-coumarique lui-même plus inhibiteur que l’acide caféique (le plus polaire). RAMOS-NINOet al. (1996) confirment cette explication en précisant que l’activité anti-microbienne des AHC dépend de leur capacité à se dissoudre dans la membrane cellulaire. La perturbation qui en résulte serait due à la partie lipophile de la molécule. Ces auteurs proposent même un modèle de prédiction de la capacité inhibitrice des composés phénoliques qui tient compte à la fois du caractère polaire et du pKa. Cependant ce modèle est limité à des milieux pauvres en lipides et en protéines. Plus récemment BRULet COOTE (1999), lors d’une étude bibliographique signalent le même effet. Selon CHAMBEL et al. (1999), la vitesse spécifique de croissance de Saccharomyces cerevisiae est réduite d’environ 50 %, par rapport au témoin en présence de dérivés de l’acide cinnamique (20-35 mg·L–1). En réponse à ce stress l’adaptation de la levure se traduit par une augmentation de l’activité H+-ATPase de la membrane.
La différence de comportement entre Oenococcus oeni et Lactobacillus plantarum a également été signalée par CAVINet al. (1993). Selon ces auteurs, pour Lactobacillus plantarum, les AHC notamment, l’acide férulique, provoque- raient surtout l’augmentation du temps de latence lorsque l’inoculum a été pro- pagé en absence du substrat. Dans tous les cas le niveau final de biomasse est identique au témoin. Au contraire Oenococcus oeni cultivé dans les mêmes conditions est réellement inhibé (biomasse deux ou trois fois inférieure au témoin). Les auteurs indiquent également une adaptation des souches en corré- lation avec l’apparition d’une activité hydroxycinamate décarboxylase induc- tible. Pour d’autres auteurs GOODEY et TUBB (1982), HOPE(1987), cette activité décarboxylase constituerait un mécanisme de détoxification expliquant la résis- tance des levures sauvages de brasserie. Cependant cette hypothèse a été récemment contredite par les travaux de HAMMONDet al., (1999) qui ont montré que dans le cas de l’acide férulique, c’est le vinyl guaïacol produit par décar- boxylation enzymatique qui exerce l’activité antimicrobienne et non l’acide hydroxycinnamique lui-même.
Le pH a été retenu comme facteur du plan pour vérifier l’existence éventuelle d’une interaction pH / composés phénoliques. Ce choix a été motivé par les tra- vaux de HERALDet DAVIDSON(1983) qui avaient observé que la baisse du pH de 7 à 5 accentuerait l’efficacité inhibitrice des AHC sur la croissance de Staphylo- coccus aureus et d’Escherichia coli lorsque les AHC augmentaient. Selon eux, l’explication était la suivante : puisque le pKa des AHC est d’environ 4,5 (ONGet
NAGEL, 1978), à faible pH les AHC se trouvent majoritairement non dissociés, forme qui, selon EKLUND(1989), présente une forte activité antimicrobienne.
Dans le présent travail nous avons mis en évidence quelques interactions pH/concentration en composés phénoliques (OMP, PMP et PMC) mais les conclusions sont inverses : aux bas pH, l’effet des composés phénoliques est plus faible. Cette contradiction peut s’expliquer par deux remarques : tout d’abord la zone de pH examinée (de 3,3 à 4,8) est très éloignée de celle étudiée par ces auteurs ; de plus, aux pH les plus bas, l’inhibition de la croissance est suffisamment importante pour cacher l’effet inhibiteur d’un autre facteur.
5 - CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Le travail réalisé montre que, seuls, les acides hydroxy-cinnamique libres présentent une action inhibitrice sur la croissance des souches de Oenococcus oeni et de Lactobacillus plantarum testées ; cet effet dépend de l’hydrophobi- cité et de la concentration des AHC expérimentés. En présence d’AHC libres, ces deux espèces réagissent de manière différente : Oenococcus oeni subit toujours une diminution du µ apparent et de la biomasse maximale atteinte.
Pour Lactobacillus plantarum le µapparent est également toujours affecté, tan- dis que la biomasse produite est peu modifiée.
Ces résultats pourraient expliquer l’inhibition du développement plus ou moins rapide d’une population lactique observée dans les moûts et les cidres de variétés de pommes à cidre en fonction de la richesse en composés phéno- liques.
Cependant, pour que le milieu fermentaire devienne hostile aux bactéries il faut que les esters quiniques contenus dans les fruits sains, acides caféoylqui- nique et p-coumaroylquinique, soient dé-estérifiés en leurs AHC libres corres- pondants. Cette réaction est catalysée par des enzymes d’origine végétale ou microbienne, les hydroxycinnamoyl estérases. Dans le domaine cidricole, cette transformation a été peu étudiée, mais l’utilisation courante d’enzyme de clarifi- cation et la présence de moisissures dans la matière première laisse penser que cette hydrolyse peut avoir lieu. Il serait donc intéressant de vérifier l’apparition éventuelle des AHC libres dans le milieu fermentaire et de les quantifier pour déterminer dans quelle mesure les concentrations atteintes pourraient provo- quer une inhibition de la croissance de la population lactique.
REMERCIEMENTS
Les auteurs remercient le Comité des fruits à cidre pour son aide financière, Monsieur GUYOT, Madame MARNET (Station de recherches cidricoles, Inra) et Monsieur THIBAULTJ.-N. (Station de recherches porcines, Inra) pour leur assis- tance lors de l’isolement, la purification et la confirmation de la structure de
