Article pp.259-282 du Vol.27 n°4-5 (2007)

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L’ALIMENTATION ET LA VIE FOOD AND LIFE

Revue : Comment évaluer l’efficacité des antioxydants alimentaires ?

Marie-Elisabeth Cuvelier et Marie-Noëlle Maillard

AgroParisTech – Département Science et Procédés des Aliments et des Bioproduits (SPAB) – UMR 1211 (Agroparistech-Cnam-Inra) – 1, avenue des Olympiades – 91744 Massy cedex – France – marie-elisa- [email protected]

SUMMARY

How is evaluated the activity of food antioxidants?

The efficiency of antioxidants in protecting foods against oxidative degrada- tion depends on many factors, among them the nature and action mode of antioxidants, the structure of food and the storage conditions. This review first reminds the factors inducing oxidation and the main antioxidant mechanisms ; then most of protocols used to measure the antioxidant activity are described. The direct methods use different lipid substrates as fatty acids, triacylglycerols, liposomes, LDL and also lipophilic microconstituents like carotenoids or conjugated fatty acids. Antiradical methods as DPPH°, TEAC or ORAC assays measure the ability of antioxidants to scavenge free radicals, while the FRAP assay measures the ferric reducing power of antioxidant.

Among the wild range of methods, none of them gives a true protective effect of antioxidants in real foods. Nevertheless, we can propose some

Dans chaque numéro, cette rubrique met en avant un article traitant d’un des aspects de la nutrition, du rôle des technologies agroalimentaires sur la qualité des aliments jusqu’à la

« cuisine », en passant par les problèmes nutritionnels, la toxicologie alimentaire, et plus générale- ment les conséquences sur la santé des pratiques alimentaires. Les articles retenus sont soit des travaux de synthèse de haut niveau faisant le point sur une question, soit des publications origina- les rendant compte de travaux de recherche appliquée récents apportant un regard nouveau.

La Société scientifique d’hygiène alimentaire (SSHA), société savante créée en 1904 pour contri- buer à la diffusion des connaissances en nutrition et sécurité sanitaire, est aujourd’hui formée de deux départements : l’Institut supérieur de l’alimentation (ISA) développe des actions de formation, d’information et de conseil ; l’Institut scientifique d’hygiène et d’analyse (ISHA) propose un catalogue complet d’analyses (composants nutritionnels, contaminants, analyse sensorielle, microbiologie…).

Les propositions d’articles, remarques et suggestions peuvent être envoyées à : Claude Bourgeois

SSHA

Rue du Chemin-Blanc, BP 138, Champlan F-91163 Longjumeau cedex Tél. : + 33 (0)1 69 79 31 50

Fax : + 33 (0)1 64 48 82 49 http://www.ssha.asso.fr [email protected]

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recommendations in screening and evaluating antioxidants, according to the targets of protection.

Keywords

lipid oxidation, antioxidant activity, model-systems, antiradical capacity, reducing power.

RÉSUMÉ

L’activité des antioxydants alimentaires dépend d’une multitude de facteurs liés à la fois à la nature même des antioxydants et à leur mode d’action, et à la nature du milieu à protéger et des conditions de conservation. Après quelques rappels sur le mécanisme d’action des antioxydants et les facteurs qui induisent l’oxydation, cette revue présente les principaux tests en systèmes modèles utilisés pour évaluer l’efficacité des antioxydants. Les tests directs sont effectués sur des substrats lipidiques : acides gras, triglycérides, corps lipidiques tels liposomes ou LDL, et microconstituants lipophiles tels que des caroténoïdes ou des acides gras conjugués. Certains tests n’utilisent aucun substrat lipidique : c’est le cas des tests DPPH°, TEAC ou ORAC, qui mesurent la capacité des antioxydants à réduire des radicaux synthétiques, ou encore le test FRAP qui mesure la réduction d’ions métalliques. De l’ensemble des tests présentés, il ressort une très grande variété dans les conditions mises en œuvre et les mécanismes impliqués, et une idée géné- rale qu’aucun test n’est idéal. Les limites de ces systèmes modèles sont évoquées et quelques pistes sont apportées dans le choix du test le mieux adapté à l’objectif poursuivi.

Mots clés

oxydation lipidique, systèmes-modèles, activité antioxydante, pouvoir antira- dicalaire, pouvoir réducteur.

1 – INTRODUCTION

L’oxydation des acides gras insaturés contenus dans les lipides se déclen- che naturellement ou sous l’action d’enzymes, de chaleur, de lumière ou de traces d’ions métalliques. Il s’agit d’un mécanisme radicalaire où les radicaux libres formés jouent eux-mêmes le rôle d’initiateurs et de propagateurs des oxydations suivantes, de telle manière que la dégradation des huiles et des graisses apparaît comme une réaction en chaîne, autocatalytique et irréversible (figure 1).

La première étape correspond à la formation d’hydroperoxydes (ROOH), produits par trois voies différentes (photooxydation, oxydation enzymatique ou autooxydation). Les hydroperoxydes sont des molécules instables notamment à température élevée ou en présence d’ions métalliques, qui vont se décomposer en nouveaux radicaux lipidiques RO° et ROO°. Diverses réactions de ces

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radicaux auront pour première conséquence l’apparition de produits volatils responsables de l’odeur désagréable de rance et de composés non volatils cycliques ou polymérisés. Mais les radicaux peuvent aussi avoir pour cibles des vitamines, pigments, protéines, aboutissant alors progressivement à une dégra- dation de la valeur nutritionnelle, de la couleur et de la texture. L’ensemble de cette cascade de réactions a pour résultat une réduction significative de la qua- lité nutritionnelle et sensorielle des aliments.

L’ajout d’antioxydants, qu’ils soient synthétiques (additifs tels que BHT, BHA, TBHQ) ou naturels (tocophérols, acide ascorbique, composés phénoli- ques ou extraits végétaux), est souvent indispensable quand les mesures pré- ventives (suppression de l’oxygène, des métaux ou des enzymes, réfrigération, protection contre la lumière) ne sont pas possibles ou insuffisantes (Cuvelier et Martel, 2008). Les modes d’action des antioxydants sont multiples selon qu’ils agissent préventivement sur les inducteurs de l’oxydation ou directement en réduisant les radicaux lipidiques.

Mesurer et prévoir l’efficacité d’un antioxydant pour protéger un aliment revient idéalement à le mettre en œuvre dans l’aliment et à en mesurer les effets sur l’état d’oxydation de l’aliment conservé dans les conditions habituelles. Il est évident qu’une telle approche, même si elle permet une estimation réelle de l’efficacité de l’antioxydant, est incompatible avec l’anticipation nécessaire en industrie, notamment en recherche-développement. Une solution serait de pla- cer l’antioxydant dans les conditions d’oxydation accélérée qui sont utilisées pour mesurer la résistance des aliments ou des huiles à l’oxydation (Berset et Cuvelier, 1996, Frankel, 2005). Mais dans ce cas, il est préconisé de ne pas dépasser une température de 60 °C pour ne pas risquer de générer des réac- tions thermiques exagérées ou de dégrader l’antioxydant (Frankel, 2005). Prati- qués sur les aliments à protéger et dans ces conditions modérées, de tels tests ont l’avantage de donner une réponse plus fiable et plus rapide de l’efficacité de l’antioxydant, même si la durée approche souvent quand même quelques

lipoxygénase

température PHOTO - OXYDATION

H

métaux hν

R’°

R°

R'H RH ROO°

sens* sens

1O2 RH

RH

ROOH

AUTO-OXYDATION YDATION

ZYMATIQUE

température

OH°

RO°

ROO°

métaux O2

O2

O₂ h hνννννννν

scission remaniement

cooxydation de protéines

vitamines pigments Produits d’oxydation (volatils et non volatils) PHOTO -

OXYDATION

AUTO-OXYDATION DATION

ZYMATIQUE

h

hνννννννν PHOTO - OXYDATION

AUTO-OXYDATION AUTO-OXYDATION OXYDATION

ZYMATIQUE

hνν

Figure 1

Représentation schématique du mécanisme d’oxydation des lipides insaturés (notés RH).

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semaines ; la prédiction en conditions normales reste néanmoins problémati- que. Parallèlement, des tests en systèmes modèles se sont développés pour permettre une évaluation rapide des antioxydants, nécessaire par exemple dans le cas de la sélection d’un extrait ou de la mise en place d’une formulation. À cet avantage du gain de temps, il faut ajouter que la simplification des milieux et le contrôle des conditions mises en œuvre permettent aussi d’étudier les mécanismes d’action et la réactivité des composés antioxydants. A contrario, la multiplicité des tests utilisés et la variabilité de leurs conditions rend difficile la comparaison des antioxydants et impossible l’établissement d’une valeur absolue de l’efficacité. Chaque réponse, propre au test utilisé, sera à considérer comme une indication de l’efficacité, et se pose bien sûr ici encore la question de l’extrapolation aux conditions réelles.

L’objectif de cette revue est de dresser un inventaire des principaux tests en systèmes modèles permettant d’évaluer l’efficacité antioxydante de composés purs ou d’extraits, que ce soit à des fins de protection des aliments contre la perte de leur qualité ou de protection de l’organisme contre le stress oxydant.

Bien sûr, pour pouvoir affirmer le rôle physiologique d’antioxydants apportés par notre alimentation, l’utilisation de tels tests n’est pas suffisante : il sera non seulement indispensable d’évaluer la biodisponibilité des antioxydants (absorp- tion, métabolisation), mais également d’appréhender leur activité physiologique à l’aide de tests biologiques (Prior et Cao, 1999, Kroon et al., 2004, MacDonald- Wicks et al., 2006, Wood et al., 2006). Pour les aspects biologiques et patholo- giques liés au stress oxydant et au rôle des antioxydants, on pourra se référer à l’ouvrage de Delattre et al. (2005). De même, sont exclus de cette revue les tests permettant de mesurer le pouvoir inhibiteur d’enzymes telle que les poly- phénoloxydases ou les peroxydases impliquées dans les mécanismes d’oxydation de matériels biologiques (Marquès et al., 2006).

La liste des tests présentés ici n’est pas exhaustive, mais elle reprend les tests les plus couramment utilisés (Frankel et Meyer, 2000, Sanchez-Moreno, 2002, Huang et al., 2005, Roginsky et Lissi, 2005, Laguerre et al., 2007). Nous avons fait le choix de les classer en fonction des conditions de milieu mises en œuvre, notamment de la nature des substrats impliqués, et de réunir dans un chapitre à part les tests indirects n’utilisant pas de substrats lipidiques mais permettant de mesurer un pouvoir réducteur.

Auparavant, pour aider à la compréhension de ces tests, un chapitre général rappelle les modes d’action des antioxydants et présente les facteurs d’induction de l’oxydation utilisés dans les tests.

2 – MODES D’ACTION DES ANTIOXYDANTS ET FACTEURS INDUCTEURS DE L’OXYDATION

2.1 Modes d’action des antioxydants

Les antioxydants ont pour effet de bloquer ou de ralentir les réactions d’oxydation ; ils sont classés en deux groupes selon leur mode d’action.

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Les antioxydants primaires, encore appelés antiradicalaires, sont efficaces dans les phases d’initiation et de propagation de l’oxydation. En effet, l’oxydation des lipides insaturés met en œuvre diverses formes radicalaires des lipides R°, ROO° et RO° (figure 1).

Les antioxydants primaires (notés AH) agissent sur ces radicaux en leur cédant un hydrogène :

R• + AH RH + A•

ROO• + AH ROOH + A•

RO• + AH ROH + A•

Ils deviennent de ce fait eux-mêmes de nature radicalaire (A°) mais à la diffé- rence des radicaux lipidiques, ils sont plus stables donc peu réactifs et cela aura pour conséquence une rupture de la chaîne de réactions. Les radicaux A°

vont en effet former un dimère A-A ou réagir avec un radical lipidique pour former ROOA ou ROA. L’effet de blocage ou de ralentissement reste néanmoins provisoire, le temps de consommer les antioxydants présents.

Les antioxydants de type antiradicalaire les plus répandus sont de nature phénolique, la stabilisation du radical A° étant accrue grâce à la délocalisation des électrons du cycle aromatique (figure 2).

L’efficacité des composés antiradicalaires dépend d’un grand nombre de facteurs (Frankel, 2007) :

– la structure de l’antioxydant, dont le nombre de groupements phénoliques OH mais aussi la nature des substituants greffés sur le cycle aromatique ; – la nature et la composition de la matrice (émulsion, nature de

l’émulsifiant) ;

– les interactions avec d’autres constituants tels que les protéines ; – les conditions d’oxydation (pH, présence d’ions métalliques) ;

– la quantité d’hydroperoxydes initialement présents qui risquent de rendre les antioxydants inefficaces.

°

° A°

RH R°

O °

O

AH O H

Figure 2

Mécanisme d’action d’un antioxydant phénolique (RH = acides gras / lipides insaturés).

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L’efficacité d’un composé phénolique ne se limite pas toujours à sa forme initiale car le radical formé A° peut, par un jeu de délocalisation des électrons, révéler d’autres H labiles et réduire d’autres radicaux lipidiques.

L’activité de ces composés antioxydants peut aussi être prolongée par la présence de composés régénérants, ce qui va produire un effet de synergie.

C’est le cas bien connu du couple α-tocophérol/acide ascorbique.

Le deuxième groupe d’antioxydants comprend les antioxydants dits

« secondaires », encore appelés antioxydants préventifs. Ils vont intervenir au niveau des facteurs favorisant les réactions d’inititation de l’oxydation selon dif- férents mécanismes :

– en chélatant les ions métalliques notamment de fer ou de cuivre qui sont particulièrement actifs vis-à-vis des hydroperoxydes pour former de nouveaux radicaux. L’emploi de ces agents complexants (acide citrique ou EDTA par exemple) est néanmoins délicat car ils ont parfois un effet con- traire à celui attendu ;

– en piégeant l’oxygène (acide ascorbique ou palmitate d’ascorbyle par exemple) ou en désactivant l’oxygène singulet formé sous l’effet de la lumière (caroténoïdes par exemple) ;

– en absorbant les radiations lumineuses ;

– en réagissant avec les radicaux formés par décomposition des hydroperoxydes ;

– ou encore en inhibant les enzymes catalysant les réactions d’oxydation.

Il faut noter que certains antioxydants peuvent agir selon plusieurs mécanismes ; c’est le cas de l’acide ascorbique à la fois réducteur d’oxygène et réducteur de radicaux, ou de plusieurs flavonoïdes et acides ortho-diphénoli- ques qui sont à la fois antiradicalaires et chélateurs d’ions métalliques (figure 3).

Les tests de mesure du pouvoir antioxydant ne permettent pas toujours d’évaluer séparément l’un ou l’autre de ces modes d’action car d’une part, un composé peut agir selon plusieurs modes et d’autre part, les conditions mises en œuvre ne permettent pas forcément la maîtrise des réactants (présence d’oxygène et d’hydroperoxydes, contamination par des métaux par exemple).

O OH

HO

OH O

OH

Mⁿ⁺

Figure 3

Chélation des cations métalliques (Mⁿ⁺) par une flavanone.

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2.2 Facteurs inducteurs de l’oxydation

Les facteurs qui vont permettre d’accélérer l’oxydation dans les tests sont d’abord logiquement ceux qui sont connus pour induire naturellement les mécanismes d’oxydation des lipides, à savoir la chaleur et les ions métalliques.

À ceux-là s’ajoutent des agents artificiels tels que les azo-initiateurs qui agissent sous forme de radicaux peroxyles.

La chaleur est un facteur qui accélère la vitesse de toutes les réactions d’oxydation (figure 1). L’idéal est néanmoins d’appliquer des températures infé- rieures à 60 °C pour rester dans des conditions le plus proches possibles des conditions réelles. En effet, au-delà de 60 °C, les hydroperoxydes se décompo- sent rapidement et à des températures plus élevées encore, il se produit des réactions de polymérisation et de cyclisation des lipides qui n’ont pas lieu à température plus basse, avec en plus une solubilité moindre de l’oxygène et un risque de volatilisation ou de dégradation thermique des antioxydants (Frankel, 2005).

Les ions de métaux de transition, principalement fer et cuivre, sont des fac- teurs majeurs d’induction de l’oxydation, notamment en milieux émulsionnés, et sont préconisés dans les tests à température modérée. Ils agissent essentiellement sur les hydroperoxydes pour générer des radicaux lipidiques :

ROOH + Fe II RO° + OH^– + Fe III ROOH + Fe III ROO° + H⁺ + Fe II

La forme de fer ferreux (II) est beaucoup plus active comme prooxydant et on voit avec ces deux réactions en boucle qu’une trace d’ions suffit pour induire une forte accélération de l’oxydation.

Les ions fer peuvent être apportés directement ou par des intermédiaires, par exemple l’hémoglobine ou des systèmes enzymatiques.

Les radicaux synthétiques appelés azo-initiateurs sont utilisés dans plu- sieurs tests. Ils dérivent tous d’une même structure azobis générique R-N=N-R, mais avec des polarités différentes, ce qui permet un choix adapté aux conditions des tests, que ce soit l’AAPH (2.2’-azobis[2-methylpropionamide]dihydrochloride) appelé aussi ABAP, l’AIPH (2.2’-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride (appelé aussi ABIP), l’AMVN (2.2’-azobis[2,4-dimethylvaleronitrile) ou l’AIBN (2.2’-azobisisobutyronitrile) (Laguerre et al., 2007).

La première réaction est une coupure spontanée du composé azobis qui aboutit à N₂ + 2 R°. Ces radicaux R° réagissent immédiatement avec l’oxygène pour générer des radicaux peroxyles ROO°. Ceux-ci vont ensuite jouer le rôle d’initiation et de propagation de la réaction d’oxydation sur les lipides insaturés utilisés dans le test (acides gras libres, triglycérides, liposomes, LDL) par le mécanisme de l’autooxydation décrit à la figure 1.

Le comportement de ces azo-initiateurs est variable d’un composé à l’autre car il est très dépendant de la température, du pH et de la présence de solvant dans le milieu. Ceci a pour conséquence des résultats contradictoires sur l’effi- cacité d’antioxydants parfois relevés dans la littérature (Frankel et Meyer, 2000, Laguerre et al., 2007). Par ailleurs, il n’est pas facile de déterminer le rôle exact des antioxydants entre la réduction des radicaux initiateurs et celle des radicaux lipidiques.

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L’oxygène n’est en général pas un facteur limitant de l’oxydation sauf à très hautes températures, néanmoins une agitation du milieu est parfois appliquée ce qui permet une oxygénation régulière.

Pour les tests sur substrats biologiques (encore appelés ex-vivo), dont les substrats sont par exemple les lipides membranaires des hématies, des lipo- protéines de basse densité (LDL), des protéines ou encore de l’ADN, les initiateurs de la réaction d’oxydation sont essentiellement des ions métalliques ou des radicaux synthétiques, mais on utilise aussi parfois les radicaux hydroxyles

°OH car ce sont les plus délétères des espèces réactives de l’oxygène impli- quées dans le stress oxydant (Prior et Cao, 1999, Gardès-Albert et Jore, 2005).

Ils sont générés par divers systèmes, souvent enzymatiques, impliquant H₂O₂ et des cations métalliques, essentiellement fer ou cuivre.

3 – TESTS DIRECTS SUR SUBSTRATS LIPIDIQUES

Les tests mettant en œuvre un substrat lipidique soumis à l’oxydation sont très nombreux. Ils se différencient par :

– la nature des lipides oxydables (acide gras, triglycérides, phospholipides, lipoprotéines, liposomes, huiles végétales, caroténoïdes) ;

– le milieu (lipidique continu, émulsion) ;

– le mode d’induction nécessaire pour accélérer artificiellement l’oxydation car un vieillissement naturel serait trop lent (température, métaux de transition, azo-initiateurs).

L’efficacité de l’antioxydant se traduit par un retard dans l’apparition de l’oxydation ou parfois par son ralentissement. On l’évalue donc à partir du degré d’oxydation des substrats. Pour cela, plusieurs approches sont possibles selon que l’on suit la perte en lipides ou la consommation d’oxygène, l’apparition des diènes conjugués ou des hydroperoxydes, produits primaires d’oxydation, ou celle des composés carbonylés, aldéhydes notamment, produits secondaires d’oxydation (Berset et Cuvelier, 1996, Frankel, 2005). Les métho- des les plus utilisées reposent souvent sur des mesures spectrophotométri- ques, soit du substrat ou co-substrat (cas des caroténoïdes par exemple), soit des diènes conjugués.

Dans plusieurs tests, l’efficacité de l’antioxydant est exprimée en terme d’équivalence par rapport à un antioxydant de référence, souvent le Trolox, dérivé polaire de l’α-tocophérol.

3.1 Acides gras libres

L’acide linoléique est l’acide gras le plus couramment utilisé dans les tests (Frankel et Meyer, 2000). En milieu aqueux, il se trouve sous forme micellaire et sa dissolution nécessite l’emploi d’un alcool ou d’un émulsifiant, généralement du Tween® ou du SDS (sodium dodecyl sulfate). L’oxydation est le plus souvent initiée par un azo-inititateur ou par des cations métalliques (fer).

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– L’initiation par l’AAPH dans des conditions précises de pH (7,4) et de tem- pérature (37 °C) permet d’obtenir une très bonne reproductibilité des cinétiques d’oxydation de l’acide linoléique établies par l’apparition des diènes conjugués (Liégeois et al., 2000, Peyrat-Maillard et al., 2003). Par rapport à une cinétique témoin, on mesure l’effet retard apporté par l’antioxydant dans l’apparition des diènes conjugués. Cet effet retard se mesure par le temps d’induction que l’on définit à l’intersection de la phase d’induction et de la phase de propagation obtenues pour plusieurs concentrations d’un antioxydant (figure 4). À la fin de la phase d’induction, la production de diènes conjugués s’effectue sensiblement à la même vitesse quelle que soit la concentration en antioxydant.

Avec certains antioxydants (exemple de l’acide gentisique à la figure 5), aucune phase d’induction n’est mesurable, par contre l’effet se marque par un ralentissement dans la production des diènes conjugués, la vitesse étant fonction de la concentration en antioxydant : dans ce cas, on mesure le temps nécessaire pour atteindre un taux de diènes conjugués fixé, par exemple correspondant à une absorbance de 0,4 dans l’exemple de la figure 5.

Cinétiques avec Trolox de 0,8 à 8uM

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

temps (min)

absorbance à 234 nm Témoin

T induction Figure 4

Cinétiques d’oxydation de l’acide linoléique induite par l’AAPH,

en absence et en présence de différentes concentrations en antioxydant (Trolox) (Acide linoléique 160 μM, AAPH 2mM, pH 7,4, 37 °C) (résultats non publiés).

Cinétique avec acide gentisique de 0,5 à 3 ppm

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

temps (min) absorbance à 234 nm Témoin

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Figure 5

Cinétiques d’oxydation de l’acide linoléique induite par l’AAPH, en absence et en présence de différentes concentrations en antioxydant (Acide gentisique)

(Acide linoléique 160 μM, AAPH 2mM, pH 7,4, 37 °C) (résultats non publiés).

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Que ce soit par l’une ou l’autre mesure, on trace ensuite une courbe effet- dose pour chaque antioxydant, ce qui permet de comparer les antioxydants entre eux.

– Dans le cas du système fer-ascorbate, la réaction d’oxydation de l’acide linoléique se déroule à 30 °C et pH 6,4 et démarre très rapidement, l’acide ascorbique permettant de maintenir le fer sous sa forme ferreux qui est plus actif que le fer ferrique (Bondet et al., 2000). On mesure l’activité des antioxydants à la fois sur le niveau de diènes conjugués atteints (A) et sur la vitesse de la phase de propagation proportionnelle à la pente (Slope S) (figure 6).

– En absence d’initiateur radicalaire ou métallique, l’oxydation de l’acide linoléique peut être accélérée par la température. C’est le cas d’un test à 60 °C où l’acide linoléique est solubilisé dans de l’éthanol auquel on ajoute l’antioxydant dissous dans un tampon phosphate à pH 7 ; l’indice de peroxyde est mesuré sur des prélèvements du milieu sur une semaine (LI et al., 2008). Un test plus connu repose sur le couplage acide linoléique/β-carotène à 50 °C, en milieu émulsionné par du Tween®, où le β-carotène, co-substrat de l’oxydation de l’acide gras, est utilisé comme sonde de la réaction. On suit par mesure de l’absorbance à 450 nm la décoloration plus ou moins rapide du β-carotène en présence de différentes concentrations en antioxydants (Pratt et Hudson, 1990).

Ce test ne dure que quelques heures mais il souffre d’un manque de répétabi- lité et d’une difficulté d’interprétation des courbes qui ne montrent pas d’effet retard, le β-carotène étant lui-même sensible à l’oxydation (Berset et Cuvelier, 1996, Laguerre et al., 2007).

L’acide linoléique est aussi utilisé sous la forme d’ester méthylique. C’est le cas d’un test en milieu lipidique continu, à 110 °C et sous oxygénation intensive avec bullage d’oxygène où l’oxydation de l’ester est suivie par analyse directe du milieu en chromatographie en phase gazeuse (figure 7) (Cuvelier et al., 1990).

Ce test rapide reste cependant d’un emploi limité en raison des conditions éle- vées de température, sauf pour des études relatives aux traitements thermiques tels que la friture.

Control Slope S

A 0,6 µM Epicatechin

2,0 µM Epicatechin

8,0 µM Epicatechin

Time (min) 0

0,4

0,3

0,2

Absorbance at 233 nm

0,1

0 20 40 60 80 90 120

Figure 6

Cinétiques d’oxydation de l’acide linoléique en absence et en présence

de différentes concentrations en antioxydant [(-)-épicatéchine] (Acide linoléique 170 μ^M, Fer II 17 μM, acide ascorbique 0,7 μM, pH 6,4, 30 °C) (adapté de Cuvelier et al., 2000).

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L’ensemble de ces tests nécessitent rigueur et précision mais ils ont l’avantage d’être rapides puisqu’un résultat est obtenu en quelques heures. Leur limite réside principalement dans la nature des conditions mises en œuvre, par- ticulièrement pour les milieux aqueux où l’acide gras se retrouve libre et sous forme micellaire, ce qui n’est pas représentatif des milieux réels.

3.2 Huiles et Triglycérides

3.2.1 Milieu lipidique continu

Tous les systèmes permettant de mesurer la résistance à l’oxydation des huiles et corps gras permettent aussi d’évaluer les antioxydants, avec les limites déjà citées dans l’introduction (Berset et Cuvelier, 1996, Frankel, 2005).

Dans les tests en systèmes modèles, les huiles utilisées (maïs, soja) sont géné- ralement purifiées sur alumine ou sur carbone de manière à les débarrasser des tocophérols endogènes. Pour accélérer l’oxydation, on place les huiles entre 40 et 60 °C, parfois sous agitation. L’état d’oxydation est suivi sur plusieurs heures ou jours par mesure du taux de diènes conjugués, de l’indice de peroxyde ou du taux d’hexanal produit dans l’espace gazeux (Bonnely et al., 2000, Frankel, 2005). On mesure alors la période d’induction, appelée encore temps critique (Tc), correspondant à l’intersection des tangentes de la phase d’induction et de la phase de propagation (figure 8).

Dans certains cas, on mesure le temps nécessaire pour atteindre un indice de peroxyde de 10 ou 20 meq/Kg (Frankel, 2005).

3.2.2 Milieu émulsionné

Dans un grand nombre de tests, les huiles sont émulsionnées pour consti- tuer des milieux mimant les produits réels (alimentaires ou cosmétiques) avec des émulsifiants alimentaires (protéines, phospholipides) ou des surfactants de

0 20 40 60 80 100

0 2 4 6 8

Temps (h) Linoléate de méthyle non oxydé (%)

5 ppm Témoin

10 ppm 15 ppm

Figure 7

Cinétiques d’oxydation de l’acide linoléique estérifié en absence et en présence de différentes concentrations en antioxydant (BHA)

(Milieu dodécane, 110 °C) (Cuvelier et al., 1990).

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synthèse (Tween®, Spans, SDS). Il s’agit généralement d’émulsions huile dans eau en proportions très variables. L’oxydation est induite par la température, les métaux ou les azo-initiateurs. Les méthodes d’analyse de l’espace gazeux (hexanal produit ou oxygène consommé) sont applicables directement sur les émulsions alors que les méthodes de mesure spectrale ou chimique [diènes conjugués, peroxydes, composés carbonylés dont les substances réactives à acide thiobarbyturique (TBARS), nécessitent un protocole d’extraction.

Ces tests en milieux émulsionnés ont d’abord été mis en place pour étudier le rôle de la composition et de la structure de l’émulsion sur l’oxydation, parti- culièrement pour comprendre l’impact des émulsifiants, des métaux, du pH, de l’interface, de la taille des particules (Mancuso et al., 1999, McClements D et Decker A, 2000, Lethuaut et al., 2002, Hu et al., 2004, Villière et al., 2005). Appli- qués aux antioxydants, ces systèmes permettent d’étudier l’influence de la répartition des antioxydants dans les différentes phases du milieu, et leur comportement aux interfaces eau-lipide (Porter, 1993, Frankel et al., 1994, Schwarz et al., 2000, Paiva-Martins et Gordon, 2002, Frankel, 2005, Cuvelier et Soto, 2007).

3.3 Corps lipidiques : liposomes et LDL

Les corps lipidiques ont un rôle physiologique de réserve ou de transport, ils sont constitués d’une monocouche de phospholipides amphiphiles, glycolipi- des et/ou stérols qui enferment un cœur hydrophobe de lipides neutres, comme les triglycérides et les esters de stérols. La plupart des corps lipidiques possè- dent des protéines spécifiques liées plus ou moins fortement à la surface (Mur- phy, 2001).

0,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 0,5

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

Temps (heures)

Absorbance à 230 nm Témoin Avec extrait

antioxydant

Tctémoin Tcantioxydant

Figure 8

Cinétiques d’oxydation de l’huile de maïs purifiée en absence et en présence d’antioxydant (extrait de malt) (60 °C sous agitation) (adapté de Bonnely et al., 2000).

(13)

Compte tenu de leur structure en bicouche de phospholipides, les liposomes ont été proposés comme modèles d’étude de corps lipidiques animaux ou des membranes cellulaires, notamment en nutrition humaine, permettant aussi bien l’étude des antioxydants hydrosolubles que liposolubles (Gordon et Roe- dig-Penman, 1998). La préparation des liposomes est délicate et demande plusieurs étapes : simple passage au vortex ou passages successifs aux ultrasons, dans des bains de glace sous argon ou sous azote afin de limiter une oxydation prématurée ; extrusion sur membranes de polycarbonate 0,2 µm (Roberts et Gordon, 2003). L’oxydation des phospholipides membranaires des liposomes est très lente et on l’accélère par la présence d’un azo-initiateur tel que l’AAPH et un chauffage modéré à 50 °C qui n’entraîne pas de modification des membranes ni des antioxydants (Woodall et al., 1997) ou à 37 °C comme dans l’organisme (Roberts et Gordon, 2003). L’oxydation est suivie par mesure des diènes conjugués à 234 nm ou des peroxydes. Gordon et Roedig-Penman (1998) ont montré que la stabilité des liposomes était hautement dépendante de la quantité d’ions métalliques présents, provenant notamment d’une contamination excessive par les passages aux ultrasons, et qu’elle était également influencée par le pH. Il est donc important de maîtriser d’une part les ions par ajout d’un complexant efficace et d’autre part le pH en se plaçant en milieu tamponné (Gordon et Roedig-Penman, 1998, Roberts et Gordon, 2003).

Les LDL (Low Density Lipoproteins ou lipoprotéines de basse densité) sont des corps lipidiques de transport des triglycérides et des esters de cholestérol, leur couche externe est composée d’apoprotéine B-100, de phospholipides et de cholestérol libre. Ils sont particulièrement impliqués dans le stress oxydant et l’athérosclérose (Peynet et al., 2005). On les obtient à partir du plasma par ultracentrifugation (Chung et al., 1980).

L’oxydation des LDL est généralement induite par les ions cuivre, les azo- initiateurs tels que l’AAPH ou encore des catalyseurs biologiques tels que la myoglobine ou le cytochrome C (Frankel et Meyer, 2000). Les phospholipides, dont la phosphatidylcholine qui est le plus abondant dans les LDL, sont les pre- mières cibles de l’oxydation en raison de leur richesse en acides gras polyinsa- turés, suivies par le cholestérol libre, les acides gras insaturés des esters de cholestérol et enfin les résidus acides aminés de la protéine qui réagissent avec les aldéhydes issus de la décomposition des hydroperoxydes. On suit donc l’avancement de l’oxydation des LDL par dosage plus ou moins spécifique des composés d’oxydation (diènes conjugués, oxystérols, diénals, substances réac- tives à l’acide thiobarbiturique, carbonyles).

La mesure des substances réactives à l’acide thiobarbiturique est une des méthodes les plus utilisées pour mesurer l’oxydation des LDL. La principale limite de cette méthode est que plusieurs substances présentes dans le milieu, comme les protéines, peuvent interférer sur la mesure (Jardine et al., 2002). La dégradation de l’apoprotéine B-100 peut être mesurée par la perte en trypto- phane par spectrofluorimétrie ou la formation des carbonyles par réaction avec le dinitrophenylhydrazyne (DNPH) (Frankel, 2005).

Une des limites à l’utilisation des LDL est qu’ils contiennent des antioxydants endogènes (tocophérols, caroténoïdes) qui peuvent entrer en compétition avec les antioxydants testés et biaiser les résultats.

(14)

3.4 Microconstituants lipophiles

Dans les tests qui mettent en œuvre des caroténoïdes ou des acides gras conjugués, on ne peut pas parler à proprement dit d’oxydation lipidique car il n’y a pas de phase de propagation radicalaire. En fait, ces composés subissent la co-oxydation des radicaux de l’azo-intitiateur et sont utilisés comme sondes en raison de leurs propriétés spectrales. Les antioxydants réducteurs de ces radicaux vont se trouver en compétition vis-à-vis de cette sonde.

Dans le test TAC (Total Antioxidant Capacity ou Crocin Bleaching Assay), le caroténoïde utilisé est la crocine (Bors et al., 1984, Lussignoli et al., 1999, Dupas et al., 2006, Ordoudi et Tsimidou, 2006). La crocine est extraite du safran dont elle est un des pigments majoritaires et dont l’absorbance maximale se situe vers 450 nm. La réaction met en œuvre l’azo-initiateur AAPH et se déroule en milieu tamponné à pH 7,4 et à 37 °C. L’oxydation de la crocine par les radicaux de l’AAPH entraîne sa décoloration que l’on suit par la perte d’absorbance. En présence d’antioxydant, cette décoloration est ralentie et on mesure généralement le pourcentage d’inhibition après 1 heure de réaction par rapport à une oxydation témoin sans antioxydant (figure 9). On établit ensuite une courbe effet-dose de manière à calculer la quantité d’antioxydant nécessaire pour obtenir une inhibition de 50 % (IC₅₀).

Cette méthode est simple à mettre en œuvre, répétable et sensible puisque les antioxydants sont utilisés à une concentration de l’ordre du micromolaire (Lussignoli et al., 1999). Elle est adaptée pour tester aussi bien des composés antioxydants hydrophiles que des plasmas. Toutefois, les limites viennent d’une faible reproductibilité en raison d’une variabilité de qualité de la crocine et surtout du fait que les très fortes concentrations en AAPH utilisées pour la généra- tion de radicaux libres (0,5 mol/L) ne sont pas représentatives de conditions normales dans l’aliment ou in vivo (Kampa et al., 2002).

Les tests utilisant des acides gras possédant plusieurs doubles liaisons conjuguées reposent sur le même principe de la perte des propriétés spectrales en présence des radicaux AAPH mais leur teneur est suivie par fluorescence

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

0 20 40 60 80

temps en min

Absorbance

Témoin

Cinétiques avec Trolox de 1,5 à 10 mg/L

Figure 9

Cinétiques de décoloration de la crocine en présence de différentes concentrations en Trolox (pH 7,4 et 37 °C) (résultats non publiés).

(15)

dans le cas de l’acide cis-parinarique ou par spectrophotométrie UV à 273 nm dans le cas de l’acide α-éléostéarique de l’huile de tung (ou Bois de Chine) (Laguerre et al., 2007). Plusieurs tests ont été développés avec l’acide cis-parinarique, une fois intégré dans des LDL, des liposomes ou même dans des structures plus organisées telles que des cellules. L’intérêt réside dans le fait que cet acide est bioanalogue et ne perturbe pas la bicouche lipidique des membranes. La limite de ces tests vient de la sensibilité de ces acides gras conjugués à la lumière et des interférences avec d’autres composés ou avec les antioxydants aux mêmes zones d’absorbance ou de fluorescence (Laguerre et al., 2007).

4 – TESTS SANS SUBSTRAT LIPIDIQUE

Les tests présentés ici mettent en œuvre des conditions éloignées de celles d’un produit alimentaire, aussi bien pour ce qui est du milieu (alcoolique ou tamponné), de la nature des réactants ou de la réaction mesurée. En effet, on ne peut plus parler ici d’oxydation lipidique, ni de protection par les antioxydants car il s’agit de suivre une réaction, celle de la réduction d’un radical chimique ou d’ions métalliques, par transfert d’un atome d’hydrogène et/ou d’un électron d’un antioxydant.

4.1 Réduction de radicaux synthétiques

4.1.1 Test DPPH°

Le test DPPH° est aujourd’hui extrêmement répandu dans les domaines alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. C’est un test connu depuis les années 1980 mais dont les conditions d’utilisation ont été analysées et revues plus récemment (Brand-Williams et al., 1995). Mis en présence d’antioxydants, le radical synthétique DPPH° (2,2-diphényl-1-pycrilhydrazyl) est réduit et perd alors sa couleur initiale violette :

DPPH° + AOH DPPH₂ + AO°.

On peut facilement suivre l’avancement de la réaction par spectrophotomé- trie à 515 nm. Selon la nature des antioxydants, la cinétique de réduction est plus ou moins rapide (entre quelques minutes à plusieurs heures) (figure 10).

On compare généralement les antioxydants par la CE₅₀, quantité nécessaire pour réduire 50 % du DPPH° initial après un certain temps de réaction. En se plaçant au plateau, on peut calculer la stoechiométrie de la réaction. Mais la vitesse de réaction est également à prendre en compte dans l’activité des antioxydants : une formule qui combine la CE₅₀ avec le temps nécessaire pour atteindre le plateau (soit 1/CE₅₀ x T_CE50)est préconisée par Sanchez-Moreno et al. (1998) ; une analyse plus fine des cinétiques de réaction permet aussi de comparer les constantes de vitesse (Goupy et al., 2003, Foti et al., 2004, Friaa et Brault, 2006).

(16)

Les atouts de ce test sont multiples. Le DPPH existe naturellement sous forme radicalaire. La réaction se déroule à température ambiante, en milieu alcoolique ou hydroalcoolique mais certaines adaptations permettent aussi l’utilisation de solvants moins polaires comme l’acétonitrile (Nemadis et Tsimidou, 2002). Ce test facile et bien maîtrisé permet de comparer rapidement un grand nombre de molécules ou d’extraits, il est donc bien adapté à des phases de sélection. Il peut permettre aussi des approches cinétiques pour des études plus fines sur la relation entre la structure des antioxydants et leur mécanisme d’action antiradicalaire (Brand-Williams et al., 1995, Bondet et al., 1997, Goupy et al., 2003, Foti et al., 2004, Tsimogiannis et Oreopoulou, 2005, Villano et al., 2007). Il reste que la principale réserve vis-à-vis de ce test repose sur le fait que le radical utilisé est artificiel, stable et donc tout à fait éloigné des radicaux lipidiques impliqués dans les mécanismes radicalaires d’oxydation qui par nature ont une durée de vie très courte (Frankel, 2007). Les valeurs d’efficacité obtenues au test DPPH° sont à prendre comme indicatives, d’autant qu’elles dépendent du moment auquel on fait la mesure (plateau ou non), et que de plus, elles semblent varier en fonction du solvant utilisé. De ce fait, l’extrapolation à la protection des lipides doit donc rester très prudente.

4.1.2 Test TEAC

Le test TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) a été proposé en 1993 puis revu en 1999 (Miller et al., 1993, Re et al., 1999). La première étape consiste à générer un radical à partir de l’ABTS [acide 2,2’-Azobis-(3-éthylben- zothiazoline-6-sulfonique)] en présence de persulfate de potassium pour former le cation ABTS°⁺, qui a une coloration bleu-vert et absorbe à 734 nm. La formation de l’ABTS°⁺ est maximale au bout de 6 heures.

En milieu tamponné (pH 7,4) ou dans l’éthanol, les antioxydants sont capables de réduire les radicaux ABTS°⁺ en leur forme ABTS incolore et stable, avec un état stationnaire obtenu au bout de seulement 4 minutes à 30 °C. La diminu- tion d’absorbance au plateau, proportionnelle à la concentration en antioxydant, permet de déterminer un pourcentage d’inhibition. Dans la version standardisée vendue sous le nom de Kit Randox, les antioxydants sont ajoutés dès le début de la réaction et on mesure alors le retard dans l’apparition de

Figure 10

Cinétiques de réduction du DPPH° en présence de différentes concentrations en acide ascorbique et en guaïacol (adapté de Brand-Williams et al., 1995).

(17)

l’absorbance. Pérez-Jiménez et Saura-Calixto (2008) proposent de prendre en compte les paramètres cinétiques comme pour le test DPPH°.

Afin de limiter les problèmes de reproductibilité, une valeur TEAC est calcu- lée par le biais d’un antioxydant de synthèse, l’acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétra- méthylchroman-2-carboxylique (Trolox), utilisé comme référence et traité dans les mêmes conditions que l’échantillon.

Cette technique est simple, répétable et sensible puisque la concentration en antioxydants utilisée est de l’ordre du micromolaire. Elle est fréquemment utilisée dans des domaines variés car adaptée à des substances hydrophiles ou lipophiles. Pourtant, les valeurs d’activité obtenues sont difficilement corrélées avec la structure des molécules testées (Huang et al., 2005). En outre, on relève des interférences possibles avec des ions oxydants présents dans le milieu (Re et al., 1999). Enfin, comme pour le DPPH°, la limite vient de la nature artificielle de ce radical, sans lien avec les radicaux lipidiques (Frankel, 2007). À cela s’ajoute le fait que le radical est de nature ionisée, ce qui crée un flou sur le mécanisme exact d’action des antioxydants par transfert d’électron et/ou d’atome d’hydrogène (McDonald et al., 2006).

4.1.3 Test ORAC

Le test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) permet de déterminer la capacité antiradicalaire vis-à-vis des radicaux peroxy de l’AAPH à l’aide d’une sonde fluorescente, sur un principe similaire au test TAC. La Phycoéryth- rine, naturellement fluorescente, perd sa fluorescence sous l’action des radicaux issus de l’AAPH. La présence de molécules antioxydantes va induire un retard dans la perte de fluorescence. La valeur d’efficacité d’un échantillon testé est rapportée à celle d’un antioxydant de référence de concentration con- nue, le Trolox, et exprimée en μmoles d’équivalents Trolox.

Cette technique proposée initialement par Delange et Glazer en 1989 avec de la β-Phycoérythrine (β-PE) a été légèrement modifiée par Ghiselli et al. (2000) qui préconisent la R-Phycoérythrine (R-PE), puis par Huang et al. (2002) qui pré- fèrent la fluorescéine car plus stable que la β-PE.

Une adaptation de ce test par Valkonen et Kuusi (1997) utilise l’acétate de 2,7-dichlorofluorescéine qui, sous l’action du radical peroxy de l’AAPH, s’oxyde en dichlorofluorescéine, qui fluoresce à 526 nm (λexcitation = 480 nm). La pré- sence d’un composé antioxydant va entraîner ici un retard dans l’apparition de la fluorescence. Dans cette lignée, on peut aussi citer le test HVA. Ici, la pro- téine est remplacée par l’acide homovanillique (HVA) qui s’oxyde spontanément en un composé fluorescent (Gaboriau et al., 2002).

La limite de ces tests vient d’une part de l’utilisation de radicaux artificiels et d’autre part de la mise en œuvre de milieux aqueux tamponnés non adaptés aux antioxydants liposolubles. C’est la raison pour laquelle ces tests sont en fait surtout utilisés pour évaluer le potentiel antioxydant de jus de fruits ou de fluides biologiques tels que le plasma. Pourtant, dans les études sur le plasma, il est noté une compétition entre les protéines plasmatiques (groupements thiols et phénols des acides aminés) et la protéine fluorescente utilisée dans le test.

Les protéines plasmatiques sont effectivement susceptibles de réagir avec les radicaux peroxyles, interférant ainsi dans le dosage de la capacité antioxydante du plasma. De plus, la β-Phycoérythrine se lie de façon non spécifique à

(18)

certains composés comme les flavonoïdes, faussant ainsi la valeur de la capa- cité antioxydante de ces composés (Huang et al., 2002). Enfin, l’utilisation de Trolox comme référence n’est pas justifiée pour cette application car il n’a aucune similitude de structure avec les composés polyphénoliques présents dans les fruits ou les fluides biologiques (Frankel, 2007).

4.2 Réduction d’ions métalliques

Le test FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma) repose sur la réduction du fer ferrique (FeIII) en fer ferreux (FeII) par des agents réducteurs, et se traduit par l’apparition d’une coloration bleue que l’on peut mesurer par spectrophoto- métrie à 593 nm (Benzie et Strain, 1996). Cette réduction est rapide (de l’ordre de 4 min), a lieu en milieu aqueux à pH acide (3,6), à 37 °C et en excès de fer ferrique. Ainsi, il est possible de mesurer le pouvoir réducteur d’antioxydants purs ou présents dans un fluide biologique. En revanche, le test n’est pas adapté à certains antioxydants comme l’acide ascorbique qui réagissent avec le fer ferreux (Cao et Prior, 1998).

La limite de ce test vient du fait qu’il ne mesure pas l’ensemble des antioxydants présents dans un extrait ou un fluide biologique mais uniquement ceux capables de réduire le fer ferrique. Ainsi, Cao et Prior (1998) montrent que les groupements thiols, qui sont d’importants antioxydants in vivo, ne sont ici pas mesurés. Cette technique reste toutefois simple et peu onéreuse.

4.3 Potentiel redox

La mesure d’une grandeur thermodynamique telle que le potentiel redox représente également un indicateur intéressant pour déterminer l’activité antioxydante globale des constituants présents dans un produit alimentaire. Il est complémentaire de la mesure de l’activité antiradicalaire qui fournit une information sur la capacité des molécules à bloquer les radicaux (Nicoli et al., 2004). S’il ne donne pas d’information sur la vitesse des réactions, il permet de prédire si une réaction d’oxydo-réduction est susceptible de se produire dans le milieu, et dans quel sens (Anese et al., 2003). Le potentiel redox est mesuré par voltamétrie à l’aide d’une électrode de référence Ag/AgCl, Cl^-_sat (Manzocco et al., 1998). Il a été mis en œuvre sur des milieux liquides aqueux de type café ou thé (Anese et Nicole, 2003, Andueza et al., 2004, Nicoli et al., 2004) ou sur des concentrés de tomates préalablement dilués dans l’eau (Anese et al., 2003).

L’activité antioxydante totale d’extraits aqueux a plus récemment été mesu- rée par potentiométrie à injection de flux. Cette méthode est basée sur les interactions chimiques susceptibles de se produire entre les antioxydants du milieu et le couple K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆], conduisant à un déplacement du potentiel redox de ce dernier (Shpigun et al., 2006, Brainina et al., 2007). Ces mesures ne sont cependant applicables pour le moment que sur des systèmes aqueux contenant des antioxydants hydrosolubles. Des études complémentaires sont en cours pour développer cette méthode sur des extraits liposolubles.

Par ailleurs, une corrélation a été mise en évidence entre le comportement de molécules antioxydantes ou d’extraits végétaux en chromatographie liquide haute performance couplée à un détecteur coulométrique, et l’activité antioxydante mesurée par les tests ORAC ou DPPH (Guo et al., 1997, Maillard et al., 2000).

(19)

5 – CONCLUSION

Les antioxydants, qu’ils soient naturels ou synthétiques, présentent des structures chimiques et des modes d’action divers. Leur efficacité ne dépend pas seulement de leur structure mais de nombreux facteurs liés aux produits à protéger, incluant le degré d’insaturation des lipides, la présence et le type d’initiateurs, et les conditions de conservation (Frankel, 2007). Par ailleurs, les produits sont couramment de nature multiphasique et le rôle de l’interface, notamment des émulsifiants, est particulièrement crucial pour la localisation de l’antioxydant dans les différents phases (Porter, 1993, Frankel et al., 1994, Stöckmann et al., 2000, Schwarzet al., 2000, Frankel, 2007). Pour évaluer l’effi- cacité d’un antioxydant dans un test in vitro, il est donc important de considérer la composition du milieu, le type de substrat, le mode d’accélération de l’oxydation, la méthode de suivi de l’oxydation et de calcul de l’efficacité. Or il ressort de cette revue que l’ensemble des tests présente en fait une très grande variété de milieux, de pH, de température, de substrats, de mécanismes d’induction ou de propagation, mais aussi de rapidité, de sensibilité ou de reproductibilité, ce dernier point étant lié à la pureté des substrats (présence d’antioxydants endogènes, mais aussi traces de métaux ou d’hydroperoxydes).

Il en découle que l’activité d’un antioxydant ne peut pas être une valeur absolue mais bien une valeur relative au test mis en œuvre. La conséquence est une dif- ficulté de comparer des antioxydants entre eux s’ils ont été testés dans des conditions différentes.

Par ailleurs, il est difficile d’extrapoler les résultats des tests en systèmes modèles à une protection de l’oxydation dans les produits réels alimentaires ou cosmétiques, ou in vivo. Plusieurs raisons sont avancées :

– les substrats utilisés, quand il s’agit d’acides gras libres s’organisant en micelles, ne sont pas représentatifs des substrats réels qui sont essentiellement des triglycérides pour les aliments et des LDL pour l’organisme ; – ne sont pas prises en compte les interactions avec les éventuels autres

antioxydants (pouvant provoquer des effets de synergie ou d’antago- nisme) ou avec les constituants du produit, notamment en lien avec la nature multiphasique du produit à protéger ;

– les azo-initiateurs utilisés dans certains tests ont l’avantage de générer des radicaux à une vitesse constante, mais leur nature artificielle et l’exa- gération des teneurs générées associée à une augmentation de la phase d’initiation les rend inappropriés pour mimer les réactions existant dans les aliments ou les systèmes biologiques (Frankel et Meyer, 2000). De plus, la vitesse de réaction des antioxydants avec ces radicaux artificiels est probablement différente de celle avec les radicaux lipidiques.

La question est maintenant de savoir comment choisir le meilleur test. En fait, l’approche est probablement différente selon la question exacte que l’on se pose.

Si l’on a besoin d’effectuer un balayage d’un grand nombre d’extraits, un test rapide est tout à fait adapté, il permet de sélectionner les extraits les plus prometteurs par comparaison avec une référence testée dans les mêmes conditions. Il est parfois souhaitable de valider le choix avec un deuxième test

(20)

réalisé dans des conditions différentes. Les tests basés sur la réduction d’un radical orientent bien sûr la sélection des extraits contenant des composés antiradicalaires.

Si l’on recherche plutôt une compréhension du mécanisme d’action de tel ou tel antioxydant ou de ses interactions avec un autre antioxydant, on choisira un test aux conditions bien maîtrisées et reproductibles, où l’on pourra faire une analyse des cinétiques de réaction. La présence de traces de métaux sera par- ticulièrement à surveiller quand on veut s’assurer d’une activité antiradicalaire.

Enfin, si l’étape est maintenant de formuler un antioxydant seul ou en mélange, et de tester son aptitude technologique, on mettra en place un test adapté à l’application, avec des conditions les plus proches possibles du produit. Dans ce cas, il sera souvent nécessaire d’appliquer des conditions de vieillissement accéléré, dans les limites déjà mentionnées dans l’introduction.

L’efficacité de la formule repose sur le choix des indicateurs de l’état d’oxydation du produit et il est conseillé de suivre en parallèle les produits primaires de l’oxydation et les produits secondaires (Frankel, 2005). Une étape de mise en œuvre dans le produit réel, dans les conditions de fabrication puis de conservation, apparaît incontournable pour s’assurer de l’efficacité réelle.

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