Acidification chimique directe du lait :
corrélations entre la mobilité du matériel micellaire et les micro et macrostructures des laits acidifiés
Hamadi ATTIA*, Naouel KHEROUATOU, Jaafar AYADI
SUMMARY Direct chemical acidification of milk: correlation between the mobility of micellar material and the macro and microstructures of acidified milk.
Direct addition of lactic acid was used to follow the behaviour of reconstituted skimmed milk during a chemical acidification. The mobility of the micellar materials: minerals and caseins, was correlated with the change in a range of physicochemical parameters such as buffering capacity and conductivity. It was hypothesized that, for a given pH, the transformations that emerge within milk would be dependent on the biochemical state of: the added lactic acid;
the micellar minerals; and of some of the functional groups of caseins. Deter- mination of rheological state equations, calculation of storage and loss moduli and visualization by Scanning Electron Microscopy, allowed the hypothesis to be consolidated and showed the existence of three characteristic points around pH 5.8, 5.4 and 5.0. These results permitted some specificities of rapid and direct chemical acidification to be deduced and allowed their comparison with the situation in slow biological acidification.
Key-words: chemical acidification, lactic acid, buffering capacity, rheology, electron microscopy.
RÉSUMÉ
Une addition directe de l’acide lactique a été utilisée pour suivre le comporte- ment d’un lait écrémé reconstitué au cours d’une acidification chimique. La mobilité du matériel micellaire, minéraux et caséines, a été corrélée avec l’évo- lution de paramètres physicochimiques, pouvoir tampon et conductivité. Pour un pH donné, les transformations qui se manifestent au sein du lait seraient liées à l’état biochimique de l’acide lactique ajouté, des minéraux micellaires et de certains groupements fonctionnels des caséines. La détermination des équations rhéologiques d’état, l’évolution des modules de conservation et de perte et les visualisations en microscopie électronique à balayage ont conforté les hypothèses émises et ont fait apparaître trois points caractéristiques aux environs des pH 5,80 ; 5,40 et 5,00. L’ensemble des résultats a permis de
Département de génie biologique, École nationale d’ingénieurs de Sfax, BP W, 3038 Sfax, Tunisie.
* Correspondance aaaaaaaaaaaa
dégager certaines spécificités de l’acidification chimique rapide et directe comparée à l’acidification biologique lente.
Mots clés : acidification chimique, acide lactique, pouvoir tampon, rhéologie, microscopie électronique.
1 - INTRODUCTION
Le lait peut être acidifié par voie biologique, par addition de ferment lactique, mais aussi chimiquement, par ajout de divers acides ou encore par hydrolyse lente d’anhydride instable. Quelle que soit la voie empruntée, une composante va jouer le rôle dominant dans l’édification des propriétés mécaniques des laits acidifiés : c’est la micelle de caséine. Celle-ci présente, à l’état natif, des interac- tions complexes entre ses divers constituants ce qui explique le nombre impor- tant de modèles proposés pour sa structure (ROLLEMA, 1992). Ainsi, au pH du lait, la micelle présente des facteurs de stabilité dont l’implication a été mise en évidence par différents auteurs : un excès de charges négatives à la surface (DARLINGet DICKSON, 1979), la présence des parties C-terminales de la caséine κ sur toute la surface micellaire (HOLT et DALGLEISH, 1986) et une enveloppe très hydratée (WALSTRA, 1990). Les études concernant l’effet de l’abaissement du pH sur la stabilité micellaire ont été, souvent, suivies au cours d’une acidification s’effectuant in situ dans le lait et d’une façon progressive, à partir d’un ferment lactique ou à partir de la glucono-delta-lactone. Le premier processus est carac- térisé par des difficultés liées à la maîtrise du développement bactérien (ciné- tique de multiplication, état physiologique, facteurs de croissance, produits de métabolisme etc.). La seconde méthode, consiste en une acidification chimique mais qui est indirecte puisque le corps ajouté est un agent acidogène s’hydroly- sant lentement en acide gluconique. Pour avoir une acidification qui est à la fois rapide et facilement contrôlable, nous avons adopté une approche originale qui consiste à ajouter directement, à un lait sec reconstitué, un volume bien défini d’acide lactique. Celui-ci permet à la fois d’ajuster l’extrait sec du lait à une même valeur et d’obtenir le pH souhaité. Cette approche évite l’effet de la dilu- tion puisque l’acide ajouté à faible concentration (0,5 N) assure exactement le complément requis pour la reconstitution de chaque échantillon de lait acidifié analysé. Elle a également l’avantage de préserver totalement la composante lac- tose. De même, contrairement à la voie biologique et à la voie chimique progres- sive par les lactones, cette approche provoque une acidification directe du lait puisque la substance ajoutée est elle même l’agent acidifiant.
En permettant un raccourcissement important des temps technologiques et en assurant la stabilité des produits élaborés, l’acidification chimique directe est adoptée dans de nombreux procédés de fabrication de produits lactés tels que des fromages blancs (Cottage cheese), des produits à base de protéines flocu- lées (Ricotta) ou encore certaines pâtes molles filées (Mozarella). L’addition directe d’acide est également parmi les voies couramment utilisées dans la fabrication industrielle des caséines. En effet, elle assure, instantanément, l’in- solubilisation des protéines du lait écrémé qui est une étape essentielle dans cette fabrication (ALAIS, 1984).
Au cours de ces dernières années, de nombreuses techniques ont été utili- sées pour suivre l’acidification du lait. Nous citons, à titre d’exemples, l’ultrafil- tration et la microscopie électronique (ATTIAet al., 1988, 1991a, b), la rhéologie (RÖNNEGÅRD et DEJMEK, 1993 ; LUCEY et al., 1998a), les ondes ultrasonores (BENGUIGUI et al., 1994), la turbidité (GASTALDIet al., 1997), la diffusion de la lumière (DE KRUIF, 1997).
Dans le présent travail, nous avons essayé de suivre, grâce à des outils physi- cochimiques, les échanges de composantes entre les phases colloïdale et soluble du lait au cours de l’addition de l’acide lactique. En parallèle, nous nous sommes attachés à visualiser ces « mouvements » ioniques et moléculaires en suivant l’évolution du comportement macroscopique du lait acidifié et celle de la microstructure de la micelle déstabilisée, grâce respectivement à la rhéologie et à la microscopie électronique. Le rapprochement des résultats a permis d’acquérir des informations sur le mécanisme d’une acidification chimique rapide et directe.
2 - MATÉRIELS ET MÉTHODES
2.1 Lait
C’est un lait sec écrémé, de qualité bas chauffage (Laiterie du Parc, St Flo- rent le Vieil, France) reconstitué dans de l’eau déminéralisée, et gardé au repos à 4 °C. La composition moyenne du lait non acidifié (pH 6,70) est reportée sur le tableau 1.
Tableau 1
Composition moyenne du lait écrémé reconstitué non acidifié Table 1
Average composition of the non acidified reconstitued skim milk Composition Teneur moyenne
(g·kg–1)
Matières sèches 98,0
Lactose 54,7
Matières azotées totales 32,8
Caséines 24,9
Protéines solubles 5,8
Azote non protéique 2,1
Matières grasses 1,1
Cendres 9,7
Sodium 0,48
Calcium 1,31
Magnésium 0,11
Potassium 1,52
Phosphore 0,88
2.2 Acidification
L’abaissement du pH est réalisé par addition goutte à goutte d’une solution d’acide lactique 0,5 N (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne). Les volumes d’acide ajoutés, préalablement bien définis, permettent à la fois d’ajuster l’ex- trait sec à la valeur désirée et d’obtenir une gamme de pH allant de 6,70 (pH ini- tial du lait) à 4,40. L’acidification a lieu dans un réacteur de laboratoire de 200 ml, à une température de 20 °C et sous une agitation mécanique perma- nente de 300 tours/min avec un appareil Heidolph RZR 2051 (Heidolph-Elektro, Kelheim, Allemagne).
2.3 Séparation des phases soluble et colloïdale
Cette séparation est effectuée, pour différents pH, par ultracentrifugation à 190 000 g pendant 60 min et à 20 °C à l’aide d’un appareil Beckman L 7-55, équipé d’un rotor SW41 (Beckman Instruments, Gagny, France). Après centrifu- gation, les surnageants sont récupérés avec précaution et conservés à – 20 °C jusqu’au moment des dosages des matières azotées solubles et des matières minérales solubles.
2.4 Méthodes d’analyses
pH : il est suivi à 20 °C à l’aide d’un pH mètre Metrohm 744 (Metrohm LTD, Herisau, Suisse).
Conductivité : sa mesure est effectuée à 20 °C et sous agitation avec un conductimètre Tacussel électronique CDRV 62 équipé d’une électrode Tacussel TE 100 (Tacussel électronique, Lyon, France).
Azote : l’azote total (NT), l’azote non protéique (NNP), l’azote non caséinique (NNC) et l’azote soluble (NS) sont déterminés par la méthode de Kjeldahl (Nx 6,38) après minéralisation sur une unité Büchi 425, distillation sur une unité Büchi 320 (Büchi Laboratoriums, Flawil, Suisse) et titration avec de l’acide chlorhydrique 0,1 N. Les différences (NT- NNC) et (NS- NNC) conduisent res- pectivement à la teneur du lait ou des fractions analysées, en caséines totales et en caséines solubles.
Minéraux : le calcium (Ca), le magnésium (Mg), le potassium (K) et le sodium (Na) sont dosés par spectrométrie d’absorption atomique sur un appareil Hita- chi Z 6100 (Hitachi Instruments Engineering Co., Ibaraki-ken, Japon) en pré- sence du chlorure de lanthane (Sigma Chemical Co., St Louis, USA), pour le calcium et le magnésium, et du chlorure de césium (Merck, Darmstadt, Alle- magne) pour le sodium et le potassium.
Le phosphore est dosé par la méthode colorimétrique au phosphomolyb- date d’ammonium (PIEN, 1969) avec un spectrophotomètre Shimadzu UV-160A (Shimadzu Co., Tokyo, Japon).
Électrophorèse : les protéines contenues dans les surnageants de centrifu- gation (§ 2.3) sont séparées sur un gel de polyacrylamide en présence du dode- cylsulfate de sodium et du β-mercaptoéthanol (Sigma Chemical Co., St Louis, USA), dans une cuve mini Protean (Biorad Laboratories, Californie, USA) et selon une méthode basée sur celle de LAEMMLI (1970). Les électrophoré- grammes sont quantifiés sur un densitomètre (Camag, Muttenz, Suisse) connecté à un intégrateur (Omniscribe Recorder, Austin, USA).
Microscopie électronique à balayage : les échantillons subissent les traite- ments indiqués par ATTIA et al. (1993) et sont observés sur un appareil Philips XL 30 (Philips, Limeil Brevannes, France) après séchage au point critique du CO2sur un appareil Baltec CPD 030 et métallisation à l’or sur un appareil Baltec MED 20 (Balzers Union, Balzers, Allemagne).
Rhéologie : les propriétés rhéologiques sont étudiées sur un rhéomètre infor- matisé StressTech Reologica (Reologica Instruments AB, Lund, Suède), à une température de 20 °C ± 0,1 °C et avec un système de mesure à cylindres coaxiaux (diamètres 25 et 27 mm). Le régime permanent a été conduit, suivant le cas, avec une vitesse de cisaillement constante et égale à 200 s–1(le temps d’application est de 3 min) ou variable allant de 1 à 200 s–1(gradient obtenu en 20 min). Le régime sinusoïdal a été suivi sous une fréquence de 1 Hz et dans le domaine de viscoélasticité linéaire (déformation < 2 %). Pour les deux modes, 15,9 mL d’échantillon étaient récupérés dans une éprouvette graduée pour être transférés au système de mesure ; celui ci est protégé par un couvercle anti- évaporation.
Toutes les analyses ont été effectuées en triple et les valeurs représentées dans chaque courbe sont les moyennes des résultats obtenus.
3 - RÉSULTATS
3.1 Effet de l’addition directe de l’acide lactique sur les échanges entre les phases colloïdale et soluble
Ces échanges vont, notamment, être liés à la dissociation de l’acide lac- tique, à la mobilité des ions solubles, à la déminéralisation de la phase colloï- dale et à la solubilisation des caséines micellaires. Nous avons alors suivi les paramètres reflétant ces phénomènes.
Pouvoir tampon du lait (figure 1). Ce pouvoir, faible au départ, montre ensuite un accroissement important caractérisé par un changement notable de pente vers le pH 5,40 et par un maximum aux environs du pH 5,00. Au deçà de ce point, il chute tout en gardant des valeurs supérieures à celles du pH du lait de départ.
Conductivité du lait (figure 2). La variation de la conductivité présente une allure sigmoïde indiquant une évolution notable dans l’intervalle 6,00-5,00 avec un point d’inflexion au niveau du pH 5,50.
Solubilisation des minéraux micellaires (figure 3). Les courbes représentées indiquent l’évolution de la teneur en minéraux dans la phase soluble. Elles visualisent donc la déminéralisation de la micelle de caséines. Le (Na) et le (K) ne semblent pas être impliqués dans le processus de déminéralisation puisque leurs teneurs restent très proches de 100 %, quel que soit le pH du lait acidifié.
En revanche, le (Ca), le (Pi) et le (Mg) présentent des courbes sigmoïdes avec, vers les pH 5,50-5,40, un véritable point d’inflexion reflétant une sortie accrue des minéraux micellaires. Vers le pH 5,00 la déminéralisation semble être prati- quement totale, notamment pour le (Ca), mais pas pour le (Pi).
Figure 1
Effet de l’acidification chimique directe du lait écrémé reconstitué sur son pouvoir tampon [(volume de l’acide ajouté)·(normalité)/variation du pH)].
Ce pouvoir est déterminé à 20 °C et sur un volume de lait de 100 mL
Effect of direct chemical acidification of reconstituted skim milk on its buffering capacity [(volume of the added acid)·(normality)/(pH change)].
This capacity is determined at 20°C and on 100 mL milk volume
Figure 2
Effet de l’acidification chimique directe du lait écrémé reconstitué sur sa conductance (à 20 °C)
Effect of direct chemical acidification of reconstituted skim milk on its conductance (at 20°C)
Figure 3
Évolution de la fraction minérale soluble du lait écrémé reconstitué au cours de l’acidification chimique directe conduite à 20 °C.
(K), + ; (Na), ×; (Mg), ∆; (Pi), ; (Ca),
Evolution of soluble mineral fraction of the reconstituted skim milk during direct chemical acidification conducted at 20°C.
(K), +; (Na), ×; (Mg), ∆; (Pi),; (Ca),
Figure 4
Évolution de la fraction caséinique soluble du lait écrémé reconstitué, au cours de l’acidification chimique directe conduite à 20 °C
Evolution of soluble casein fraction of reconstituted skim milk during direct chemical acidification conducted at 20°C
Solubilisation des caséines micellaires (figure 4). Le suivi de la solubilisation des caséines micellaires montre que la phase soluble ne commence à s’enrichir sensiblement en caséines qu’à partir du pH 6,00 avec un maximum vers le pH 5,45. En deçà de ce point, c’est l’inverse qui se produit puisqu’on assiste à une réinsolubilisation très marquée des caséines.
Pour connaître la nature des caséines solubilisées au cours de l’abaissement du pH, nous avons procédé à des analyses électrophorétiques sur les phases solubles. Le tableau 2 présente une étude densitométrique qui a concerné uni- quement les bandes caséiniques. Au pH initial (pH 6,70), nous retrouvons dans la phase soluble les caséines αs, βet κavec une prédominance de la caséine β.
Au départ de l’acidification (pH < 6,00), seule la caséine κ semble quitter la phase micellaire. La solubilisation concerne ensuite toutes les caséines avec un maximum vers le pH 5,40. En deçà, une atténuation des bandes est observée.
Elle est rapide pour la caséine αs,vers le pH 5,00, et tardive pour la caséine κ, vers le pH 4,40. Pour ce dernier pH, seule la caséine βest encore décelable.
Tableau 2
Étude densitométrique d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu SDS, des phases solubles correspondant à différents pH (acidification
chimique directe, à 20 °C, du lait reconstitué écrémé).
Cette étude concerne uniquement les bandes caséiniques et donne une estimation des teneurs des diverses fractions
Table 2
Densitometric study of SDS-PAGE of soluble phases corresponding to different pH (direct chemical acidification, at 20°C, of the reconstituted skim milk).
This study concerns only the casein bands and gives an estimation of the contents in various fractions
Caséines solubles (g·kg–1)
pH Caséines totales* Caséine αs Caséine β Caséine κ
6,7 3,24 0,42 1,66 1,16
6,3 3,36 0,42 1,67 1,27
6,0 3,51 0,42 1,69 1,40
5,7 3,78 0,50 1,80 1,49
5,5 5,30 1,00 2,54 1,76
5,4 5,85 1,21 2,83 1,81
5,2 3,93 0,27 2,22 1,44
5,0 1,99 0,00 1,63 0,36
4,8 0,95 0,00 0,87 0,13
4,4 0,25 0,00 0,25 0,00
* Valeurs estimées par la méthode de KJELDAHL.
3.2 Effet de l’addition directe de l’acide lactique sur les propriétés rhéologiques du lait
Étude en régime permanent (figure 5). L’évolution de la viscosité apparente (η) montre une légère décroissance jusqu’au pH 5,50 puis une augmentation
Figure 5
Effet de l’acidification chimique directe du lait écrémé reconstitué sur son comportement rhéologique en mode permanent à 20 °C (a) Évolution de la viscosité apparente à 200 s–1en fonction du pH.
(b) Évolution des rhéogrammes (contrainte de cisaillement-vitesse de cisaillement) pour des pH >
5,50. (pH 5,80), ; (pH 6,00), ; (pH 6,30), ; (pH 6,70), .
Effect of chemical acidification of the reconstituted skim milk on its rheological behaviour in permanent mode at 20°C
(a) Evolution of the apparent viscosity at 200 s –1 according to pH.
(b) Evolution of rheograms (shear stress-shear rate) for pH > 5.5. (pH 5.8),; (pH 6.0),; (pH 6.3),; (pH 6.7),.
Figure 5
Effet de l’acidification chimique directe du lait écrémé reconstitué sur son comportement rhéologique en mode permanent à 20 °C
(c) Évolution des rhéogrammes (contrainte de cisaillement-vitesse de cisaillement) pour des pH
≤5,50. (pH 5,50), ; (pH 5,30), ; (pH 5,20), ; (pH 5,05), ; (pH 4,90), ; (pH 4,80), . (d) Évolution du seuil d’écoulement en fonction du pH.
Effect of chemical acidification of the reconstituted skim milk on its rheological behaviour in permanent mode at 20°C
(c) Evolution of rheograms (shear stress-shear rate) for pH ≤5.5. (pH 5.5),; (pH 5.30), ; (pH 5.2),; (pH 5.05),; (pH 4.9),; (pH 4.8),.
(d) Evolution of the yield stress with the pH value.
jusqu’aux environs de pH 5,00 (figure 5a). En deçà de ce point, la viscosité rechute tout en restant supérieure à celle du lait de départ. Le suivi des courbes d’écoulement au cours de cette acidification chimique montre que le comporte- ment reste celui d’un corps newtonien jusqu’au pH 5,50 (figure 5b). En deçà, les courbes sont caractéristiques de corps plastiques idéals (figure 5c). En effet, juste après un seuil d’écoulement (τs),la contrainte et la vitesse de cisaillement évoluent d’une manière proportionnelle. Ce seuil est, certes, très faible mais il évolue d’une manière remarquable en fonction du pH (figure 5d). Son évolution rappelle celle de la viscosité apparente (figure 5a).
Étude en régime harmonique (figure 6). Le suivi des modules de conserva- tion (G’) et de perte (G’’) en fonction du pH a permis de visualiser deux points remarquables. Le premier se situe vers les pH 5,50-5,40 et correspond, à la fois, au maximum de la courbe du module G’’ et au point d’inflexion de la courbe du module G’. Le second se situe vers les pH 5,10-5,20 où les deux modules se croisent, l’un vers la montée (G’) et l’autre vers la descente (G’’).
L’angle de perte (δ) a permis de délimiter trois zones de variations ; deux zones de faible variation en deçà du pH 5,10 et au-delà du pH 6,00, et une chute sen- sible entre ces deux valeurs.
Figure 6
Effet de l’acidification chimique du lait écrémé reconstitué sur son comportement rhéologique en mode harmonique à 20 °C, à 1 Hz et à une déformation < 2 % Évolution du module de conservation (G’), , du module de perte. (G”), et de l’angle de phase .
Effect of chemical acidification of reconstituted skim milk on its rheological behaviour in harmonic mode at 20°C, at 1 Hz and a strain < 2%
Evolution of storage modulus (G’),, of loss modulus (G”),and of phase angle .
3.3 Effet de l’addition directe de l’acide lactique sur la microstructure du lait (figure 7)
L’aspect natif, sphérique et individualisé, de la micelle s’observe jusqu’au pH 5,80 malgré certaines associations globulaires ou linéaires. Pour des pH plus bas, l’intégrité micellaire commence à se perdre et on observe l’apparition d’agrégats fusionnés sous forme de chaînes ou d’amas. La réticulation est d’abord « aérée » (pH 5,50) puis, de plus en plus dense jusqu’à un maximum vers le pH 5,00. En deçà, on assiste à un « effondrement » progressif de cette structure sous forme de flocons de tailles différentes (pH 4,60).
Figure 7
Observation en microscopie électronique à balayage du lait écrémé reconstitué et acidifié à différents pH (acidification chimique directe)
SEM micrographs of acidified reconstituted skim milk at different pH values (direct chemical acidification)
(pH 6,70)
(pH 5,80)
(pH 5,50)
(pH 5,20)
(pH 5,00)
(pH 4,60)
2µm
4 - DISCUSSION
Au cours de l’acidification chimique, des relations de cause à effet semblent exister entre la déminéralisation de la micelle et l’évolution des deux paramètres physicochimiques, conductivité et pouvoir tampon. Ainsi, au départ de l’acidifi-
cation, au pH < 6,30, les valeurs relativement faibles et pratiquement constantes du pouvoir tampon (figure 1) peuvent s’expliquer, d’une part, par une dissociation importante de l’acide lactique (pKa ~ 3,80) et, d’autre part, par une déprotonation relativement élevée de quelques groupements fonctionnels de certains résidus impliqués dans la minéralisation de la micelle. Ces groupe- ments présentent des pKa inférieurs au pH initial du lait et appartiennent notam- ment à l’ester phosphorique de la phosphosérine, à l’acide phosphorique et aux résidus d’acide glutamique et aspartique. La rétention des minéraux insolubles reste donc forte au départ de l’acidification ce qui préserverait l’intégrité de la micelle.
La légère évolution de la conductivité observée dans la même zone de pH serait due, par conséquent, à la présence d’acide lactique dans le milieu plutôt qu’à une libération de minéraux colloïdaux ou à un changement structural de la micelle.
Dans la seconde zone, qui s’étend du pH 6,30 aux environs du pH 5,00, nous observons un accroissement sigmoïde des trois paramètres étudiés. Cette augmentation s’achève aux environs de pH 4,90-5,00 et présente des points d’inflexion remarquables vers pH 5,40-5,50. Ainsi, la figure 3 montre une sortie accrue des minéraux impliqués dans la structure colloïdale (Ca, Mg, Pi), reflé- tant une protonation poussée des groupements fonctionnels cités ci-dessus.
L’acidification fait perdre progressivement à ces derniers leur aptitude à former des liaisons salines qui assureraient, selon les récents modèles micellaires pro- posés, soit, en particulier, des liens entre les submicelles (AOKIet al., 1992) soit, en particulier, des liens entre les molécules caséiniques elles-mêmes (DAL- GLEISH, 1997).
Les accroissements concomitants du pouvoir tampon (figure 1) et de la conductivité (figure 2) refléteraient respectivement l’augmentation du taux de solubilisation des minéraux micellaires sous forme de lactate et l’élévation du degré de mobilité des ions des caséines et/ou des submicelles larguées suite à la déminéralisation.
Cette seconde zone montre que la production d’ions lactate, qui est déjà amorcée depuis le départ de l’acidification, s’accroît de plus en plus, surtout à partir du pH 5,40, en entraînant une nette amélioration du pouvoir tampon.
Cette formation importante d’ions lactate résulte d’une migration accrue de matériel tampon, minéraux et caséines, de la phase insoluble vers le lactosé- rum. Elle permet, par conséquent, un déplacement de l’équilibre de dissociation de l’acide lactique ajouté, vers la forme indissociée conformément à la loi d’ac- tion de masse.
La troisième zone (pH < 5,00) semble concerner les pH de précipitation puisque la solubilisation des minéraux micellaires se ralentit considérablement pour finir par s’atténuer complètement. La solubilisation du (Pi) paraît plus pro- gressive et plus tardive que dans le cas d’une acidification lente. En effet, cette dernière entraîne la solubilisation totale de ce minéral vers le pH 5,20 (VAN HOOYDONKet al., 1986 ; LE GREAT et BRULÉ, 1993). Il est probable que les flo- cons caséiniques, caractéristiques de l’acidification chimique directe, piègent certains ponts salins impliquant du phosphate colloïdal. D’ailleurs, le peu de liens salins qui reste possible concernerait quelques acides aminés comme l’acide glutamique et l’acide aspartique dont certaines de leurs chaînes latérales présentent des pKa proches de 4,00. L’acide phosphorique, qui possède un
groupement à pKa faible (~ 2,10), peut, également, rester impliqué dans cer- taines liaisons ioniques, même pour les pH les plus faibles. Nous pensons que c’est cette déminéralisation tardive ajoutée au tampon citrate (pKa 4,10) et à la faible dissociation de l’acide lactique, qui expliquent le fait que le pouvoir tam- pon garde, malgré sa chute, des valeurs supérieures à celles observées au départ de l’acidification (figure 1).
La conductivité continue son accroissement même pour les pH faibles, reflé- tant un degré de dispersion de plus en plus élevé des entités présentes dans la phase aqueuse. Cette dernière n’est pas emprisonnée dans un réseau mais présente une facilité de séparation. C’est là une autre spécificité d’un coagulum chimique, dont l’obtention rapide et sous agitation, exclut toute possibilité d’édification d’une structure tridimensionnelle. Pour une acidification biologique progressive, il est évident que la formation du gel aboutirait, au niveau de cette même zone, à une réduction de la conductivité comme il a été remarqué par PICQUEet al. (1994).
L’évolution très étroite de ces paramètres a permis de définir de nombreux événements biochimiques, physiques et structuraux. Ainsi, au départ de l’acidi- fication (pH < 6,30), la structure micellaire serait très peu touchée puisque les échanges entre la micelle et la phase soluble sont minimes (figures 3, 4).
Ensuite, pour des pH inférieurs, la régression de la charge micellaire entraînerait un affaiblissement de la force répulsive de nature électrostatique entre les micelles et une réduction de l’eau d’hydratation de cette phase colloïdale. Les associations micellaires deviennent, alors, possibles comme en témoigne la diminution de la viscosité apparente jusqu’aux environs du pH 5,60 (figure 5a).
Cette diminution refléterait une réduction du nombre de particules en suspen- sion dans le lait.
À partir de ce pH (pH 5,60) et jusqu’à la fin de la seconde zone (pH ~ 5,00), l’événement biochimique qui semble déterminer pour une grande part la visco- sité du milieu (figure 5a) est la migration des caséines micellaires (figure 4). Pour des pH supérieurs à 5,40, cette migration est un largage à partir d’une structure micellaire restant relativement intègre. Pour les pH compris entre 5,40 et 5,00, il s’agit, au contraire, d’une réincorporation dans ce qui reste de la structure micellaire originelle. Ce squelette restant aurait une trame essentiellement for- mée de caséines αs agrégées (HEERTJE et al., 1985 ; VISSER et al., 1986). La solubilisation maximale des caséines se situe vers le pH 5,40 (figure 4). Ce résultat est identique à celui reporté par DALGLEISH et al. (1988, 1989) et par GASTALDI et al. (1996) lors de l’étude d’une acidification lente. La dissociation maximale des caséines semble correspondre à un degré bien défini de la démi- néralisation micellaire et serait donc indépendante du mode d’acidification.
L’étude électrophorétique des caséines solubilisées au cours de l’acidifica- tion montre les faits suivants (tableau 2) :
– la solubilisation a concerné tous les types de caséines ce qui est en accord avec les travaux de DALGLEISH et LAW(1988). Cependant, elle est maximale et importante à pH 5,40, ce qui est en désaccord avec les observations de SNOERENet al. (1984) et VAN HOOYDONKet al. (1986). Tous ces auteurs ont utilisé des voies d’acidifications lentes ;
– jusqu’au pH 6,00, seule la caséine κsemble se solubiliser ce qui suppose son emplacement préférentiel à la surface comme suggérait le modèle proposé par ONOet OBATA(1989) ;
– bien qu’elle ait une teneur plus faible que la caséine αs micellaire (SCHMIDT, 1980), la caséine βmicellaire présente une dissociation plus importante.
Cette différence de comportement est due au fait que les caséines αs sont relativement plus riches en groupements phosphoseryls et en charges négatives (WALSTRA, 1990) et présentent des pHi inférieurs (ROSE, 1968 ; VISSERet al., 1986) ;
– les caséines αs solubilisées semblent disparaître complètement vers le pH 5,00. Cette réintégration rapide confirme les possibilités d’association particulièrement élevée de cette caséine avec les autres types de caséines, surtout la caséine κ(BRULÉ et al., 1997 ; MC MAHONet BROWN, 1984 ; PAYENSet NIJHUIS, 1974 ; SCHMIDT, 1982);
– en-deçà du maximum de solubilisation (pH 5,40), les autres caséines s’at- ténuent progressivement. Il s’agit donc d’un véritable point de départ d’une réorganisation structurale des micelles. D’ailleurs, c’est au niveau de ce point que débute une évolution marquée de la conductivité (figure 2), de la déminéralisation (figure 3) et de la viscosité apparente (figure 5a).
Une réincorporation des caséines solubilisées débuterait, donc, vers pH 5,40 pour s’achever aux alentours de pH 5,00 par la formation d’une structure parti- culaire. Celle ci ne peut être que transitoire puisque, à ce pH, les protéines qui y sont impliquées sont presque totalement déminéralisées et pratiquement sans charges. Compte tenu des spécificités de l’acidification chimique, les particules caséiniques débuteraient, en-deçà de ce pH, une floculation « mécanique » lais- sant une liberté de circulation à la phase liquide. En effet, la rapidité de l’acidifi- cation chimique et l’agitation continuelle rendent difficile l’établissement de liaisons à l’exception, peut-être, des hydrophobes grâce à la forte proportion en résidus apolaires des caséines (MC MAHONet BROWN, 1984 ; ROEFSet VAN VLIET, 1990 ; TARODO DE LA FUENTEet al., 1999). Ces résidus, en réduisant les zones de contact entre les particules caséiniques, font contracter les flocons protéiques.
Ce resserrement protéique expliquerait la réduction de la viscosité apparente du
« coagulum » édifié, à partir de ce même pH (figure 5a). KIMet KINSELLA(1989) et GASTALDIet al. (1996) n’ont pas observé cet abaissement de viscosité lors de la formation lente d’un gel lactique, en raison, sûrement, de la présence d’une véri- table structure tridimensionnelle emprisonnant la phase aqueuse grâce à de nombreuses liaisons de faible énergie (BRULÉet al., 1997).
L’étude du comportement rhéologique du lait au cours de l’acidification chi- mique a permis de conforter les hypothèses émises ci-haut. Ainsi, le lait acidifié ne commence à présenter un seuil de contrainte décelable qu’à partir du pH 5,50. Or ce point correspond au maximum de solubilisation des caséines (figure 4) et à une véritable « initialisation » des interactions de ces caséines avec ce qui reste de la micelle native (figure 5a). Le maximum du seuil observé au pH 5,00 (figure 5d) est très rapidement suivi d’une chute brutale. Cette observation confirme le fait que la structure édifiée vers ce pH ne peut être que transitoire et que son « effondrement » est brusque. Il s’agit d’un véritable point de passage vers un coagulum chimique formé d’un précipité de caséines presque totalement déminéralisées et sans charges.
Les courbes d’écoulement à différents pH ont montré que le lait acidifié garde un comportement pratiquement linéaire jusqu’aux environs du pH 5,50 (figure 5b) et acquiert, en deçà, le comportement d’un corps non newtonien
(figure 5c). Son équation d’état s’écrit, dans le premier cas, τ= ηD ; (η= visco- sité absolue) et dans le second cas : τ=τs+ αD ; (α= viscosité plastique). Ces résultats permettent de dégager les points suivants :
– le lait acidifié chimiquement garde des micelles suffisamment stables même vers les pH proches de 5,50 puisqu’elles sont aptes à supporter les déformations, dues au cisaillement, sans changement de leur microstruc- ture (figure 5b) ;
– le caractère non newtonien est surtout marqué vers le pH 5,00. Ce point est siège d’un maximum d’interactions entre les divers types de caséines (figure 5c) ;
– aux valeurs de pH ≤5,50, l’écoulement est celui d’un liquide de Bingham.
Ce comportement traduit la fragilité des liaisons protéiques impliquées dans les laits acidifiés chimiquement ou dans les coagulums correspon- dants. Dans le cas d’un coagulum obtenu par voie biologique (FANGARYet al., 1999), le comportement à l’écoulement est différent. En effet, il suit le modèle de Herschell-Bulkley : τ=τs+ k Dn(k, n = constantes). Cette équa- tion indique que l’écoulement de ce gel lactique se fait d’une manière très progressive ce qui reflète un nombre relativement plus important des liens impliquées entre ses particules protéiques.
Le passage au régime dynamique a permis de localiser les limites des diffé- rentes étapes structurales d’une acidification chimique. Ainsi, le caractère élas- tique du coagulum semble « se préparer » dès le pH 5,50 et être définitivement acquis vers le pH 5,00 où les deux modules tendent à se stabiliser (figure 6). Le module élastique (G’) du coagulum chimique (~ 18 Pa) est inférieur à celui rap- porté pour un coagulum obtenu par l’action de la glucono-delta-lactone et à partir d’un lait ayant un extrait sec comparable (~ 30 Pa) (OULD-ELEYA et al., 1998). Ceci confirme la richesse relative du gel, obtenu par voie progressive, en liaisons possédant le caractère permanent.
Le pH 5,00 correspond pour cette acidification directe à une véritable struc- ture viscoélastique dominée par des liens caséiniques à temps de relaxation lent, aptes à emmagasiner une partie de l’énergie due au cisaillement. En effet, en ce point, la composante élastique l’emporte nettement sur le module vis- queux (figure 6).
L’angle de perte présente une décroissance suivie, vers les pH de précipita- tion, d’une tendance à la stabilisation (figure 6). Cette évolution est similaire à celle rapportée par LUCEYet al. (1998 b) lors d’une acidification d’un lait écrémé par la glucono-delta-lactone. L’angle de perte du gel correspondant (~ 15°) est, cependant, plus faible que celui du coagulum que nous avons obtenu par voie chimique directe (~ 30°). Celui ci présente, donc, un rapport entre les liaisons susceptibles de se rompre et les liaisons permanentes, relativement plus élevé.
Ce qui confirme sa relative fragilité.
Ce paramètre rhéologique (δ) ne commence à décroître sensiblement que vers le pH 5,80 (figure 6) indiquant des rapprochements ou des associations micellaires de plus en plus faciles. Cette décroissance est synonyme de l’appa- rition de nouveaux types de liaisons puisque l’angle de perte ne dépend que de la nature des liaisons et de l’importance relative des différents types de liaisons (ROEFS, 1986). Le maximum de G”, qui se situe vers le pH 5,50 indique que la structure micellaire native est définitivement perdue au profit d’une structure
fortement déstabilisée, pouvant contracter des liaisons protéiques de toutes sortes. Cependant, ces liaisons ne peuvent être que de courte durée de vie puisqu’elles dissipent l’énergie reçue au cours du cisaillement. Nous remar- quons, d’ailleurs, que le maximum du module de perte coïncide avec le point d’inflexion de l’évolution du module de conservation (figure 6). Cette correspon- dance ne peut que refléter un accroissement important des possibilités de contact entre les particules caséiniques. Nous pensons, alors, qu’une restructu- ration protéique a démarré au niveau du pH 5,50, et qui pourrait être, essentiel- lement, due à la réincorporation dans la micelle ou, dans ce qui reste de la micelle, de diverses caséines préalablement solubilisées.
L’étude en microscopie électronique à balayage a permis de visualiser l’évo- lution de la structure micellaire au niveau des principales étapes de l’acidifica- tion chimique. L’intégrité et la configuration sphérique observées pour la micelle dans le lait au pH normal (pH 6,70) se conservent jusqu’au pH 5,80 malgré les associations linéaires ou globulaires qui se multiplient. Vers le pH 5,50, les micelles perdent leur individualité puisque le « matériel » micellaire commence à se confondre pour donner un réseau lâche. Le « contact » micellaire s’intensifie, par la suite, jusqu’à l’obtention, vers le pH 5,00, d’une structure très réticulée.
Celle-ci « s’écroule », suite à la précipitation, en libérant des flocons caséi- niques (pH 4,60).
5 - CONCLUSION
Les travaux entrepris dans cette étude avaient pour but de mettre en évi- dence quelques événements physicochimiques et structuraux qui accompa- gnent une acidification chimique rapide. Comparé à celui des laits acidifiés par une voie lente, le comportement des laits acidifiés par addition directe de l’acide lactique était similaire pour certaines transformations et différent pour d’autres. Ainsi, on retrouve, au départ de l’acidification, l’effet très peu marqué de l’abaissement du pH sur l’intégrité de la phase colloïdale. De même, aux environs des pH 5,40-5,50, la micelle de caséine paraît acquérir de nouvelles propriétés structurales et biochimiques comparables à celles observées au cours d’une acidification biologique. En revanche, certaines caractéristiques se sont révélées spécifiques de l’acidification chimique. Ainsi :
– la solubilisation des caséines paraît, quantitativement, plus importante et elle se maintient plus longtemps au cours de l’abaissement du pH. La solubilisation complète du phosphate inorganique est obtenue à des valeurs de pH plus basses, vers pH 4,40 ;
– le coagulum édifié consiste en un ensemble de flocons caséiniques emboî- tés les uns sur les autres d’une manière plutôt mécanique ;
– les propriétés rhéologiques des laits acidifiés chimiquement paraissent refléter à la fois la faiblesse des interactions qui y sont impliquées et le haut degré de liberté de leurs phases aqueuses.
REMERCIEMENTS
Nous remercions M.ZOUHEIR FAKHFAKHpour les observations en microsco- pie électronique à balayage.
Reçu le 24 novembre 1999, accepté le 17 mars 2000.
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