Isolement et caractérisation de Geotrichum candidum pour la production
d’une polygalacturonase extracellulaire
ZINEB GUESSOUS1 *, M. OUHSSINE1, A. MOKHTARI2, M. FAID3 et M. EL YACHIOUI1 *
SUMMARY Isolation and characterisation of Geotrichum candidum for extracellular polygalacturonase production.
Fifty microorganisms including seven fungi and 43 bacteria were isolated from citrus fruit rot. The iodine test and enzyme activity assay showed pectinolytic activity in 38 of the selected micro-organisms, this activity being higher in yeasts. The two species that present the highest activity were identified as Candida guillermondii and Geotrichum candidum. Geotrichum candidum pro- duces an extracellular polygalacturonase that is active on pectin and on poly- galacturonic acid. The enzyme is strongly induced by these two substrates, and this induction is glucose-repressible. No activity is detectable during cul- ture with simple oses as the sole source of carbon. The biosynthesis of the enzyme is strongly inhibited by the presence of glucose in culture medium.
Maximum polygalacturonase activity (reducing-group-releasing activity) is as high as 2,150 µmole·L–1·min–1and is reached after 48 h of growth in a fermen- tor, at 30°C and pH 5, in the presence of polygalacturonic acid 7.5 g·L–1and an appropriate nitrogen source.
Key-words: polygalacturonase, pectinolytic activity, fermentation, induction.
RÉSUMÉ
Cinquante souches microbiennes sont isolées à partir d’agrumes putréfiés.
Elles se composent de sept champignons dont deux levures et 43 bactéries.
Le test à l’iode et la mesure de l’activité enzymatique ont mis en évidence une activité pectinolytique chez 38 souches sélectionnées. Deux espèces présen- tant la plus forte activité ont été identifiées, il s’agit de Candida guillermondii et de Geotrichum candidum. La souche Geotrichum candidum synthétise une
1 UFR d’agroressource, Laboratoire de biotechnologie microbienne, Département de biologie, Faculté des sciences, Kénitra, BP 133, Maroc.
2 Laboratoire de pharmacologie et de toxicologie, Unité de biochimie, Département de biologie, Faculté des sciences, Kénitra, BP 133, Maroc.
3 Laboratoire de microbiologie et biotechnologie, Institut agronomique et vététinaire Hassan II, Rabat, Maroc.
* Correspondance guessous@cnr.ac.ma
polygalacturonase extracellulaire active sur la pectine et l’acide polygalacturo- nique. L’enzyme est fortement induite par ces deux polymères, et cette induc- tion est réprimée par le glucose. Aucune activité n’est décelable pendant la culture sur les glucides simples. L’activité polygalacturonase maximale de 2 150 µmole·L–1·min–1est obtenue au bout de 48 heures de culture en fermen- teur, à 30 °C et à pH 5, en présence de 7,5 g·L–1d’acide polygalacturonique et de la source d’azote appropriée.
Mots-clés : polygalacturonase, activité pectinolytique, fermentation, induction.
1 - INTRODUCTION
L’isolement des souches susceptibles d’utiliser les pectines comme source de carbone et d’énergie est justifié non seulement en raison de l’intérêt écono- mique du substrat, de son produit d’hydrolyse et au niveau de sa production, mais aussi sur le plan fondamental car les pectinases qu’elles produisent sont peu étudiées.
Les substances pectiques sont des polysaccharides d’origine végétale, composés principalement d’unités acide galacturonique liées entre elles par des liaisons α(1 → 4). Les enzymes pectinolytiques dégradent ces composés et sont produites par de nombreux micro-organismes saprophytes et phytopa- thogènes (ROMBOUTSet PILNIK, 1980 ; FOGARTYet KELLY, 1983) ainsi que par les plantes (PRESSY, 1986 ; PRESSYet WOODS, 1992 ; DOPICOet al., 1993 ; ATKIN- SON et GARDNER, 1993 ; ATKINSON, 1994 ; KALAITSIS et al., 1995). Le pouvoir pectinolytique a été étudié chez divers bactéries et champignons phytopatho- gènes (COLLMERet KEEN, 1986 ; RODRIGUEZ-PALENZUELAet al., 1991 ; FLEGO et al., 1997). Ces enzymes sont classées selon leur spécificité vis-à-vis du substrat et du mécanisme d’action (REXOVA-BENKOVA et MARKOVIC, 1976). Les polyga- lacturonases (EC 3.2.1.15) et (EC 3.2.1.67) sont des hydrolases qui agissent préférentiellement sur les pectates plutôt que sur les pectines, libérant des mono ou oligosaccharides (REXOVA-BENKOVAet MARKOVIC, 1976).
Les enzymes pectinolytiques ont une valeur industrielle et sont utilisées par- ticulièrement dans l’industrie agroalimentaire (BARON et THIBAULT, 1985). Dans l’industrie des jus de fruits, le problème d’extraction, de filtration et de clarifica- tion posé par la pectine (PILNIKet ROMBOUTS, 1985) est généralement amélioré par l’utilisation des enzymes pectinolytiques (BROWNet OUGH, 1981 ; AGBO et SIMARD, 1992). Cependant, très peu de levures douées d’activité pectinolytique sont connues : Kluyveromyces marxianus (CAMPOS, 1993 ; BARNBYet al., 1990), Candida macedoniensis (CALL et al., 1985), Cryptococus albidus (FEDERICI, 1985), Geotrichum lactis (PARDO et al., 1991) et Saccharomycopsis fibuliger (FELLOWSet MORGAN, 1984).
Le présent travail a pour but l’isolement et la purification des souches pecti- nolytiques possédant une activité polygalacturonase extracellulaire. Les condi- tions optimales de croissance de Geotrichum candidum et de biosynthèse de l’enzyme sont recherchées.
2 - MATÉRIEL ET MÉTHODES
Milieu de culture
Nous avons utilisé un milieu semi-synthétique contenant l’acide pectique comme source de carbone, et par litre de milieu : (NH4)2SO41 g ; MgSO40,5 g ; KH2PO43 g ; extrait de levure 3 g et solution de micro-éléments (COONEY et LEVINE, 1972) 1 mL. Le milieu synthétique gélosé est obtenu par addition d’agar-agar 20 g·L–1. Les milieux sont stérilisés dans l’autoclave à 105 °C pen- dant 15 min.
Isolement et purification des souches
Des agrumes moisis sont prélevés au hasard dans différents marchés du Maroc. Cinq grammes de chaque fruit (plusieurs agrumes ont été étudiés) sont broyés de manière stérile dans 45 mL d’eau physiologique stérile. Les cultures sont réalisées à partir de la striation d’une goutte du broyat sur le milieu semi- synthétique gélosé à 30 °C pendant 24 à 72 h La pureté des souches est véri- fiée par un contrôle microscopique après quatre cycles successifs de repiquage en milieu liquide et étalement sur milieu gélosé.
Conservation des souches
Les souches pures sont conservées à 4 °C sur milieu P.D.A (Potato-Dex- trose-Agar) gélosé incliné en tubes. Un repiquage a lieu tous les mois.
Détection de la production de la polygalacturonase (CAMPOS, 1993)
Les souches pures sont ensemencées sur le milieu semi-synthétique gélosé contenant l’acide pectique 0,1 % comme source de carbone. Après 24 h d’in- cubation à 30 °C, une solution d’iode (2 %) est ajoutée à la surface des boîtes.
Les souches qui produisent la polygalacturonase présentent un halo autour de la colonie du fait de l’hydrolyse de l’acide pectique par l’enzyme. La taille des halos est proportionnelle à la quantité d’enzyme libérée dans le milieu.
Localisation de l’activité polygalacturonase
Les cultures sont arrêtées en fin de phase exponentielle de croissance.
Après centrifugation de la suspension cellulaire à 12 000 g pendant 20 min on obtient le milieu de culture (fraction I) et le culot contenant les cellules intactes (fraction II). Une partie des cellules est remise en suspension dans le tampon phosphate à pH 5 puis lysée par sonication. La lyse cellulaire est contrôlée au microscope. Une nouvelle centrifugation aboutit à la fraction soluble (fraction III) et la fraction insoluble (fraction IV). Le dosage de l’activité enzymatique est effectué sur chaque fraction.
Conditions de culture
Les études de croissance des différentes souches sont réalisées dans des erlenmeyers de 100 mL contenant 30 mL de milieu de culture. La source de car- bone est l’acide pectique 1 % (sauf indication). Les cellules sont maintenues en culture pendant 72 h sur un agitateur orbital (105 tours par min) dans un incuba-
teur. Toutes les cultures sont réalisées en double. La croissance cellulaire est déterminée par mesure de la turbidité à 600 nm.
L’influence du pH initial est étudiée sur milieu synthétique dont le pH a été ajusté avant stérilisation.
Influence de la source de carbone
Les cultures sont réalisées en présence des sucres suivants : acide pec- tique, pectine, glucose, lactose, fructose, maltose, galactose, saccharose, ara- binose et mannitol. Chaque sucre est utilisé comme seule source de carbone (sauf indication) à la concentration 3 %. L’incubation en série est réalisée à 30 °C pendant 72 h. Par ailleurs, l’influence de la concentration en source car- bonée est étudiée sur milieu semi-synthétique contenant l’acide pectique à dif- férentes concentrations : 0, 1, 2, 3, 5, 7,5 et 10 g·L–1. L’incubation en série est réalisée à 30 °C pendant 72 h.
Influence de la source d’azote
Un ensemble de substances azotées organiques et inorganiques sont tes- tées. Trois sources d’azote minéral sont étudiées : nitrique, ammoniacal et mixte. Les cultures sont réalisées à 30 °C et à pH 5 sur milieu semi-synthétique contenant l’acide pectique 7,5 g·L–1comme source de carbone.
Culture en fermenteur
Dans la cuve du fermenteur SETRIC (SET 002M) de capacité 2 litres, 1 350 mL de milieu de culture à pH 5 sont stérilisés par autoclavage à 105 °C pendant 15 min puis inoculés avec 150 mL de préculture. Pendant 72 h d’incu- bation, des échantillons sont prélevés toutes les heures pendant 8 h, puis toutes les 24 h pendant 72 h
Mesure de l’activité polygalacturonase
L’activité polygalacturonase est déterminée par dosage des sucres réduc- teurs par la méthode décrite par SOMOGYI(1952) et NELSON(1944). Les cultures sont arrêtées en fin de phase exponentielle puis centrifugées à 4 °C et à 12 200 g pendant 20 min. Le milieu réactionnel contient 0,1 mL du surnageant, 0,25 mL d’une solution substrat constituée d’acide pectique (Lancaster Synthe- sis) 5 % dans le tampon citrate-phosphate à pH 5 et 0,15 mL de tampon citrate également à pH 5. Le milieu est incubé dans un bain-marie à 40 °C pendant 15 min. La réaction est arrêtée par addition du réactif de Somogyi puis chauf- fage à 100 °C pendant 15 min ; 1 mL de réactif de Nelson est ajouté après refroidissement. La densité optique à 540 nm de chaque échantillon est lue en comparaison avec son témoin. La quantité de sucres réducteurs est déterminée par rapport à une courbe étalon d’acide galacturonique.
Dosage des sucres totaux (DUBOISet al., 1956)
Les sucres totaux sont dosés au phénol. L’absorbance est lue à 480 nm.
3 - RÉSULTATS ET DISCUSSION
3.1 Isolement et identification des souches
Cinquante souches sont sélectionnées à partir des cultures sur milieu semi- synthétique contenant l’acide pectique comme source de carbone. Ces micro- organismes se composent de 43 bactéries, 7 champignons dont 2 levures. Les souches pectinolytiques sont repérées dans le milieu gélosé contenant l’acide pectique comme seule source de carbone par addition d’une solution d’iode 2 %. La formation d’un halo autour des colonies traduit la présence d’enzyme extracellulaire. Deux souches présentant la plus forte activité enzymatique sont identifiées selon leurs caractères biochimiques en utilisant la galerie API 20C AUX (Biomérieux) dont le principe repose sur l’assimilation des sucres. Il s’agit d’une souche de Geotrichum candidum et une de Candida guillermondii.
3.2 Caractérisation de Geotrichum candidum
La production de polygalacruronase extracellulaire par Geotrichum candi- dum est étudiée en erlenmeyer sur milieu liquide agité. Le milieu contient l’acide pectique 1 % comme source de carbone et l’extrait de levure 3 g·L–1 et (NH4)2SO41 g·L–1comme source d’azote. Le pH initial du milieu avant stérilisa- tion est 5,7. La culture se déroule pendant 72 h à 30 °C. Cette expérience préli- minaire montre que dans ces conditions, l’activité polygalacturonase extracellulaire mesurée dans le milieu de culture est 880 µmole·L–1·min–1.
Tableau 1
Localisation de l’activité polygalacturonase Table 1
Polygalacturonase activity localization
Fractions enzymatiques Activité enzymatique (µmole·L–1·min–1)
Fraction I 950
Milieu de culture
Fraction II 0
Cellules intactes
Fraction IV 28 (3 %)
Cellules broyées : fraction insoluble
Fraction III 60 (7 %)
Cellules broyées : fraction soluble
Les cultures sont effectuées sous agitation rotative (105 tours/min) à 30 °C pendant 48 h sur milieu semi-synthétique contenant 1 g·L–1 d’acide polygalacturonique et 1 g·L–1de (NH4)2SO4.
Cultures were maintained in medium containing polygalacturonic acid 1 g·L–1 and (NH4)2SO4 1 g·L–1, on a rotary shaker (105 rotation/min) at 30°C for 48 h.
3.2.1 Localisation de l’activité polygalacturonase
Nous avons cherché à savoir si, en plus de l’activité extracellulaire, une autre activité, éventuellement plus importante, se retrouve à l’intérieur des cellules.
Après 48 h de culture, plusieurs fractions sont préparées selon le protocole décrit dans matériel et méthodes. Le tableau 1 montre que l’activité enzyma- tique se retrouve essentiellement dans le milieu de culture (fraction I). Aucune activité n’est détectée au niveau des cellules intactes (fraction II). Environ 3 % et 7 % de l’activité totale se retrouvent respectivement localisés au niveau de la fraction III et au niveau de la fraction soluble (fraction IV), ce qui suggère que la polygalacturonase de la souche retenue est essentiellement extracellulaire. La revue de la littérature montre que la polygalacturonase est également extracel- lulaire chez Saccharomyces cerevisiae (BLANCOet al., 1994), Geotrichum lactis (PARDO et al., 1991), Neurospora crassa (POLIZELI et al., 1991) et Sclerotinia borealis (TAKASAWA et al., 1997). Dans d’autres champignons cependant, la polygalacturonase est principalement localisée dans la fraction endocellulaire (KOPECNYet HODROVA, 1995).
Dans le but d’améliorer le rendement en enzyme, certains paramètres de culture de Geotrichum candidum ont été étudiés. En effet, chaque organisme a des conditions qui lui sont optimales, pour sa croissance d’abord et aussi pour la production de métabolites (HIROSEet al., 1999).
3.2.3 Effet du pH initial
La croissance de Geotrichum candidum à différents pH montre que l’activité enzymatique est augmentée à la valeur maximale de 1 120 µmole·L–1·min–1 à pH 5 et reste élevée jusqu’à pH 7, mais diminue de façon importante au-delà de ces deux valeurs limites (figure 1). Des valeurs de pH plus acides sont reportées pour la production de la polygalacturonase (FOGARTYet KELLY, 1983).
Il est à noter que les variations d’activité et de biomasse sont parallèles pour toutes les valeurs de pH étudiées. Ainsi, l’augmentation d’activité obtenue est liée exclusivement à l’accroissement de la biomasse.
3.2.4 Influence de la nature et de la concentration du substrat carboné
Nous avons étudié l’effet des glucides simples, de disaccharides et de poly- saccharides. Lorsque le milieu est dépourvu de substrat carboné, Geotrichum candidum se multiplie moyennement sans aucune activité polygalacturonase (tableau 2). Ainsi, l’extrait de levure qui constitue un apport vitaminique dans le milieu est sans effet sur l’apparition de l’activité enzymatique. En présence des sucres simples et des disaccharides, la croissance cellulaire s’effectue réguliè- rement, mais l’activité enzymatique est très faible ou quasi nulle. La culture sur l’acide pectique ou la pectine induit fortement la polygalacturonase, mais la croissance cellulaire est comparativement faible. Le glucose, mannitol ou fruc- tose qui permettent la meilleure croissance sont ajoutés séparément à l’acide pectique dans le but d’améliorer le rendement cellulaire. L’apparition de l’acti- vité polygalacturonase extracellulaire est alors réprimée. L’effet répressif est dose-dépendant en particulier, le glucose ou le mannitol 1 % annule totalement l’activité. Ces résultats suggèrent que la polygalacturonase de Geotrichum can- didum est une enzyme fortement induite par la pectine ou l’acide pectique, et son activité est sous répression catabolique du glucose et du mannitol en pré- sence de ses inducteurs. En terme de production, cette enzyme est similaire à
la polygalacturonase inductible produite par Fusarium monoliforme (DE LORENZO et al., 1987) ou par Cryptococcus albidus (FEDERICI, 1985) mais diffère de l’en- zyme constitutive produite par Saccharomyces fragilis (WIMBORNE et RICHARD, 1978). L’effet répressif du glucose a également été démontré sur les polygalac- turonases produites par Neurospora crassa ou Aspergillus niger (POLIZELIet al., 1991 ; MALDONADOet STRASSER DE SAAD, 1998).
Par ailleurs, l’effet de la concentration en acide polygalacturonique sur la croissance et l’apparition de l’activité enzymatique est étudié. Le tableau 3 montre que l’activité enzymatique s’accumule dans le milieu au cours de la croissance pour atteindre son maximum au bout de 48 h de culture. L’activité polygalacturonase maximale (1 920 µmole·L–1·min–1) est atteinte à la concentra- tion de 7,5 g·L–1en acide polygalacturonique. Comparativement, la polygalactu- ronase est produite par Geotrichum lactis à la concentration optimale de 5 g·L–1 (PARDOet al., 1991). Pour Neurospora crassa, Aspergillus niger ou Aspergillus ATHUP-3482 respectivement, des concentrations de 10, 15 et 30 g·L–1sont uti- lisées (POLIZELIet al., 1991 ; MALDONADO et STRASSER DE SAAD, 1998, GALIO- TOU-PANAYOTOUet al., 1997).
3.2.5 Influence de la source d’azote
Nous avons testé un ensemble de substances azotées organiques et inorga- niques. Trois sources d’azote minéral sont utilisées : nitrique, ammoniacal et mixte. La meilleure croissance et la production maximale de l’activité, 1 300 µmole·L–1·min–1, sont obtenues en présence du sulfate d’ammonium
Figure 1
Effet du pH initial sur la croissance et la biosynthèse de la polygalacturonase par Geotrichum candidum. Les cultures sont effectuées sous agitation rotative
(105 tours/min) à 30 °C pendant 48 h sur milieu semi-synthétique contenant 1 g·L–1d’acide polygalacturonique et 1 g·L–1de (NH4)2SO4
Initial pH effect on growth and polygalacturonase activity by Geotrichum candidum.
Cultures were maintained in medium containing polygalacturonic acid 1 g·L–1 and (NH4)2SO4 1 g·L–1, on a rotary shaker (105 rotation/min) at 30°C for 48 h
Activité (µmol·L–1·min–1) Biomasse (DO 600 nm)
(NH4)2SO4 (tableau 4). L’addition dans le milieu de peptone ou casaminoacide à la place de l’extrait de levure ne permet pas d’augmenter l’activité polygalactu- ronase.
3.2.6 Cinétique de croissance et de biosynthèse de la polygalacturonase en fermenteur
Les conditions optimales de croissance et d’apparition de l’activité enzyma- tique sont limitées en erlenmeyer du fait de la consommation des substrats et de l’accumulation des métabolites cellulaires. Pour cette raison, et également pour le contrôle de différents paramètres de culture, la cinétique de croissance de Geotrichum candidum et de production enzymatique est étudiée en fermen- teur, dans les conditions optimales de culture précédemment établies. Les résultats (figure 2) montrent que l’activité enzymatique est liée à la croissance cellulaire. Cette activité s’accumule progressivement dans le milieu et atteint la valeur maximale de 2 150 µmole·L–1·min–1 à la fin de la phase exponentielle (figure 2a). Parallèlement, l’acide polygalacturonique est progressivement
Tableau 2
Effet de la source de carbone sur la croissance cellulaire et l’activité polygalacturonase
Table 2
Effect of carbon source on cellular growth and polygalacturonase activity
Substrat Biomasse à 72 h Activité Activité
carboné (DO 600 nm) enzymatique sur enzymatique sur
acide pectique pectine (µmole·L–1·min–1) (µmole·L–1·min–1)
Aucun 0,71 0 –
Acide pectique 2,50 866 157
Pectine 1,40 148 –
Glucose 4,40 28 –
Lactose 1,40 8 –
Fructose 4,90 0 –
Maltose 1,80 28 –
Saccharose 0,80 28 –
Arabinose 1,30 8 –
Mannitol 4,50 38 –
Acide pectique + glucose 0,1 % 2,00 28 –
Acide pectique + glucose 1 % 2,50 0 –
Acide pectique + fructose 0,1 % 2,00 168 –
Acide pectique + fructose 1 % 2,90 127 –
Acide pectique + mannitol 0,1 % 1,50 14 –
Acide pectique + mannitol 1 % 2,10 0 –
Les cultures sont réalisées dans des erlenmeyers contenant 30 mL de milieu synthétique en présence des différents sucres (0,1 %, sauf indication), de 1 g·L–1de (NH4)2SO4, sous agitation rotative (105 tours/min) à 30 °C et à pH initial 5.
Cultures were performed in erlenmeyer flasks containing 30 mL of culture medium in the presence of different sugars (0.1%, except when mentioned) and of (NH4)2SO4 1 g·L–1, under rotative agitation (105 rotation/min) at 30°C and initial pH 5.
Tableau 3
Effet de la concentration en acide polygalacturonique sur la croissance cellulaire et la biosynthèse de l’enzyme
Table 3
Effect of polygalacturonic acid concentration on cellular growth and polygalacturonase biosynthesis
Acide pectique Biomasse Activité
(g·L–1) (DO 600 nm) (µmole·L–1·min–1)
8 h 24 h 48 h 8 h 24 h 48 h
0 0,09 0,95 0,90 0 0 0
1 0,9 1,8 2 187 267 294
2 1,1 1,9 2,5 280 267 312
3 1,2 2,2 3,2 327 327 400
5 2,2 3,6 3,9 746 1 065 1 500
7,5 2,3 4 5 106 1 364 1 920
10 2,3 4,2 5 646 1 244 1 900
Les cultures sont réalisées dans des erlenmeyers contenant 30 mL de milieu semi-synthétique en présence de différentes concentrations d’acide pectique et de 1 g·L–1de (NH4)2SO4, sous agitation rotative (105 tours/min) à 30 °C et à pH initial 5.
Cultures were performed in erlenmeyers containing 30 mL of culture medium in the presence of dif- ferent concentrations of pectic acid and of (NH4)2SO4 1 g·L–1, under rotative agitation (105 rota- tion/min) at 30°C and initial pH 5.
Tableau 4
Effet de la source azotée sur la croissance cellulaire et la biosynthèse de l’enzyme Table 4
Effect of nitrogen source on cellular growth and polygalacturonase biosynthesis Source d’azote Biomasse (DO 600 nm) Activité enzymatique
(µmole·L–1·min–1)
(NH4)2SO4 2,48 1 900
(NH4)2HPO4 2,00 959
NH4NO3 2,20 1 537
NaNO3 1,80 978
(NH4)2SO4+ peptone 2,10 1 236
(NH4)2SO4+ casaminoacide 2,20 1 375
Les cultures sont réalisées dans des erlenmeyers contenant 30 mL de milieu semi-synthétique en présence d’acide pectique 1 g·L–1 et de l’extrait de levure 3 g·L–1, sous agitation rotative (105 tours/min) à 30 °C et à pH initial 5. Les différentes substances minérales sont incorporées dans le milieu de manière à obtenir une concentration en azote de 0,33 g·L–1. Peptone ou casaminoacide 3 g·L–1 sont ajoutés en absence de l’extrait de levure.
Cultures were performed in erlenmeyer flasks containing 30 mL of culture medium in the presence of pectic acid 1 g·L–1 and of yeast extract 3 g·L–1, under rotative agitation (105 rotation/min) at 30°C and initial pH 5. The different mineral nitrogen sources were added to acheive a final nitrogen concentration of 0.33 g·L–1. Peptone or casaminoacid 3 g·L–1 are present instead of yeast extract.
dégradé dans le milieu pendant la croissance. Son hydrolyse est plus intense pendant la phase logarithmique où plus de 80 % est utilisé (figure 2b). Les rési- dus galacturoniques issus de cette dégradation ne s’accumulent pas dans le milieu : ils sont utilisés par les cellules après leur libération. La quantité d’oxy- gène dissout diminue progressivement tout au long de la fermentation, et parti- culièrement pendant la phase exponentielle (figure 2b). Cette consommation accrue est liée à la croissance cellulaire intense. La biosynthèse de l’enzyme n’est pas inhibée par l’oxygène dissout dans le milieu contrairement à la poly- galacturonase de Saccharomyces fragilis qui est réprimée par l’oxygène (WIM- BORNEet RICHARD, 1978).
Figure 2
Culture en fermenteur de Geotrichum candidum à 30 °C et à pH initial 5, dans un milieu semi-synthétique contenant 7,5 g·L–1d’acide polygalacturonique (AP)
et 1 g·L–1de (NH4)2SO4, sous agitation rotative (105 tours/min)
Culture of Geotrichum candidum in fermentor, at 30°C and initial pH 5, in medium containing polygalacturonic acid (AP) 7.5 g·L–1 and (NH4)2SO4 1 g·L–1, using a
rotative shaker (105 rotations/min)
Activité (µmol·L–1·min–1)
Biomasse (DO 600 nm)AP résiduel (%) O2dissout (%)
4 - CONCLUSION
Parmi les 50 micro-organismes isolés et se développant sur les pectines comme source de carbone, la souche Geotrichum candidum est sélectionnée comme la plus performante. Bien que notre choix se soit porté sur cette souche, nous rappelons l’intérêt des autres souches qui font l’objet d’une caractérisation complémentaire en cours. L’optimisation des paramètres de croissance de Geotrichum candidum a permis d’augmenter l’activité polygalac- turonase à des valeurs satisfaisantes (2 150 µmole·L–1·min–1) comparables à celles retrouvées chez d’autres souches microbiennes. Les essais de produc- tion de l’enzyme en fermenteur montrent que cette approche est prometteuse pour une production industrielle.
La présence d’enzyme polygalacturonase à forte activité chez Geotrichum candidum pourrait trouver des applications dans la biotechnologie alimentaire.
En effet, les jus des fruits riches en substances pectiques doivent être dépecti- nisés avant l’étape finale de mise sur le marché.
Reçu le 24 août 1999, révisé le 15 février 2000, accepté le 14 mars 2000.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
AGBO N’ZI G., SIMARD R.E., 1992. Charac- teristics of juice from palmyarah palm (Boras- sus) fruit. Plant Food Hum. Nutr., 42, 55-70.
ATKINSON R.G., GARDNER R.C., 1993. A polygalacturonase gene from kiwifruit (Actini- dia deliciosa). Plant Physiol., 103, 669-670.
ATKINSON R.G., 1994. A cDNA clone for endopolygalacturonase from apple. Plant Physiol., 105,1437-1438.
BARNBY F.M., MORPETH F.F., PYLE D.L., 1990. Endopolygalacturonase production from Kluyveromyces marxianus. Enzyme Microbiol. Technol., 12, 891-897.
BARON A., THIBAULT J.F., 1985. Les enzymes pectinolytiques. In : MOURANCHE A., COSTES C. (ed.), Hydrolases et polymérases, enzymes d’intérêt industriel, Bordas, Paris, 143-164.
BLANCO C., SIEIRO C.A., DIAZ A., VILLA T.G., 1994. Production and partial characteri- zation of an endopolygalacturonase from Saccharomyces cervisiae. Can. J. Microbiol., 40, 974- 977.
BROWN M.R., OUGH C.S., 1981. A compari- son of activity and effects of two commercial pectic enzyme preparations on white grape musts and wines. Am. J. Vitic. Enol., 32, 272- 276.
CALL H.P., WALTER J., EMEIS C.C., 1985.
Maceration activity of an endopolygalacturo- nase from Candida macedoniensis. J. Food Biochem., 9, 325-348.
CAMPOS D., 1993. Contribution à l’étude de la production et de la caractérisation de la polyga- lacturonase de Kluyveromyces marxianus et de son mutant KF28. Thèse de doctorat, Faculté des sciences agronomiques, Gembloux.
COLLMER A., KEEN N.T., 1986. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis. Annu.
Rev. Phytopathol., 24, 383-409.
COONEY V.L., LEVINE D.W., 1972. Microbial utilization of methanol. Adv. Appl. Microbiol., 15,337-365.
DE LORENZO G., SALVI G., DEGRA R., D’OVIDIO R., CERVONE F., 1987. Induction
of extracellular polygalacturonase and its mRNA in the pathogenic fungus Fusarium monoliforme. J. Gen. Microbiol., 133, 3365- 3373.
DOPICO B., LOWE A.L., WILSON I.D., MERODIO C., GRIERSON D., 1993. Cloning and characterization of avocado fruit mRNAs and their expression during ripening and low- temperature storage. Plant Mol. Biol., 21, 437-449.
DUBOIS M., GILLES K.A., HAPILTON J.K., REBERS A.P., SMITH F., 1956. Coloric method for determination of the sugar related substances. Anal. Chem., 28, 350-356.
FELLOWS P.J., MORGAN J.T., 1984. An investigation into the pectolytic activity of yeast Saccharomycopsis fibuliger. Enzyme Microbiol. Technol., 6, 405-410.
FLEGO D., PIHRONEN M., SAARILAHTI H., PALVA T.K., PALVA E.T., 1997. Control of virulence gene expression by plant calcium in the phytopathogen Erwinia carotovora. Mol.
Microbiol., 25, 831-838.
FOGARTY W.M., KELLY C.T., 1983. Pectic enzymes. In: FOGARTY W.M (ed.), Microbial enzymes and biotechnology, Applied Science Publishers, London, 131-182.
FEDERICI F., 1985. Production, purification and partial characterization of an endopoly- galacturonase from Cryptococcus albidus var. Albidus. Antonie van Leeuwenhoek, 51, 139-150.
GALIOTOU-PANAYOTOU M., KAPANTAI M., KALANTZI O., 1997. Growth conditions of Aspergillus sp. ATHUM-3482 for polygalactu- ronase production. Appl. Microbiol. Biotech- nol., 47, 425-429.
HIROSE N., KISHIDA M., KAWASAKI H., SAKAI T., 1999. Purification and caracteriza- tion of an endo-polygalacturonase from a mutant of Saccharomyces cerevisiae. Biosci.
Biotechnol. Biochem., 63, 1100-1103.
KALAITZIS P., KOEHLER S.M., TUCKER M.L., 1995. Cloning of a tomato polygalactu- ronase expressed in abscission. Plant Mol.
Biol., 28, 647-656.
KOPECNY J., HODROVA B., 1995. Pectinoly- tic enzymes of anaerobic fungi. Lett. Appl.
Microbiol., 20, 312-316.
MALDONADO M.C., STRASSER DE SAAD A.M., 1998. Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in
submerged and solid state systems. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol., 20, 34-38.
NELSON N.J., 1944. A photometric adapta- tion of the Somogyi method of determination.
J. Biol. Chem., 153, 375-380.
PARDO C., LAPENA M.A., GACTO M., 1991.
Purification and characterization of an extra- cellular polygalacturonase from Geotrichum candidum. Can. J. Microbiol., 37, 974-977.
PILNIK W., ROMBOUTS F.M., 1985. Polysac- charides and food processing. Carbohydr.
Res., 142, 93-105.
POLIZELI M.L.T.M., JORGE J.A., TERENZI H.F., 1991. Pectinase production by Neuro- spora crassa : purification and biochemical characterization of extracellular polygalactu- ronase activity. J. Gen. Microbiol., 137, 1815- 1823.
PRESSY R., 1986. Polygalacturonase in higher plants, In: FISHMAN M., JEN J.J., (ed.), ACS symposium series 310, chemistry and function of pectins, American Chemical Society, Washington D.C., 157-174.
PRESSY R., WOODS F.M., 1992. Purification and properties of two pectinesterases from tomatoes. Phytochemistry, 31, 1139-1142.
REXOVA-BENKOVA L., MARKOVIC O., 1976.
Pectic enzymes In: TIPSON R.S., HORTON D., (ed.), Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry, Academic Press, New York, 323-385.
RODRIGUEZ-PALENZUELA P., BURR T.J., COLLMER A., 1991. Polygalacturonase is a virulence factor in Agrobacterium tumefa- ciens biovar 3. J. Bacteriol., 173, 6547-6552.
ROMBOUTS F.M., PILNIK W., 1980. Pectic enzymes. In: ROSE A.H., (ed.), Economic microbiology, 227-282, Academic Press, London.
SOMOGYI M., 1952. Notes on sugar determi- nation. J. Biol. Chem., 195, 19-23.
TAKASAWA T., SAGISAKA K., YAGI K., UCHIYAMA K., AOKI A., TAKAOKA K., YAMAMATO K., 1997. Polygalacturonase isolated from the culture of the psychrophilic fungus Sclerotinia borealis. Can. J. Micro- biol., 43, 417-424.
WIMBORNE M.P., RICHARD P.A.D., 1978.
Pectinolytic activity of Saccharomyces fragilis cultured in controlled environments. Biotech- nol. Bioeng., 20, 231-242.
