NOTE
Influence des proportions de Leuconostoc
mesenteroides dans l’inoculum sur la fermentation d’un mélange de légumes à base de carottes
Tony SAVARD1, Claude P. CHAMPAGNE2 *, Carole BEAULIEU3
SUMMARY Influence of Leuconostoc mesenteroides proportions in the inoculum on the fermentation of carot-based mixed vegetables.
A vegetable mix composed of carrots, cabbage, onions and salt brine was ino- culated at 3 ×106CFU/mL with starters composed of Leuconostoc mesente- roides, Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici. The ratio of strains in the inoculum was modified and the effect on the subsequent fermen- tation was studied. Ratios varied from an equal proportion of all three cultures (R1 starter), to starters having proportionnally 5 (R5 starter) or 10 (R10 starter) times more Leuconostoc content. Fermented vegetables inoculated with the R10 had a final pH slightly higher (0.04 pH unit on the average) than those ino- culated with the R1 culture. There were higher levels of acetic acid and a lower content in lactic acid in the R10-inoculated fermented vegetables. Between days 8 and 30 of storage at 4°C, mortality rates of the lactic bacteria were higher in products inoculated with the R1 culture.
Key-words: starter, vegetables, Leuconostoc mesenteroides, lactic acid fer- mentation.
RÉSUMÉ
Un mélange de légumes composé de carottes, de choux, d’oignons et de sau- mure a été inoculé à la dose de 3×106UFC/g par des ferments constitués de Leuconostocs mesenteroides, lactobacillus plantarum et Pediococcus acidilac- tici. On a étudié l’effet de la proportion de ces trois souches dans le ferment sur la fermentation subséquente, la proportion variant d’un rapport 1/1/1 (fer- ment R1) à un rapport 5/1/1 (R5) ou 10/1/1 (R10), R5 et R10 contenant respec- tivement 5 fois et 10 fois plus de leuconostocs. Les légumes fermentés inoculés par R10 avaient un pH légèrement supérieur (de 0,04 unité pH) à celui
1. Fondation du conseil des gouverneurs du Centre de recherche et de développement sur les aliments, St-Hyacinthe, Québec, Canada.
2. Centre de recherche et de développement sur les aliments, 36000 bd Casavant Ouest, St-Hyacinthe, Québec, Canada, J2S8E3.
3. Faculté des Sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada.
* Correspondance
des légumes inoculés par R1 ; ils contenaient davantage d’acide acétique et moins d’acide lactique. Entre 8 et 30 jours de conservation à 4 °C, la mortalité des bactéries lactiques était la plus forte dans les produits inoculés par la cul- ture R1.
Mots clés : ferment, légume, Leuconostoc mesenteroides, fermentation lac- tique.
1 - INTRODUCTION
La fermentation lactique des végétaux comme le chou, spontanée lorsque les conditions de salage et de température sont adéquates (FLEMING et al., 1985), se caractérise par l’évolution des populations des différentes espèces bactériennes (PEDERSON, 1960 ; STAMER et al., 1971). Parmi les bactéries lac- tiques (BL) qui s’y retrouvent, Leuconostoc mesenteroides initie la fermentation (FLEMING, 1988 ; HARRIS, 1998) alors que Lactobacillus plantarum la termine généralement (FLEMINGet al., 1988).
Afin de mieux contrôler les fabrications industrielles, l’inoculation de fer- ments lactiques pour les légumes a été suggérée (BUCKENHUSKES, 1993). Avec des cultures pures, la fermentation s’avère parfois de qualité inférieure à une fermentation spontanée (FLEMING, 1988 ; HARRIS, 1998), mais certains essais avec des cultures mixtes ont donné des résultats plus encourageants (CHENet al., 1983). Bien que plusieurs auteurs fassent état de la succession de popula- tions de Ln. mesenteroides, Pediococcus acidilactici et Lb. plantarum pendant la fermentation spontanée de produits végétaux, aucun ferment renfermant ces trois espèces n’a été mis sur le marché à cette fin par les grands fournisseurs de cultures lactiques. C’est en partie pourquoi aucune donnée n’est disponible sur l’effet des proportions relatives de ces trois composantes bactériennes de l’inoculum dans le cadre de la fermentation des légumes.
La proportion entre les souches composant un ferment lactique est néan- moins un paramètre important qui conditionne son activité et les caractéris- tiques sensorielles et rhéologiques des aliments fermentés obtenus, tant chez les légumes (CHEN et al., 1983) que chez les produits laitiers (EFFENDI et al., 1992) ou céréaliers (GOBETTI, 1998).
Une culture lactique mixte composée en parts égales de Ln. mesenteroides, Pc. acidilactici et Lb. plantarum, formulée dans notre laboratoire, donne de bons résultats à l’échelle industrielle et est utilisée commercialement par Caldwell Bio- Fermentations Canada Inc. Nous ne savons cependant pas si la proportion de chaque souche est optimale. Puisqu’il est reconnu que Ln. mesenteroides a un rôle déterminant dans la fermentation des légumes (HARRIS, 1998), nous avons donc évalué l’effet de la proportion de cette espèce dans la composition d’une culture mixte sur la fermentation de légumes.
2 - MATÉRIELS ET MÉTHODES
2.1 Préparation des légumes
Trois lots de carottes tranchées additionnées de chou vert en lanière et d’oi- gnon ont été mélangés dans des proportions de 80 %, 15 % et 5 % respective- ment. Chaque lot contenait 3,06 kilogrammes de légumes, 940 mL d’eau de source, 19 g de sel de mer et la quantité requise de ferment pour atteindre 3×106UFC/g. Les légumes et le jus ont été placés dans des pots de verre de 1 litre à raison de 535 grammes de légumes et de 165 ml de jus. Les pots de fermentation avaient des couvercles munis d’une bonde contenant une solution chlorée (200 ppm) qui permettaient un échange gazeux unidirectionnel vers l’extérieur. Tous les pots de fermentation furent placés à 19 °C pendant 5 jours puis transférés à 4 °C pendant 55 jours.
2.2 Proportion du ferment
Le ferment mixte est composé de Lactobacillus plantarum NK 312 (Rosell, Montréal, Canada), Pediococcus acidilactici AFERM 772 (Quest, Montréal, Canada) et Leuconostoc mesenteroides BLAC (CRDA-Caldwell Bio Fermenta- tions Canada, Compton QC). Trois mélanges de souches furent testés. Le fer- ment mixte à proportions égales (R1) servait de témoin aux autres combinaisons constituées des mêmes souches mais renfermant proportionnel- lement 5 (R5) et 10 (R10) fois plus de Leuconostoc mesenteroides que des deux autres espèces (tableau 1). Les trois ferments (R1, R5, R10) furent ajoutés à un taux de 3×106CFU/g de mélange de légumes.
Tableau 1
Taux d’inoculation du mélange de légumes avec Leuconostoc mesenteroides BLAC, Lactobacillus plantarum NK 312 et Pediococcus acidilactici AFERM 772
Souches Traitements
R1a R5 R10
Ln. mesenteroides 1,0 ×106 b 2,2 ×106 2,5 ×106 Lb. plantarum 1,0 ×106 4,3 ×105 2,5 ×105 Pc. acidilactici 1,0 ×106 4,3 ×105 2,5 ×105 Totales 3,0 ×106 3,0 ×106 3,0 ×106
aR1 représente le ferment en proportion 1:1:1.
bNombre de bactéries viables en unités formant des colonies (UFC) / gramme de mélange de légume.
2.3 Analyses microbiologiques
Des échantillons de 5 mL ont été prélevés à différents temps de la période de fermentation. Afin d’éviter une entrée d’air, ce qui aurait modifié les proces- sus fermentaires, une pipette était insérée dans le pot et glissée le long de la paroi. Du liquide était prélevé aseptiquement et ré-injecté 5 fois, et ce à chaque
coin du pot. Ceci généra un liquide très trouble, et l’échantillon fut prélevé par la suite. Des essais préliminaires ont révélé que cette méthode donnait un portrait fiable de la population dans les légumes fermentés. Sur MRS X-Gal (MRS agar auquel était ajouté 50 µg/mL de 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galactopy- ranoside), les colonies de Lb. plantarum et de Ln. mesenteroides apparaissent bleues alors que les colonies de Pc. acidilactici sont blanches. Le milieu MSE (MAYEUX, 1962) permet de dénombrer sélectivement Ln. mesenteroides. Ce nombre soustrait du nombre total de colonies bleues sur MRS X-Gal permet de déterminer précisément le nombre de chacune des espèces.
2.4 Analyses chimiques
Les échantillons étaient filtrés sur membranes micro-poreuses de 0,45 µ. Le dosage des sucres et des acides s’effectua par HPLC : échantillonneur automa- tique 717 de Waters sur une colonne Aminex HPX 87H maintenue à 40 °C et couplée à une pré-colonne de garde de même type ; éluant composé d’acide sulfurique 0,008 N avec débit à 0,4 mL/min ; détecteur à indice de réfraction 410 de Waters à 40 °C.
2.5 Statistiques
Toutes les valeurs obtenues sont la moyenne de trois essais effectués en duplicata. Ainsi, deux contenants étaient préparés pour chaque traitement, et un échantillon prélevé dans chacun des pots. Les trois proportions de ferment ont été comparées avec un test de Dunnett (P < 0,05) à l’aide du logiciel Instat version 3.0.
3 - RÉSULTATS ET DISCUSSION
Puisque la culture R1 est devenue la culture de référence pour l’entreprise (Caldwell BioFermentations), celle-ci servit donc de témoin, plutôt que la fer- mentation spontanée, afin de déterminer l’effet des variations dans les propor- tions des souches.
3.1 Populations microbiennes
Pc. acidilactici démontra une faible croissance dans les fermentations de légumes conduites à des températures de 19 °C. Son dénombrement s’avéra imprécis avec la technique employée dans cette étude puisque sa population était largement inférieure à celle des lactobacilles. Nous ne présentons donc pas de données sur la flore de Pc. acidilactici dans les légumes fermentés, puisqu’elle constitue moins de 5 % de la flore totale. Bien que l’écart initial dans le nombre de Ln. mesenteroides dans les différents inoculums soit de 0,4 log à son addition, il devient non-significatif dès les premières 24 h (figure 1-A). Entre 3 et 7 jours, on observe une baisse notable de la population viable de Ln.
mesenteroides BLAC, alors que celle du lactobacille demeure stable. Ceci témoigne de l’acido-tolérance accrue des lactobacilles (MCDONALDet al., 1990).
Dans les deux cas, aucun effet de composition de l’inoculum sur la stabilité des bactéries n’a été détecté au cours de cette période de 3-7 jours. Entre 7 et 30 jours cependant, la population de Leuconostoc tend a diminuer moins rapi- dement dans les produits inoculés avec le mélange R10. Les mêmes observa- tions peuvent être faites quant au nombre de Lb. plantarum (figure 1-B).
3.2 Évolution du pH
Le mélange R10, acidifiait légèrement moins le milieu que les autres fer- ments. Ainsi, les produits R10 avaient des pH supérieurs à ceux de R1 de seu- lement 0,04 unité en moyenne. Il est probable que la teneur plus élevée en Lb.
Figure 1
Suivi de la population microbienne de Leuconostoc mesenteroides (A) et de Lactobacillus plantarum (B) durant la fermentation de la carotte inoculée
avec des ferments en proportions différentes. Incubation de 5 jours à 19 °C et entreposage à 4 °C par la suite. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type Afin d’alléger la figure, les barres d’erreur ne sont placées que sur une seule courbe.
plantarum du ferment R1 soit responsable de ce résultat, car les lactobacilles acidifient davantage le milieu que Ln. mesenteroides (FLEMING et al., 1988 ; MCDONALDet al., 1990). Reste à déterminer si les pertes de viabilité légèrement inférieures notées entre 7 et 30 jours dans les produits inoculés avec les fer- ments R10 seraient associées à un pH légèrement plus élevé. MROCEK DEL- CLOS(1991) a démontré un tel effet du pH, mais les écarts de pH étaient plus marqués. Nos résultats mettent néanmoins en évidence la nécessité d’avoir un facteur de 10 dans les variations en contenu du ferment pour obtenir des diffé- rences détectables dans le pH et la survie des cultures au cours de l’entrepo- sage.
Figure 2
Effet des différentes proportions des souches composant le ferment sur la consommation du glucose ainsi que sur la production d’acide lactique,
d’acide acétique et d’éthanol durant la fermentation du mélange de légumes à base de carottes
Chaque mesure obtenue par HPLC est la moyenne de trois essais en duplicatas. Les barres d’erreurs représentent la déviation standard. Afin d’alléger la figure, les barres d’erreur ne sont placées que sur une seule courbe.
3.3 Sucres et acides
Le ratio Ln. mesenteroides/Lb.plantarum influence le contenu en sucres et en acides de la même façon que l’effet observé sur le pH (figure 2). Le mélange R10 génère une consommation de glucose légèrement inférieure à celle du mélange R1 ; moins d’acide lactique est produit mais aucune différence n’est observée pour l’éthanol. Le mélange R10 génère d’autre part, une production d’acide acétique supérieure à celle du mélange R1 après 7 jours de fermenta- tion. Toutes ces différences sont toutefois faibles, et l’analyse statistique ne les considère pas comme étant significatives. Le ratio lactique/acétique est lui aussi influencé par la composition de l’inoculum. Les ratios passent de 2,37 à 2,03 et à 1,83 lorsqu’on favorise Ln. mesenteroides par rapport à Lb. plantarum pour les mélanges R1, R5 et R10, respectivement. L’évolution chimique des substrats et métabolites durant la fermentation s’inscrit dans le sens des inocu- lations. L’utilisation du ferment R10 favorise Ln. mesenteroides, et conséquem- ment une hétérofermentation. Il en résulte une plus faible consommation de sucres, une production accrue d’acide acétique, au détriment de l’acide lac- tique. Ainsi, bien que la composition du ferment ne génère pas de différences significatives dans les comptes viables dans les premiers jours de la fermenta- tion, de légères différences s’observent dans le pH et la chimie de la fermenta- tion. MROCEK DELCLOS (1991) a constaté cette même diminution du ratio lactique/acétique en favorisant la phase d’hétérofermentation.
Les dénombrements fongiques sur YM agar (pH 4,0) ont tous été négatifs pour un seuil de détection de 101 UFC/mL. Il semble donc que l’éthanol dans les échantillons soit issu uniquement de l’activité de Ln. mesenteroides BLAC plutôt que de celle des levures.
4 - CONCLUSION
Nos résultats révèlent que l’apport plus élevé de Leuconostoc mesente- roides dans l’inoculum génère des effets sur le pH, sur la composition en sucres et acides organiques des légumes fermentés, ainsi que sur la survie des micro- organismes au cours de l’entreposage. Reste à déterminer comment ces chan- gements influencent la conservation ou la saveur des produits, afin de sélectionner le mélange le plus approprié.
REMERCIEMENTS
Nous remercions Nancy GARDNER pour sa contribution scientifique et tech- nique, ainsi que Caldwell Bio Fermentations Canada pour sa contribution finan- cière.
Reçu le 21 février 2000, accepté le 30 août 2000.
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