Mise en évidence de nouveaux pigments formés par réaction des anthocyanes avec des métabolites de levure
Carime BENABDELJALIL1, 2, Véronique CHEYNIER1, *, Hélène FULCRAND1, Abdelhak HAKIKI2, Mahjouba MOSADDAK2, Michel MOUTOUNET1
SUMMARY Evidence of new pigments resulting from reaction between anthocyanins and yeast metabolites.
Four groups of orange pigments have been synthesized from mono-glucosyla- ted anthocyanins and either ethanal, α-ketoglutaric acid, acetone or 3- hydroxybutan-2-one. They were formed by ring - formation involving the C-5 hydroxyl group and the C-4 of the anthocyanin, and the enolic double bond of the four other compounds cited above, followed by a dehydration and an oxi- dation step. The pigments obtained were purified by low pressure chromato- graphy, followed by analysis by HPLC coupled to both a diode-array detector, and an electro spray mass-spectrometer. Some of the four pigments have been detected in synthetic media containing extracts of grape anthocyanins, after fermentation.
Keywords: anthocyanins, pigments, hemisynthesis, fermentation products.
RÉSUMÉ
Quatre groupes de pigments oranges ont été obtenus par synthèse à partir des anthocyanes monoglucosylées et d’éthanal, d’acide α-cétoglutarique, d’acé- tone ou de 3-hydroxybutan-2-one. Ils sont formés par une réaction de cyclisa- tion entre l’hydroxyle en C-5 et le carbone C-4 de l’anthocyane, et la double liaison de la forme énolique des composés précités, suivie d’une déshydratation et d’une oxydation. Les pigments obtenus ont été purifiés par chromatographie sur colonne à basse pression puis analysés par chromatographie liquide haute performance couplée, d’une part, à un détecteur à barrette de diodes, d’autre part, à un spectromètre de masse avec une source d’électronébulisation. Cer- tains d’entre eux ont également été détectés dans des milieux synthétiques contenant des extraits anthocyaniques de raisin, après fermentation.
Mots clés : anthocyane, pigment, hémisynthèse, produit de fermentation.
1. Institut national de la recherche agronomique, Institut des produits de la vigne, Unité de recherche bio- polymères et arômes, 2, place Viala, 34060 Montpellier cedex, France.
2. Laboratoire des substances naturelles et thermolyse éclair, Université Mohammed V- Agdal, Faculté des sciences, Département chimie, Rabat, Maroc.
* Correspondence cheynier@ensam.inra.fr
1 - INTRODUCTION
Les anthocyanes sont des molécules particulièrement étudiées en œnologie puisqu’elles sont responsables de la couleur des vins rouges. La teneur des formes natives anthocyaniques dans les vins est relativement faible. Les trans- formations qu’elles subissent au cours de la vinification incluent la conversion de leurs formes flavylium rouges en d’autres formes par transfert de proton ou hydratation (BROUILLARD et DELAPORTE, 1977 ; BROUILLARDet DANGLES, 1993), des réactions d’oxydation enzymatique (SARNI-MANCHADOet al., 1997), l’hydro- lyse des liaisons glycosidiques (PIFFAUT et al., 1994) et enfin des réactions de condensation avec les tanins, qui peuvent être directes, donnant des pigments oranges (SOMERS1971 ; LIAOet al, 1992) ou faire intervenir l’éthanal, générant alors des pigments mauves (TIMBERLAKEet BRIDLE, 1976 ; DALLASet al., 1996 ; ESCRIBANO-BAILONet al., 1996 ; ES-SAFIet al., 1999).
De plus, des travaux récents ont établi la présence de nouveaux pigments oranges dérivés des anthocyanes dans les vins (CAMEIRA DOS SANTOS et al., 1996). Ces molécules adsorbées sur des membranes de microfiltration tangen- tielle ont été isolées puis analysées par RMN. Des essais d’hémisynthèse ont confirmé qu’elles résultent d’une réaction de cyclisation de la double liaison du vinylphénol avec le C-4 et l’hydroxyle porté par le C-5 des anthocyanes majeures du raisin (3-O-glucoside de malvidol et son dérivé p-coumarique), en accord avec les structures proposées d’après les résultats des analyses spec- trométriques (FULCRANDet al., 1996).
Par ailleurs, une autre série de pigments, présentant un même excédent de masse par rapport aux anthocyanes natives (+ 68), a été mise en évidence dans le marc de raisin par couplage de la chromatographie liquide haute perfor- mance au spectromètre de masse (CLHP-SM) avec une source d’électronébuli- sation (BENABDELJALIL, 1998 ; FULCRAND et al., 1998). L’identification du pigment majeur par RMN et hémisynthèse a permis de proposer pour leur for- mation un mécanisme de cyclisation entre, d’une part, le C4 et l’hydroxyle en C5 de l’anthocyane, d’autre part, la double liaison de la forme énolique de l’acide pyruvique, suivi d’une déshydratation et d’une réaromatisation (FUL- CRANDet al., 1998).
Ces premiers résultats nous ont conduit à explorer la possibilité d’extrapoler ce mécanisme à d’autres précurseurs susceptibles de remplacer l’acide pyru- vique dans la réaction de cyclisation. Parmi ces molécules, trois métabolites des levures, l’éthanal, l’acide α-cétoglutarique et la 3-hydroxybutan-2-one, pré- sents sous forme céto-énolique dans le milieu de fermentation, ont été testés.
La réactivité de l’acétone a également été étudiée, puisque la formation de déri- vés oranges, présentant des spectres UV-visible similaires à ceux des adduits des anthocyanes avec le vinylphénol ou l’acide pyruvique, a été observée lors de l’incubation des anthocyanes dans ce solvant (GLORIES, 1978). Les adduits formés par réaction de ces quatre précurseurs sur les anthocyanes du raisin en solutions modèles ont également été recherchés dans les milieux de fermenta- tion.
2 - MATÉRIELS ET MÉTHODES
2.1 Produits et solvants
L’éthanal a été fourni par Sigma (Saint Quentin Fallavier, France) ; l’acide α- cétoglutarique, sous forme de sel disodique, et la 3-hydroxybutan-2-one ont été fournis par Fluka (Buchs, Suisse). L’acétonitrile et l’acide formique utilisés comme solvants pour les analyses par CLHP sont commercialisés par Merck (Darmstadt, Allemagne) et l’acétone et l’éthanol, de qualité analytique, par Pro- labo (Paris, France).
Un extrait polyphénolique a été préparé à partir d’un marc de raisin (Vitis vinifera, var. Carignan) provenant d’une vinification en rosé, par macération dans une solution d’éthanol à 80 % dans l’eau, pendant 3 h, avec un rapport solvant sur marc de 2,5 l/kg. Cet extrait brut a été ensuite concentré 5 fois à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide à 35 °C et purifié par chromatographie sur colonne de Polyvinylpyrrolidone (Polyclar AT, PVPP, GAF, France) suivant un protocole adapté de celui de GLORIES (1976). La fraction contenant les anthocyanes non acylées a été recueillie et analysée par chromatographie liquide haute performance (CLHP) sur colonne de phase inverse, comme décrit ci-dessous. Après élimination du solvant par concentration sous vide et lyophili- sation, 20 mg d’une poudre contenant les 3-O- glucosides du delphinidol, du cyanidol, du pétunidol, du péonidol et du malvidol ont été obtenus.
Un autre extrait contenant l’ensemble des anthocyanes du raisin a été pré- paré à partir de pellicules de Vitis vinifera var. Cabernet franc, par extraction dans du méthanol acidifié (WULF et NAGEL, 1978) et purification des antho- cyanes sur colonne de PVPP dans les conditions citées ci-dessus.
La caractérisation des différents composés anthocyaniques a été réalisée sur la base de leur temps de rétention, de leur spectre UV-visible (250-600 nm), et de leur spectre de masse, en se référant aux travaux de la littérature (WULFet NAGEL, 1978 ; BALDI et al., 1995). Leur dosage est réalisé à 520 nm par étalonnage externe avec une solution standard de 3-O-glucoside de malvidol (Mv-3-OG) qui sert de référence pour le dosage des autres pigments de la même famille. Toutes ces analyses ont été effectuées dans les conditions décrites ci-dessous.
2.2 Analyse chromatographique
2.2.1 Chromatographie liquide couplée à un détecteur à barrette de diodes (CLHP) Les analyses par CLHP ont été réalisées sur une chaîne KONTRON (Zurich, Suisse), incluant un système de pompage à gradient ternaire (Modèle 325), un injecteur automatique d’échantillons (Modèle 465), un détecteur à barrette de diodes (Modèle 440), et un four pour colonne (Modèle 480). L’ensemble est piloté par une unité informatique avec le logiciel DATA SYSTEM450-MT2. La pro- grammation de la chaîne permet l’automatisation des injections et l’enregistre- ment des spectres UV-visible (250-600 nm). La séparation des composés est obtenue sur une colonne Lichrospher 100 RP-18 (250 × 4 mm/5µm ; Merck, Suisse), protégée par une précolonne de caractéristiques identiques. Le four à colonne est thermostaté à 30 °C pour toutes les analyses.
Les conditions d’élution sont les suivantes : volume injecté : 20µl, solvant A : acide formique à 2 % dans l’eau, solvant B : acétonitrile/ acide formique/
eau (80:2:18, V/V/V), élution démarrant avec 3 % de solvant B, en isocratique pendant 7 min, continuant par des gradients linéaires, de 3 à 20 % de solvant B en 15 min, de 20 à 32 % de solvant B en 8 min, de 32 à 35 % de solvant B en 5 min, de 35 à 40 % de solvant B en 5 min, et de 40 à 50 % de solvant B en 5 min, suivis d’un lavage par 80 % de solvant B et du reconditionnement de la colonne aux conditions initiales.
2.2.2 Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (CLHP-SM) Les analyses en spectrométrie de masse ont été réalisées avec un spectro- mètre de masse SCIEX API I Plus (Sciex, Thornhill, Ontario, Canada) équipé d’une source d’ionisation par électronébulisation et couplé à un système chro- matographique Applied Biosystems, dans les conditions décrites précédem- ment (FULCRANDet al., 1998).
2.3 Obtention des nouveaux pigments par hémisynthèse
Trois échantillons de la poudre anthocyanique obtenue à partir du marc de Carignan (5mg) ont été incubés en présence d’éthanal (8,3 mg), d’α-cétoglutarate de sodium (100 mg) ou de 3-hydroxybutan-2-one (100 mg) dans une solution d’acide formique à 2 % dans l’eau (q.s.p. 10 ml), à 40 °C pendant 24 h. Chacune des trois solutions ainsi obtenues a été concentrée sous vide dans un évaporateur rotatif puis fractionnée par chromatographie sur colonne de Fractogel (TSK HW 40 F, Merck, Darmstadt, Allemagne) dans les conditions décrites ci-dessous (2.4).
Une quatrième solution a été préparée, suivant le protocole adopté par GLO- RIES (1978), par dissolution de la poudre anthocyanique dans une solution d’acétone à 60 % dans l’eau, incubée à température ambiante, pendant deux semaines, puis concentrée sous vide à 40 °C. L’extrait aqueux a été fractionné par chromatographie sur colonne de Fractogel.
2.4 Purification des pigments oranges
La purification des pigments oranges est réalisée par chromatographie sur phase de Fractogel dans une colonne de verre (100 × 10 mm). Un débit de 0,8 ml/min est maintenu grâce à une pompe péristaltique LKB Microperpex. Les fractions contenant les dérivés oranges, sont éluées par une solution d’acide tri- fluoroacétique à 0,05 % dans l’eau, concentrées par évaporation sous vide et maintenues à – 5 °C jusqu’à leur analyse par CLHP avec un détecteur à barrette de diodes et CLHP-SM.
2.5 Conditions de fermentation
Un milieu de fermentation à pH 3,3 contenant 1,7 g/l de base azotée (YNB) (sans les acides aminés et le sulfate d’ammonium), 10 mg/l d’azote (NH4CI) et 10 g/l de glucose a été préparé.
Après pasteurisation, ce milieu a été versé dans des ballons contenant res- pectivement l’extrait de marc brut (156 mg d’anthocyanes correspondant à 100 g de marc dans 300 ml de milieu de fermentation) et la fraction anthocya- nique extraite des pellicules de Cabernet franc (60 mg d’anthocyanes dans
120 ml de milieu de fermentation), qui ont été ensuite ensemencés et fermentés à 28 °C pendant 4 jours. La levure utilisée est une souche K1 (ICV, Inra, France).
Les deux échantillons fermentés ont été concentrés cinq fois puis soumis à une chromatographie sur colonne de Fractogel dans le but d’isoler les fractions contenant les pigments oranges (FI et FII). Les fractions FI et FII sont ensuite concentrées à 35 °C avant leur analyse par CLHP avec un détecteur à barrette de diodes et par CLHP-SM .
3 - RÉSULTATS ET DISCUSSION
3.1 Analyse de la composition anthocyanique des extraits
La composition anthocyanique de l’extrait de marc de Carignan est présen- tée dans le tableau 1. Il contient, outre les 3-O-glucosides du delphinidol, du cyanidol, du pétunidol, du péonidol et du malvidol, les dérivés p-coumaroylé et caféoylé du 3-O-glucoside de malvidol et les 3-p-coumaroylglucosides du del- phinidol et du pétunidol, dans des proportions conformes à celles rapportées dans la littérature pour le cépage Carignan (ROGGEROet al., 1984). La fraction d’anthocyanes obtenue après chromatographie de cet extrait sur colonne de PVPP ne contient que les 5 composés glucosylés non acylés, dans des propor- tions voisines de celles de l’extrait initial.
Tableau 1
Composition anthocyanique de l’extrait de marc de raisin (cv. Carignan) Table 1
Anthocyanin composition of the grape pomace extract (cv. Carignan)
Pic ANT tr (min) Teneur (g·kg–1) (%)
1 Dp-3-OG 24,33 1,08 14,3
2 Cy-3-OG 25,94 0,09 1,2
3 Pt-3-OG 26,94 0,9 12
4 (Mv+Pn)-3-OG 29,03 3,25 43,2
5 Dp-3-OG-p-coum 34,28 0,33 4,4
6 Mv-3-OG-caf 35,69 0,13 1,7
7 Pt-3-OG-p-coum 36,42 0,18 2,4
8 Mv-3-OG-p-coum 38,87 1,57 20,8
ANT : Anthocyane tr : temps de rétention
Dp-3-OG : 3-O-glucoside de delphinidol Cy-3-OG : 3-O- glucoside de cyanidol Pt-3-OG : 3-O-glucoside de pétunidol Pn-3-OG : 3-O-glucoside de péonidol Mv-3-OG : 3-O-glucoside de malvidol
Dp-3-OG-p-coum : 3-O-(6-p-coumaroyl) glucoside de delphinidol Mv-3-OG-caf : 3-O-(6-caféoyl) glucoside de malvidol
Pt-3-OG-p-coum : 3-O-(6-p-coumaroyl) glucoside de pétunidol Mv-3-OG-p-coum : 3-O-(6-p-coumaroyl) glucoside de malvidol
Tableau2 Analyse par CLHP et CLHP-SM des pigments oranges synthétisés Table 2 LC/DAD and LC/MS analysis of the synthesized orange pigments PigmentsCLHPCLHP-SM Modem/zR1R2R3R4R5PrécurseurAdduitMA tr (min)λmax (nm)tr (min)d’ionisationanthocyanique A32,0649015,84+517HHOCH3OCH3HMv-3-OGéthanal24 A1ndnd15,6+487CH3HOCH3HHPn-3-OGéthanal24 A2ndnd14,73+503CH3HOCH3OHHPt-3-OGéthanal24 A3ndnd14,35+473CH3HHOHHCy-3-OGéthanal24 A4ndnd13,24+489CH3HOHOHHDp-3-OGéthanal24 B33,6648016,69+531CH3HOCH3OCH3HMv-3-OGacétone38 B1ndnd16,49+501CH3HOCH3HHPn-3-OGacétone38 B2ndnd15,7+517CH3HOCH3OHHPt-3-OGacétone38 B3ndnd15,35+487CH3HHOHHCy-3-OGacétone38 B4ndnd14,51+503CH3HOHOHHDp-3-OGacétone38 C27,24497 - 50013,4-617CO2HCH2-CO2HOCH3OCH3HMv-3-OGα-cétoglutarique126 C1ndnd12,92-587CO2HCH2-CO2HOCH3HHPn-3-OGα-cétoglutarique126 D32,349216,43+561CH3-CH-OHHOCH3OCH3HMv-3-OG3-hydroxybutan-2-one68 E 29,7507 - 50814,83-559CO2HHOCH3OCH3HMv-3-OGacide pyruvique68 E129,15507 - 50814,69-529CO2HHOCH3HHPn-3-OGacide pyruvique68 E227,47507 - 50813,88-545CO2HHOCH3OHHPt-3-OGacide pyruvique68 E326,58507 - 50813,29-515CO2HHHOHHCy-3-OGacide pyruvique68 E424,6250812,35-531CO2HHOHOHHDp-3-OGacide pyruvique68 E531,0150815,51-601CO2HHOCH3OCH3acMv-3-OG-acacide pyruvique68 E632,6351415,89-723CO2HHOCH3OCH3cafMv-3-OG-cafacide pyruvique68 E734,3451416,83-705CO2HHOCH3OCH3coumMv-3-OG-coumacide pyruvique68 MA: excédent de masse des pigments oranges par rapport à celle de leur précurseur anthocyanique nd: non détecté
La fraction anthocyanique purifiée à partir de l’extrait de pellicules de Caber- net franc contient les 5 anthocyanes monoglucosides, ainsi que leurs dérivés acétylés (ac) et p-coumaroylés (coum), dans les proportions suivantes : Dp-3- OG (10,6 %), Cy-3-OG (2,7 %), Pt -3-OG (7,3 %), Pn-3-OG (7,6 %), Mv-3-OG ( 29,5 %), Dp-3-OG-ac (3,1 %), Cy-3-OG-ac (1,7 %), Pt -3-OG-ac (4,3 %), Pn-3- OG-ac (3,8 %), Mv-3-OG-ac (10,1 %), Dp-3-OG-coum (3,9 %), Cy-3-OG-coum (2,3 %), Pt -3-OG-coum (2,5 %), Pn-3-OG-coum ( 3 %), Mv-3-OG-coum ( 7,8 %).
3.2 Caractérisation des pigments obtenus par hémisynthèse
Quatre séries de pigments orangés ont été obtenues par incubation des anthocyanes dans les solutions contenant respectivement l’éthanal, l’acide α- cétoglutarique, la 3-hydroxybutan-2-one et l’acétone. Les fractions renfermant ces pigments ont été isolées à partir de chacune des solutions par chromato- graphie sur colonne de Fractogel et analysées par CLHP avec un détecteur à barrette de diodes et CLHP-SM. Les résultats de ces analyses sont regroupés dans le tableau 2. Les caractéristiques chromatographiques et spectrales des dérivés formés par réaction de l’acide pyruvique sur les anthocyanes monoglu- cosylées y sont également rappelées, pour mémoire.
Figure 1
Spectre de masse du pigment A (mode d’ionisation positif) Mass spectrum (positive ion mode) of pigment A
L’analyse par CLHP avec un détecteur à barrette de diodes de la fraction orange isolée par chromatographie sur Fractogel après réaction des antho- cyanes avec l’éthanal montre la présence d’un composé majeur (noté A), élué à un temps de rétention légèrement supérieur à celui de l’adduit de l’acide pyru- vique sur le 3-O-glucoside de malvidol, et présentant un spectre UV-visible
Figure2 Mécanisme réactionnel proposé pour la formation des pigments oranges Reaction mechanism proposed for the formation of the orange pigments
θ40 °C (24h)
caractéristique avec un maximum d’absorbance à 490 nm. L’analyse de cette solution par CLHP-SM a montré que ce produit est détecté en mode d’ionisa- tion positive à m/z = 517 (figure 1), ce qui correspond à un excédent de masse de 24 par rapport à la masse de la forme flavylium du 3-O-glucoside de malvi- dol, anthocyane majeure du raisin. Un ion fragment, correspondant à la perte d’un résidu glucosyle de masse 162, est également détecté à m/z = 355.
Toutes ces caractéristiques (polarité, spectre UV-visible, spectre de masse) sont semblables à celles de la vitisine B, isolée à partir du vin et identifiée par BAKKERetTIMBERLAKE(1997). Par ailleurs, le remplacement de l’acide pyruvique (figure 2, R1 = COOH, R2 = H) par l’éthanal dans le mécanisme d’addition sur le 3-O- glucoside de malvidol (figure 2, R1 = R2 = H) établi par FULCRAND et al.
(1998) conduit théoriquement à cette même structure. Ainsi, bien que l’identité de la molécule obtenue par hémisynthèse avec la vitisine B n’ait pas été formel- lement démontrée, tous ces arguments indiquent qu’il s’agit de la même molé- cule. Notons à ce propos que le produit de la réaction du 3-O-glucoside de malvidol avec l’acide pyruvique n’est autre que la vitisine A isolée par BAKKERet TIMBERLAKE (1997), bien que les spectres de RMN aient été interprétés diffé- remment par les deux équipes (FULCRANDet al., 1998).
Les autres pigments de la même famille n’ont pu être analysés directement par CLHP-SM en raison de leur très faible concentration. Cependant, lorsque des extractions d’ions ont été réalisées sur les masses correspondant à un même excédent de 24 unités de masse atomique (u.m.a) par rapport à celles des 3-O-glucosides de delphinidol, de cyanidol, de pétunidol et de péonidol, ces masses ont été détectées dans l’ordre d’élution attendu pour les pigments issus de la réaction de l’éthanal avec les différentes anthocyanes (A1 à A4, tableau 2).
Figure 3
Spectre de masse du pigment B (mode d’ionisation positif) Mass spectrum (positive ion mode) of pigment B
Figure 4
Chromatogrammes de la fraction contenant les pigments formés par réaction de l’acétone avec les anthocyanes (a) Courant ionique total (TIC) (b) profil obtenu
par extraction des ions correspondants aux masses de ces pigments HPLC-MS trace of the fraction containing the anthocyanin-acetone adducts (a) Total
ion current (TIC), (b) ion currents extracted (XIC) from the total ion current, each one corresponding to the m/z value of a derived pigment
L’analyse par CLHP avec un détecteur à barrette de diodes de la solution orange résultant de l’incubation des anthocyanes en présence d’acétone a per- mis de mettre en évidence un produit majeur (noté B) moins polaire que le 3-O- glucoside de malvidol, présentant un spectre UV-visible caractéristique avec un maximum d’absorbance à 480 nm. L’analyse de cette fraction par CLHP-SM a
montré que ce pigment est détecté en mode d’ionisation positive à m/z = 531 (figure 3), ce qui correspond à un excédent de masse de 38 par rapport à la masse de la forme flavylium du 3-O-glucoside de malvidol, anthocyane majeure du raisin. Ces caractéristiques spectrales sont en accord avec la structure résul- tant du mécanisme réactionnel proposé (figure 2, R1 = CH3, R2 = H). De plus, quatre autres composés présentant un même excédent de 38 u.m.a. par rapport à celles des 3-O-glucosides de delphinidol, de cyanidol, de pétunidol et de péo- nidol (B1 à B4, figure 4), ont été détectés dans la solution. Les proportions rela- tives des cinq nouvelles molécules et leurs polarités correspondent bien à celles de leurs précurseurs anthocyaniques respectifs, ce qui confirme qu’elles sont formées à partir des cinq anthocyanes du raisin par le même mécanisme.
L’analyse de la fraction orange résultant de l’addition de l’acide α-cétogluta- rique sur les pigments anthocyaniques a révélé la présence d’un pigment C (tableau 2), plus polaire que le 3-O-glucoside de malvidol, présentant un maxi- mum d’absorption en UV-visible à 497-500 nm et détecté à m/z = 617 en mode négatif (figure 5). Cette masse correspond à un excès de 126 unités de masse par rapport à la masse du 3-O-glucoside de malvidol détectée en mode négatif sous forme de l’ion pseudo-moléculaire [M-2H]–. Ce composé peut corres- pondre à l’addition de l’acide α-cétoglutarique sur le dérivé glucoside de malvi- dol selon le mécanisme proposé (figure 2 : R1 = CO2H, R2 = CH2-CO2H, R3 = R4
= OCH3, R5 = H).
Figure 5
Spectre de masse du pigment C (mode d’ionisation négatif) Mass spectrum (negative ion mode) of pigment C
Un autre composé légèrement plus polaire, C1 (tableau 2), a été détecté dans cette fraction par extraction d’ions en mode d’ionisation négative, à m/z
= 587, ce qui correspond à la masse de l’adduit de l’acide α-cétoglutarique sur le 3-O-glucoside de péonidol (R3 = OCH3, R4 = R5 = H).
Notons que la détection de ces molécules s’effectue facilement en mode d’ionisation négatif, du fait de la présence de deux fonctions carboxyliques, facilement déprotonées, comme cela a été observé dans le cas des produits obtenus par addition de l’acide caféoyltartrique, sous sa forme oxydée (o-qui- none) (SARNI-MANCHADOet al., 1997), ou de l’acide pyruvique (FULCRANDet al., 1998) sur les anthocyanes. De plus, un ion fragment à m/z = 499 a été obtenu en augmentant la tension d’orifice, ce qui s’explique par la perte de deux grou- pements carboxyliques (– 2 ×44 u.m.a), en accord avec la structure proposée.
Figure 6
Spectre de masse du pigment D (mode d’ionisation positif) Mass spectrum (positive ion mode) of pigment D
L’analyse de la fraction orange obtenue par incubation des anthocyanes avec la 3-hydroxybutan-2-one a révélé la présence d’un pigment majeur D (tableau 2), de polarité intermédiaire entre celles des pigments C et B, présen- tant un maximum d’absorption en UV-visible à 492 nm et détecté en mode d’io- nisation positif à m/z = 561 (figure 6).La masse du pigment D présente un excès de 68 unités par rapport à celle du 3-O-glucoside de malvidol, en accord avec la structure attendue pour le produit d’addition de la 3-hydroxybutan-2-one sur le 3-O-glucoside de malvidol selon le mécanisme proposé (figure 2 : R1= C2H4OH, R2 = H, R3 = R4 = OCH3, R5 = H). Les autres pigments de la même famille que le pigment D n’ont pas été détectés du fait de leur très faible concentration.Notons que la masse du pigment D est identique à celle de l’ad- duit de l’acide pyruvique sur le 3-O-glucoside de malvidol (vitisine A). Cepen- dant, ces deux composés diffèrent par leur polarité et leur maximum d’absorption dans le visible (λmax= 492 nm, pour le pigment D, et 508 nm, pour la vitisine A) (tableau 2). En outre, ces deux pigments présentent un comporte- ment différent en spectrométrie de masse puisque la vitisine A répond bien en mode négatif du fait de la présence d’une fonction acide dans sa structure tan- dis que le pigment D répond mieux en mode positif.
Ainsi, bien que ces diverses molécules n’aient pu être isolées en quantités suffisantes pour une identification formelle, leurs caractéristiques spectrales indiquent que les quatre précurseurs testés dans nos conditions d’hémisyn- thèse peuvent réagir avec les anthocyanes par le mécanisme établi précédem- ment dans le cas de l’acide pyruvique (FULCRAND et al., 1998 ; figure 2, R1= COOH, R2 = H), en accord avec l’hypothèse à la base de ce travail. En effet, les masses déterminées pour les différents pigments sont bien celles attendues à partir de chacun des précurseurs, d’après le mécanisme réaction- nel proposé en figure 2.
De plus, la similitude des spectres UV-visibles de ces molécules avec ceux des adduits formés par réaction des anthocyanes et l’acide pyruvique (FUL- CRANDet al., 1998) ou les vinylphénols (FULCRANDet al., 1996) confirme que le chromophore flavylium est modifié de la même manière dans les différents groupes de pigments. La cyclisation induit dans tous les cas un effet hypso- chrome du rouge vers l’orange (figure 7). Ceci a été expliqué dans le cas de l’adduit du vinylphénol sur l’anthocyane par le déplacement de l’équilibre en faveur de la forme mésomère chargée sur le nouvel hétérocycle (dans ce cas, forme pelargonidol) (FULCRANDet al., 1996 ). Cet effet varie selon la nature des substituants R1et R2 des précurseurs (tableau 2). En effet, quand R1implique une conjugaison avec le nouveau cycle pyrane (cas du vinylphénol et de l’acide pyruvique), on constate que les pigments formés ont un maximum d’absorption dans le visible entre 506 nm et 509 nm.
1 000 900
750
600
450
300
150
0
250 300 375 450 525 600
B
A D C
E
480
490492 497 508
Longueur d’onde (nm)
Absorbance (×1 000)
Figure 7
Spectres UV-visible des pigments A, B, C, D et E UV-visible spectra of pigments A, B, C, D et E
Quand R1n’implique pas de conjugaison avec le nouveau cycle pyrane, on constate un effet hypsochrome plus important (λmax= 492 nm pour l’adduit de la 3-hydroxybutan-2-one, 490 pour l’adduit de l’éthanal), qui peut être renforcé par l’effet inductif + I (λmax= 480 pour l’adduit de l’acétone où R1 = CH3).
D’autre part, on remarque que l’effet hypsochrome augmente aussi quand R2 est substitué : c’est le cas de l’adduit de l’acide α-cétoglutarique C (R2= CH2CO2H) qui présente un λmax à 500 nm tandis que les adduits de l’acide pyruvique (R2= H) ont un λmaxà 508 nm.
Tableau 3
Analyse par CLHP et CLHP-SM des deux fractions oranges FI et FII Table 3
LC/DAD and LC/MS analysis of the two orange fractions FI and FII
CLHP CLHP-SM Pigments
tr (min) λmax tr (min) [M]+
26,22 508 13,04 575 ?
27,95 508 13,92 547 E2
nd nd 14,82 531 E1
29,12 508 14,83 561 E
30,87 492 15,18 564 ?
30,98 508 15,4 603 E5
nd nd 15,6 608 ?
FI nd nd 15,6 487 A1
31,51 480 15,6 517 A2
32,06 490 15,87 517 A
32,54 nd 16,09 736 ?
33,08 474 16,44 501 B1
33,63 480 16,64 531 B
35,68 483 17,67 573 Mv-3OG-ac adduit acétone
nd nd 18,01 694 Mv-3OG-coum adduit acétone
18,24 313 9,04 618 GRP
nd nd 12,6 533 E4
28 450 14,04 375 ?
nd nd 13,48 489 A4
29,25 490 14,34 503 A2
FII 29,96 507 15,08 561 E
31,12 507 15,65 603 E5
31,89 490 15,77 487 A1
31,9 490 15,99 517 A
nd nd 16,95 559 Mv-3OG-ac adduit éthanal
FI : fraction orange purifiée à partir du milieu contenant les anthocyanes monoglucosylées, après fer- mentation
FII : fraction orange purifiée à partir du milieu contenant l’extrait de marc de raisin, après fermenta- tion
nd : non détecté
3.3 Mise en évidence des nouveaux pigments après fermentation alcoolique de solutions contenant les extraits anthocyaniques Dans l’élaboration des produits dérivés du raisin et notamment des vins, la fermentation permet de convertir les sucres du raisin en alcool après glycolyse, donnant d’abord l’acide pyruvique puis l’éthanal (par décarboxylation de l’acide pyruvique) et enfin l’éthanol.
Cependant, plusieurs produits secondaires peuvent être produits à partir de l’acide pyruvique, notamment l’acétone, la 3-hydroxybutan-2-one (acétoïne), l’acide oxaloacétique, le diacétyle… Tous ces produits présentent une tautomé- rie céto-énolique et sont donc susceptibles de réagir, sous leur forme énolique, avec les pigments anthocyaniques selon le mécanisme décrit plus haut.Il nous a paru utile de rechercher ces pigments après fermentation alcoolique d’un milieu synthétique contenant, soit le mélange d’anthocyanes purifié à partir de pelli- cules de Cabernet franc, soit un extrait de marc de Carignan. Les deux fractions oranges (FI et FII) obtenues par chromatographie sur Fractogel de chacune de ces solutions, après fermentation, ont été analysées par chromatographie liquide avec un détecteur à barrette de diodes et par CLHP-SM (tableau 3).
L’analyse de la fraction orange FI purifiée à partir de la solution ne contenant que les anthocyanes a montré la présence des adduits de l’acide pyruvique, de l’éthanal et de l’acétone sur les anthocyanes majoritaires (3-O-glucoside de pétunidol, de péonidol et de malvidol, 3-O-glucoside de malvidol acétylé). Les hypothèses émises sur l’identification des adduits de l’éthanal et de l’acétone sur les anthocyanes acylées qui n’étaient pas présents dans les solutions obte- nues par hémisynthèse, reposent sur l’analyse de leurs spectres de masse et leurs temps de rétention supérieurs à ceux des dérivés non acylés correspon- dants.
Notons que bien que certains des pigments repérés dans ces fractions pré- sentent des masses identiques, leurs spectres UV-visible et leur polarités per- mettent de les distinguer. Dans la fraction FII (tableau 3), on observe tout d’abord un produit polaire qui apparaît sur le chromatogramme en phase inverse bien avant les nouveaux pigments et présente un λ max à 324 nm. Ce produit est détecté à m/z = 618 en CLHP-SM au temps de rétention de 9,04 min. Nous l’avons attribué à l’acide S-glutathionyl-2-caféoyltartrique en nous basant sur les constantes chromatographiques (temps de rétention) et spectrales (UV-visible, masse) données dans la littérature (CHEYNIER et al., 1986). Ce produit résulte de l’addition du glutathion sur l’o-quinone de l’acide caféoyltartrique formée par oxydation enzymatique de ce dernier.
La fraction FII contient, comme la fraction FI, les produits formés par réac- tion de l’acide pyruvique et de l’éthanal sur les anthocyanes majeures de l’ex- trait (notamment 3-O-glucoside de delphinidol, 3-O-glucoside de malvidol et 3-O-glucoside de malvidol acétylé, cf tableau 1, mais les adduits de l’acétone n’y ont pas été détectés.
4 - CONCLUSION
Les résultats obtenus montrent que le mécanisme d’addition de l’acide pyruvique sur les anthocyanes générant des pigments oranges peut être géné- ralisé à tous les composés présentant une tautomérie céto-énolique. Les molé- cules susceptibles d’être impliquées dans de telles réactions incluent notamment des produits issus de la glycolyse, libérés dans le vin au cours de la fermentation alcoolique. Ce type de réaction peut expliquer la diminution de la teneur anthocyanique au cours de la fermentation alcoolique en plus du proces- sus de condensation des anthocyanes avec les tanins.
REMERCIEMENTS
Les auteurs remercient MM. J.-M.SOUQUETet J.-L.ROUSTANde l’Institut des produits de la vigne (Inra, Montpellier) et M. HMAMOUCHIde la Faculté de méde- cine de Rabat pour leur aide à la réalisation de ce travail.
Reçu le 15 février 1999, révisé le 27 août 1999, accepté le 15 novembre 1999.
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