Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Leonis, J. (s.d.). Le mécanisme de la dégradation de l'acide zymonucléique par les ferments de la muqueuse intestinale du lapin (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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lNTRODUOTlON

.- !'reparation. es l!.'Ubstrats • ·• • • • • • • ·• • • • .11 Puriftoati.on d.e 1

actde zymonuolelque. • • • • • , 13

P:reparat:lon dee nuclf>otide s purlques. • • • • • • 14 Pi-eparat1o.n du rlhose•)•pllospha.te. • • • ·• ·• • • .17

l?rilparat:lon ds s nucleosidee pur1 ~e.ia. • • • • • • 18

a.- ^A.nalYse 61 mentaira dee substrata • • •.•• ·• • • • a?1

o.. • La preparation f ermenta1re ,. .• ·• • • ·• • • • • • , 24 ·

Ai·• M.icrodosage du phosphore • • • • • • • • • • • • • a6 .s.- .1orodosmge de 1

ammonlao .• • •

icrodosage de l'aoide urique

• • ^• • • • • • •

o.- _{•• •} ' . ^{••••• •• •• • ·29}

n. - . icr•odo sage dU I'ihoae 11bre • • • • • • • • • • • • ;2

LA RM.Q'rlO?f DE DECOLORA'V:J.:ON DD · ~J,EU ~.

METHYL~NE PAR L

A0i1$ ZY?~.ODUOLEIQ,UE.

A ... L,a d6hydrass de Tsuge • • • • • • • • • • • ·• .• • '• 34

• • • ••• 37

Intervention de 1"• xanthine-d:. bydrase dane

le cataboll aroe nualeique • • • • • • • • • • • • • 39

La xanthtne-deby~rase. e.et•ell·e la seule d' bYdrase tnt,.ervenant dans le oatabol1sme mtol~1q,ue'l •••• 41

B. • Le r'&le oate.lytique de 1

aotde zponuol lque. • •• 44

ltA HEAOTIO?i mu PEOOLORA'l'lOl!I 00 lSL ilU m

UIT~P.iNE PAR L •4c1m a~ ONtJOLSIQU'~ (SUi;t.•)

A .ifl• • Les ferment.a d~ oata.bol:l.sme mJcl€)1que .• ·• • • ••• 48

Soh&na g neral • • • • • • • • • • • • • • ties. ferment~ et leu:r tmportan.ee relative •

• • • •• 48

• • • •

s.- I/9.ct1on des ·riv~s halogl-no-ac-t:tquea • •••••• 54 OHltJ,> I~ V:.

A.- ;La d~grad.at:1on des d~riv~s puri-ques •••••• • •• ~58

La methoae utilit§e • • • • • • • • • , • • • • • • 58

Oom.para1aon des aeux t:lseue

_• • •• • • • ••• GG :a.- ^{Le rG·le de 1}

^aolc1e r1bose•)-·phospbo.rique • • • • • .• 63

A:.• L.a th~orte de Mlchaella ,. ·• • • ••• • • • • • • • • B.• Les eas limit.es de la formule de 1ohael111e , •• • •

·O.• Diaousaion ae 1 th'o·r1e de !cha.ells •••• • •

:o .... lnfluenoe des prodUits de~ la r~aotlon • •.• • ••• 13

OHM XTRll VI t.

LSS ···'J!A.l?ES DU CA'l'AB~I E NDGLEl. Ulll· •

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CI Di APlilOO..l~iu,111 • • • • • • • • • ~ ~ 1'

• • • . . . ^·• .

A .• • Mphospho..,.1atlan • • • • • • • • • • • • • • • • • • 8:;

s, • tlb~ratlon du riboae • • • • • • • • • • • • • ^{• J ••} 84

Q:. • OOsaminatton • • • .• •• • • • •• • • • • • • •• • • • • .I.§

Q; U ET ·QQNCLU SlOtr,s, • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 93

• • •••••••••••••••••••••• j8.

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l•' m'tiUriG' d.U Y (;t bolism de(! r:lUCl(~O~.!i ot{•!dE:H:t, de.13 ~Ci.dee

nuol • i t: e ot d r:: (ori v6s ap·pe.rent"' , se r~t ^t ehe une se\t•ie ^!al prolll~niea b1oohim1qt.M.1H~ dont l • 1nt. ".ia 1'.. va ehnque jour t'uo1st::i.ant i 1)1'EHHl'l.1e GhBq\'l$ foim ~.u "en pl,;n~t1~ l • 1nt.1 n:1 t.~ d 'un . hlJnom~ne pby$1o- log1qt.J import::..nt, on · eut E!l•att.endr i.i. rencont:n~r en ehem:tn u,n li·

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01i & thyr: nuele1que 1nter-v . nt dan la oonstiti tion

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ribonuclAique et plutOt looat.ise d ns le o:ytop:t.msme, riin1$ oependan

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~u $l .1,ln rGle don11 nt dal'ls 1 t.-lynthese ..

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19411 re.Ob t., l: "); n trouve, en eff'et, r.e,(ll i:LUinti\es :l 'lpoa."'tant.a d 'a~ .Qe n~ol Uqu~,e. ns tout et l .a oel.lU.les ou t~• f.'f · atue iu · yn~

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ea f>ra udlt n · eours ·rlesqu l Claude~

aner (1 la 1"4 ), ont mta en ·Vi ne

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01t1.t at Q.CG., dana de l'l.O breux t1 S$Ua, • . gr · nu1e,s eapar2b.l p ~

~ 11t1t11:z:,c, ntr fug t1on; <ie·s gl'anul e r nferm nt l ·l~ $(.1\1& tote,1 t(i .... --

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le. y th:~Ge o ·. rot'11ne... 'effeot.u rait u n1v ea de o. s ' nu~

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N'ou'bliona p s qu l·es ultl"v.'Vit'us, cas antj.tf:s cru se irou,

vent l . limite d.\i "onde vivant.. re.nferment une qtu:.antita im..)ort.an- te. cle 11uo1€1op:rot ... idea (du type ribonuolei.t'.j,Ue, :te plus sou.vent,}.

l)eu:aa Oefl virus on tvouve parfo:t · , aonnne dans las g:ranul.es, une e.J,~SG•

e:tation ent.re nucltioprotlHdes et ferments# U!al$ il .est difficile cle i~C():t',n~:r. dEUlS q,ualle mesure ce f'er'ments ne sont '&· e f,1:£mplement

adsol1b~s a ^{l~ ai1l'f · ee du} oompleJr.e prot61qu.e (Stanley et Kn1gbi, l J

, rta!n$ virus pourrutent ttre responoobles d l

^app E .. :rition fie tu-

. meur·s. eanoereusef:'I (Rous).

tes d(!)riv~s nun1 ... tques Q°ti oerta1ns d.e leurtrS conatituont.s (bas~s t1u:r:.tquas .et vt,r1trtid.tquea) sa oont encore avfrt!'ls de:ei. f4oteurs ind.l$p$nsab10s a 'la di~o1ssanee e nombreu:K: mioroorganisme (voir l.P.

revue, .falt.e. ^pe,F Lo:rtng n 19 4) et ·des lavures (Oo.ok at a.i •• 1943).

tea tran~f<>r1nations dee d~X'iV s nueleiquea son·t. clone liee.s

'd' 1;tn~ ma:rd.~re troi te ^{t\ l • eoonomie} gepet>ale daa 3tre 'Jft wnto; d.ana cert~~n.$ 01;1$, on. e. pu d~term1neX' 'urie m@.ni tlre t:ttes pi-; oi.ee la naiur d.u i"tre:n~~rttt le ~ta~o11sm nuct~lque au:t autres m.~t~bolismes eellu-

lair,,u~. On n• ^{1gnore 1~aa le re1e:} c$~termi.nant, dea 11uo.16otir.1.es purique

dans ie· cataboli,sme alu·c·id1que, OU lls int.e~viennetit ^00,tnme dOtlfleU~S

et O·Onim$ t;U)Qepieurs de phospi\o:re OU d'hy(irog~ne; Ce$ QOmpoaeE; inter, ,,

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Vt$m'lellt galeme.~t dan$ la dl!gradat1on .oqd~ti"'.e as ao1des r~s

· (Lehn~~e~, 1944. et 1S145; ~p1r(l) ot

^! erthe.int r, l 4~); notons el:lfin que .. QlOw1ok et l?r1Ce (l 5.) ont rG.oGuuuent. d<'}m.ont.re que lr.\ jU.a.nine,

lib ·t'~e eux a~ en, de .1>11 gross- molecule 'ao1d, · nucltU.que, .s.;,it

eoU}l'ne. acrtiivateur ~ns oerta.tnes pho$phory1ations.

n na s • ~t.onnaJta done. p s de vo1r ee mUl tipt1el' 1e.s trava.u

S.lll*' 1·• m t bQliem& .nuc16·lque ei.u nive u de divetts o:rganes. ~1 nous

· fei.1 sens un :retouu de ~l'ente ou q~rainte ns en nrP.t ·re, nous pourronQ dlat.i~ue~ trois \fleriodas auooeseiSves dan·e Q. rtt'll f,luit .4•~tP.tle$.

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AV. t'U~bUt, OU e COb.\enta d

ln .. jeoter OU de f:ait"e 1~ f<U' a 1' $t'litna1 le

oom)Yb$!1i ~tudt'l, po.ur tn:ilvre enatlte 1 •epp r1t10.n tJS p .. oduit.e

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.le$\ f$!'Ul0:nt.~~. :riaepons , _es a la tiliti rade.t1on, et'en tu:d1 r 1es r>:ro-

pri1~t~a et d'en .. itu~r- le 1'0101 depuis une iza.$ne d.'r,n'lnlt~as, En.U'in, se d.es~i!ne une

o ·vell~ m~thmd.0 qui Gonsiste u.til!ser des ~ub-

lf> .,.,) •

a-tra !.ii.~ l'f!Q.rcttt; s ( N' " , .. -''· ) do,nt on P">u·t su1 vre le d~nstin d une ^n1a••

ui ~x·e b(!l)·amloup pl us f 1ne.

Lu premiere m~thot e n' est pas d'une tlr~s g:rt:tnde finess.e:o tout au plus peu.t-ell donner .d~ut1le~::; indications su~ lea predu.it.~:ll ulti.me~ d'u.no .~g:t'l3:dtr'lt1.on

·ma.ts ell ^G~4t incapable de rense1 n ll

t

an! re que l •on a pu se rendre ec pte des fai t.e ut.vants:

c-he.111 l~s mammii'iree

le ·ohet. prinOil)al du c;,\tabol.1sme nucleiq""'e

Gs,t l.

1.llllii>nt.oln.e, a ¹

ex,oept1on d J. 'hOlntnO et

pt*lmr,.tee QU1

exor&t...ent ^{di! 1} •aeide u.vique; chez las Qi sea.we, o

eat 3. ·~.ei :e ur1-

,

..

qua ~g.alo.ment qu.i est ex.er te; ch.era le· invertebres, l©a prod.u:tt,s ultime.s dift&rant 'une al-t:l·S~ e 1 'au:tre, allant 0.0 1 'acside ur1qu.

a l

ammoni 4uG et. pe.s ant par tous les tnterm~ ird,l'"es (Flovk~i1,

, • eet 1•1so1ement,

Qn sa1\ . ue l 'aolde zymonuol H.qu~ peu.t aub.ir un.e

/

GUJ:t d$S fer"1 nt qui, danm 1 •or ni srtt• 'ii va11t, r ·al i sent de a t.roan~-

f'o~ttona 1 ~tiqu.es a Offllea pr.adult.ea par leS a ·ents CblmiqU&S'e

l!rn 19f' , Levene et Vi{0ber ieolerent pour· la prem1 re fole 1~. nucl~o-

. ·1 a, a, te ent qu1 eoin e le nuol osia ^$ pu:riq,ue;r.; ·&n bas l1bre +

rib«u1e~ la purilf1oat1on et. l '{tude de eet ensyme fu.vent rti l•i,:?

a

e n (1935); sa einattque n• est

1 --

()Onnue que depuis fort pell, at la au1to 'deiS tz•avs K <ie ~lckt.\t'(l.94~).

tie. nuel.6ot.l&ca1lie, qtt1 hydrolyse lee nucl@ottdes en nuclif.,o$1d,es +

aoide :pbosphor1qttei, fut ieoltla par Deut.sQ'h ( lSJ~Yr) et etut i~e n

,1~H:.~.ll par 1Ueim n 1~32. .Ii revient et lsh1kewa et omita {19)6) a'avo.~~ cn:r.aotal"isf l~ n.u..ol~otide-~-ribosidetsc~, dent 1 'aertt<Jn s poPt$ auera.l aur 1es nucleoti , ma.1 s qu.1 3.1b~r ·~ 6.1'.J!EH)temei'lt l ·

(l~~O), tool.a 1'en~yroe depolym~riaa.nte= l~- r·ibonuol6aee~ que u- ni.t.a e pu. e:t-1s''t.a111aer 1 'annf.le su.ivant.e.

1. ee s diverses

iastases, 11 taut ncoxte jout,~r 1.e grou- ..

pe des €/a inaees; aig.nnlon~ qu'on en a oare.et~:P11EHf, un grand twm•

:Q-re, Ql}aaune r 'alit3ant la d~saminat1on d'un iaes qua.tr.a types de eot11pc.s~s: polynuc·l oti e, nu.cleot:tde, nuel&G$id$, ba_se tibt"•·

~.e,s enzymes une foi eonnua, on ~et parvenu ~ retr:aeer

aa.ns un gr nd nombr$ . e ca.$ lee dif'f~rEmtes &ta,pes pai-courues par le$ d.~·r1V'i.~H3 nu.cl . .t.ques au oou.r ^cle leur e.atil.bolieme.; tians 1•~uto- 1;vse, de divl!Jrs orgta,ncHl, par e.x•mple, on a mntr(! qua ce;;J) _,, d6P1va t1ubl$$4a·nt av .n:t t.ou\ La d,(!pbospbroX'1la.t10n.. a' est le c a pour 1

au- tolyse d;t1 fo·ie

·U musoJ.$, et du x-e in. o~ le tau:n: en purines 1. :l- 1;).rea et m:t;O·leos1Giea a'a,caro.1t progree 1vemeni aux dt:lpena der;1 nu-

4'l6o\l~.G'S (8aehn, 19::;6>. au oours ce 1 'autolyae de la l~vur.e,

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ua,ehtl (i.935) a montr@ qua 1 'ao1a.e zymonu~1·1que ~1ubit euceee:$l-.

ve.menif 3.~. d~lph<Hi!phorylation, la de. m1nat1on et 1 'llyd:i>Ol3fse de 1a

l.tai:~en 11ueoeidique e nualeoa;t ,es; la m~t'll~ euite de· tJ?e.n.$tOf'•

'fllatlo1ui s'ob"'. rve Gnoor pend~nt 1'autolyse d\1 e$~eau (Karr, 19tk:;

atotte, ^{1 43} >.

Dans le t.issus . ormaux, 1e :eataibollsm.e de l 'a.ci,dQ$ nu- 0'1 t,que p u~ su1'Vl''& d s voles d1f1" rent et selon l • o:rg ne 6~t(l.i~a oepeniaant, en re ·1e g6n ~al~ la d~phospboryle.tion a l..1eu ttVant. la

11\)€t~at1on tte la b Sl} a~i!~, tandia que 1· di:! sa nation .~ pl'<>•

duit o.•une e'llqon pr6 on rants l 'un ule,m.ent deE'. "f;):loia f.:ltBdfuu

nuol, .o*.i c .• nuoleosi e. base ltbtte. l>arm.i tou.te$ 1es reoberntles

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l.}i5) iat. d Com;"J.y ^et Ooob."e {l.9J9); pour 1'~01 e tnym.orn.cli! ue,

t antionnoru 1 s tr .vnux de i ~ :tn ( 193') et de lna€,i;ak1 { lY ) • Oes hel'eheu!"s se ci.on.t ffor 62 d'· ts..blir, pout" le t:i..SSU QU

ils

otu.dt.~tent, le scht!tu1a det{ -t~act1ons oonaۥeut1vas ~ti.i conrJ.u.i11JGnt

f:l,G l • oirle nuclf.iique a s~ consti tua.nts libras.

ll est 1.ntt re!Hlc n.t e note· que l s da~ aapeeta du m"tei.bol1eime

oatr~bolisme et aMbolisme, peuv nt entreri s;l:mu1ta- name11t dan une m me oht-.1ne de r • \et ions. Si.1nsi

Oetern ( l.J:~)

rtaisEie..noe a ^{l •0.oide royoa.d nylique ·ar cl gradation jusqu'au st e}

nuol ^os1 ·e et ra ynth.esa <ilU. nouveau. nuo:tectide •

.h~n c ( u1 ccneerne l 'a. s1m.1latton def.'! a.cidela 111u.o 61qu.es

f:i.'l.t n1ve~u de l 11.nteHH.· n, prem.1~.re ^€ t,Qpe de leur util1~\t.loil'l p~.r

1 'e>X'gf- nism.e, on e t baaucoup moins bien ren1:u3ign~. "llerteiR

1es ferments mi.$ e1'l jeu sont oonnus, et nous en avons eit.e les pr!n•

eipG.\lK, il y a ·1.m. 111at.o.nt; ais on possede peu d, doru11e0s 'bien

6to.bl1el3 aur 1 'ordre ans lequel cea enzymeio e.gissent et sur l. ¹ r

tm.portF.u'loe relnt.1 e. ^{1 ..} ldn'o, en l9j4, avait .tud1ll la eo1s .ion

e 1 'nci .s izy onuol ··,1 u · par l' 1ntestin de 1 pin; ss b.aaant ta'IU'

1•1eolement. art1 l d· divers produ1ts d'hy olys (guanoa1n

inostne, uridine), 11 imagina e m'oan1sme suivnnt

f11S e sch6t1 f·ut reeo .u inexa:C1t, peu a.pres, par lahke.W et t<omit ^(1.36). La trave.Wt ^(l lom1ta et ^de ~akab~yaei (l~37 u

19J9), ^{mett~nt en vi eno l exi tenoe ci pl l1sietU'S nouveuux}

nzy es d n l

!ntestln (t'U.v rse · f!sa nase , -r1bos1dase),

-- 9

rendire~· t t.r~a complexe 1 •~tu.de de 1'as .. 1mtlation de 1 •acid.a cymo- nuol.~iqua •

. tltite 1'1n etlit,ion dG ln moleeu.le complete tl' aeide zymo-

ntu~llF)iC!ue et. la liber9it1on de se s conatitua.nts (base.s a:r.01.eetl, ao.tde J!lhospneriqu.e, l'ibote), 11 p·eut done se pro.d;uire una fot.iie ·de r~H~11)·

tion.s;, noua nout aommes propose de v4rifi$:r quelles E!Qnt>·, pa:rm1 ee.s reae:t.tons possibles, celles qui sont. qus.t'it1 ta.ti vement 1m.porte.ntes.

n peut. imaeJill&:'r troiS VOiee pOUI" · p&rvenir fl1 ltt ElOlUtion de OG ptG- ..

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aot1v1t~ relatiTte; ~)-doser, ~ (Jes inter.Valles de te·mpB

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I I

do:nnas, les divers produi\s d'hydrolyse de l 'aeide zymonucl~ique·

et" oanfronter leur ~vo1uti<:>n; 3)-suivre la degrad&tlon de .ohaeun des lllUC.l~Ctldea et nuol(iosides "art,.i:f1e1ele

et., p.ar ^UI'l rat.son•

nement fl oava.c t&re. e:t.n6t1que, reconeti tuer le ph~nont~ne di:u-:u:1 son

ta premiere m thode est veu6e ·a. l

i!ohee. . n sa,1t., en

.ertet ¹¹ qua lea enzymes sont. de nature prot 1que; par eons6quent,

teu_~ 1$oleroent ~·t, 1&\ll' pur1t'1oa.t1on sont des op,rations mnlaiei6e

au ooura deeqµelles on d.tl t se r·esoudl"e a des pert'~.e it11p0·rtiant.es.

On pe'Ut. 1 ;@.U m,.'l).x1mum, enr1ah1r le symt~me e:nzymati.qu.e en 1 'un ou

f'aut~e fe~roentJ jamale on n•arrive ~ 1.es is·oler tot;ts d•une· manl~r quantt ta.ti v:e •

Le second proc~dt1 exige defJl methpde$ st.leut.tves d@ dos~,

pertnettatit la fraotlonnenient des divers nuote.ot1des, U\101.~os1des et b~se·e 11bDee;. ee$ me.thodes ont 6t m1eea au point { ·er·i:t, 1))4,;), 1nat.s

ne •o1lt parven.ues l notre ~onna1ssanctt qu

11 y a. p u de temp.a,

·' ot t2U':u. en ao1t., un 'Le1 dosage oat exoee t.vement tong e' J,aho-

:rieux; on· s• en oonvaincra alst'Hnent ei l 'on se rappell• ql3:e J,.e.s.' der:l.Vt'i$ nuC1§1qU$8 son1/ d.&S Oc:>rpS de $Olub1J.i·t.e tr•e V~.:1s1ne et dont 1e$ rl!aotione de pr§oipite..tien sont prat1q,uem,en\ 1dent1ques

pow teu41.

10 --

...

aeinftsi t !a t:t'-0>1 s.ieroe m~thod,e; apz.c)s. ~voir· p,:repar toute la a.111• des nuo.lar.:rt.ides,, nual€losi1des et bases puriques 11bi'es., pa:r ~Ydli'olyse chimique de 1 • aeide z.ymenuat61que, QbaoUtJ Ill~ Gee oompose$ a etc s0.umt.s h 1 'hy".rolltse ter1nentaire et les eons~ant:es

oin~t..t·r;a,u.es <U'!>rPesipondantes oaleul~es. De l' interpr~tattcm de ces

eonst.antea 11 ef3t posaible a.lol"s de tl~duire un s1eh0ma r~aet.10.nnel

qui intel'pr~te les f ,1ta d'une maniere cohE!irente.

!~n m3me temps.. nous avons eu l 'ocaa$1on qE;~ mettra l 1aeelii)nt.

Slll" <llVet& aspeota du eata.boli$me nucl~i.ql.1.e oQn$1d.~re dans ·sotl· en-

'$emble. N'Gus avons, notamment, etudiil 10. probleme d,e le ti~h1d.r-a•

s:pe~i,·J.q,u.e de 1 •aoide ey1llt>nuelelque, s1gnal6e par il*suge en 1935-36·1

. .

.

-bien que nay.ant fa1t l'Qb4et d'auoune J.nvest,l,ation uiterte~e-

un 'l'~le pb7iiiio1agJ.queme~t, ple1n d

1nter0t.

(lltait ppele.e jour Nous avens eepenae.nt . · pu nous oonvai.ncre ue ea fermei:it n'&at pas pr6sent do.ne l,~ m'tlq,u~u- se 1.J!ltest.ina.1e

1' 1.nterpr. tat.ion de lt'a. r · a.etlon ·~tant d •$ille#$

beaqQO·tip lno111.s simple ,que ne ·'1 'a.vt.it pense l·e ohereheuii j,epoaa:ts· •.

·~

H!AP!TR""'

•

A- Tl'. .N :OIU$ suas-Tru\'l'~). ft

O~OQ~OOQOOO ~o•ooOQQO~•OQ

1~a structur@ de l •ae1de zy onu.elltiq_ue n'eai pi.a.a encore.

abaol.umant eluQld~e ·J.)Our l • inste:nt. On sa:Lt n~amnoina que eet

ae:t.de est, le polymire d'ttn compos.e de base appe·la tatranuol,O'tid ·;

le tetJ-anu.oteo·t16e resu.ite de 1 'wrton de qua·tre mononl.l!>ltiotidea

Base azot6e - ribose -

,.

soit ua d'"·~1v: de lQ pyr1m1d1nec el.le e$t urd.e par un~ lia:1s.Qn.

gluoea1d1que El l fonotion eerd.-ac talique du rllbGsc&. Le r!bose;

est e~cacn•e est6$r1f11J, $n poa~~lon o 3, par une molecule d!aelde orthtipbo .aphorique. n a done:

/

~ 0

... o- -on

I 'o.a

Sase N- H- liOH-OH-CH-Oil20ff nuelaotid (et) I O___J

Dans le t'~tranuol otide, on t,rouve une al t$rnanee· de b -

Se Ii!! pUl'i (!U$11 ( · .t5ninE;?, OU 6-am,inOpUrtiJ'l$; gue.o1ne, OU 2·-amino•6-o:KJ-

p~ltlrttl) et, pyr1mi '1Queei (u ci.le, eu 2.6-tUoxypyrim.idines oytoeble•

ou tli-t\Jnine-2-o:xypprietdine). Les quati+e nuoleotid.~u~ sQnt l:lnls

baa.e$t

I •

I

I

I

m OH

<t>N= C-NH2 O=P/ OH

H6 f&1d- ^N H H H\O H 1211J II 111'-cH I I \I · I

(31N-C-N~C-c-c-c-ctt OH

~· {9j ["

8~ :__J ...

HN-==C-NH O=P-OH

1e11 m1 · \ He 121co . H H lj Q H

1s111 I I I \I I

HC-. N-c-c-c-C-cH20H

IW

m . r ^{\O~ (•J}

1ilf <.,c,o ^o-P,OH

82 lij ..,fi1N~~ ¥ ¥ ~ ¥

N- C-N -C-«2_:-C-C-CH

0H w

r r ^{0 :_]'}

OC-NH ~OH

_, I '\.

~w ^{c,o . l ¥ 1\? ·~}

He- N-c~c-c-c-cHaOff

,., a)

r) ow;,:_r

-- 12 --

entre eux par ast~:rifi~a.'bion c l~ fonct.1on a.e1de ^mecona ·ire appe.r- tenant a l'un et d'une fonet1on aleool appa.rt.enat'lt ~u ribose de l. •autrtl·; l.'ind 'tert in~:rtion subs1ste encore sur ltt pG$it,io11 d& la fonotion. alcooliqua e.aterifi~e (en r:) 2 ou ~) et su~ 1 •oi'l'dro dans

lequal. sent, razig Ens lea ha.sea· azot as. W~anmoins les ti:iava.ux tie Leh~nann rendent t:res vra1semblable .le. f'orinule de etruotl.lre donnee

et.-oc;mtre; Ot.ltte. formula. n'est d

ailleurs qu'une vars.ante de eel.le propQSee ^J)l\:V l,i

evane Q li: Sui t<:f de recherches treS de.ta11le$S ( ~) • .

Gullan (19.45), flEI basa.nt suit le~ rClsult~'Lta de .l' 61 otro-

t1tt:ir.d1on, adm.et osp<1H1dant ue i 'un des quat.:re l3hosphor•es du tet.ra- nucleoti e eet. 11& stmult~~n4ment a trois hyd:roxylee 11Aloooliquee;

aeci ¢on nit

une fornnale du type:

·uoi q,a • ^;ll en so.it, on est encore mo ins bien renseign@

s:u.:r le mode d'union des, tat.rsnuol~otides dans le polymt\re. On sa1t eulem.ent que. ^d 'apr&a 1eur or1g1ne, las ^Gtaide,s zyll\onuoleiqtie~ de

· d1 v·ersae sources sont f'or ·es par l •union de , a ^lS t6t-ranucl~o/t.1- de s (i;let.oher ^eti Gal.la.ad, 1944); 1 'aeidlo zymonuola1.que oel].ult11.ire

e~ra1\ tti&me un m, J.ange •au moina· eux polym~res dif:fllre:nt.s. (Qhan-

tren~e, 19 6).

Pour lS"L prt'pnrat1on chim1que dee dertvi.\a de l 1&ctdE;) zymo- · nuole1gue, il eat important de oonna!tre la seni!llbilit~ d.~a diffc-:i•

r~nta \ypee d. liaison alllt a ents d'bydrolyae; la liaison e$ter- pl\o$phorique aera fnc1lem~nt seindee par l.e~ baaea, t ndls qu.e la

liaison lueoaid1que est. sensible , ·wt. ;. old 111, comm.e u. ^{ast d ragl}

en chit:Ue orgc.nlque. O'est. 00 ui permet une hy~olyse

( u ) On trott?et'Q un exeellente ravue ·:' l • ~taf, de 1e. q,.estion ans

·1 tr vail dw G~6gcoire (194,..) et d n.e 1

artiole de, Gull.and

(19 5).

'' 13 --

tiolynuil~otide

©.rt-,

action peu prolongt,;e

mononu~ltiet1des

oH-,

action prelong6e

· nucleosit;les + phosnhates

!n'" ~

basest :r1bose

t,,es dc; r1v~s pur-1,qu.es obtenus de oette manl~re sont seua leur fol'- me amine&J en peut en r a11ser la d6sa.mineticn par la m~thoda e.le.a-

$l{!ue fl 1'ac.id.. 111\reu,, le noyau purique et.ant f'~S:;pecte }'>titlldO.nt.

cette operation.·

Nous d:lspos.1.on·s d'environ deux cents grammes d'un acid.e nuel ~que aommero:1el brut.; les prinotp les impuret "s 6ta1ent eena-

ti.tu,a. par d,es pFotllinQs, des ^~·eli11n a naturelles brunAtree, a.t du l~pu.lin (reeonnr.issable a, 1'odeur).

/'

la• iZ'.limination des protll.ines se fni t sirnpleme·nt n sol.u- lUl.i sa.~ 1 'aaide eymonucl~ique dans une solution d'aaetate d,f3 ao- d.iurn .'ft 80°~; a oet.te te.mperature, les prot61nes ooagul.ent rapf,de-

mel'J.t et .peuvent &tre sepa'J"4ile$ m~oa.niquement. POUX'. e.lO:lgn4'r tea rfb- sin~s, on. effeQtue la pr o1pit t1on de 1 •~.eide zymonuol.~ique pe.r 1'a1oool.; lea rt11s1nes restent en solution et oolo~ent le l1qutde

hyd,Pealooollque surna.geant. Les polyosas et gluoosid.e·s, cr\11 font aventuellement p,_..~~ents et p:rovtennent de la membran.e oellul.aire · des levurea, son't tilim.1.n~s en l'r,cipitant 1 'acide nuoll§ique par un

peu d. 'ac1de ohlorhydrique ooncentre. n a 1ntertrt ~ e·f,fectuer la tael'n1~re pr~cip;Ltm.tioti pe,r l •.a.14001, la pr .oipita.t.1on par l 1·acide "

ohlotthyd;rique donmlnt un oi(t nuale1que tres dense ~t .qu1 ref.lent

8.ssez ~!en d •humi~.1.te.

?1 om~ CW}.iN ?i:QIH.t;;

Oiaufter JOO oc d'un~ so.lution a 1o% d.'ae~~tatie de N. et y verser lentemen..t, en agita.nt, r5 gramme d acide zy.monue1€d.que;

0.tnener le liqU1de a ^{8 OQ et le maintenir} a ^Cette temperature pan- . dt'il.rtt quelquae minutes. Pendant oatte op"'rat.ion, il se produit u.ne d6polymerisatio.n partielle, ma.is qui eat e'1.ns 1mpor&i,noe pcu~ 1.0. £:1ui••

tea.as o}?lix-ations. La solution est refro1d1e et centr1fugee, dllt

a ^q,uinze minutes durant, a ~, ^{.50 - .• o 0} teurs/tainute; a.pres t\l.iminmlr.'..Jlf t.10n du oulo~t proteique, l solution cl ire est filtrae aur. I 'na. G}·

Le Q.ulot. prottlique est retrai t.0 de ma.niere ident1que pa.r 10 ve de so:.t,u.t::l.on d 'asetate, de ft~qon b. redu.ire au mini.m:wn lee pert.es en eei,e nuel~!que.

J,,os solutions filtrees sont reunios et on en prE;oip:i.te l

acide nuo:l~ique par c aux volumes d 'alc0ol 94° contene.nt ~. · d'HOl.

ooncentr6; a.pres ·une aourte cent.rifugat1on, on €iaarte le 11.quide · ora.ng6 qui eontient une bonne pa.rtie des r ~sines. Le culot. d •acide nu~l,1que est remis en solution par 300 cc d'a.oGtate ·a.e Na oomrue.·

preoeue1nment; on centriNe: et rejette la pa.rtie inaol.uble; puts an f:ll tre J.a solution; la prec1p1 tat ion est etfeotuea oomme plus, Jaau.t par deux volumes d'alaool-liCl.

t.e cal()t. de eent.r1rugat:lon est mis une trois:lu.\rne fo.1s en solution dnns,.·l'o.o®ta.te et la m!te suite d'op-.4rationu recommen- c~es jusqu'au momen:t oil 1

a.1cool de pr·oipita:tion ne eonti~.n1t plus de r6-eine.s•

. on effeatue 511ors la pr60ip1te.tion par 1 'aeide chlorhy- drit,tUe aoneent~ ( l./l;)Ja. du volume de mi>lutJ.on), en a jout. nt ev~n-

tueJ.lement un pau d•a1oool pour evi te,r 1 •agglomsration du 1:i.reolptt€t;

le cu.lot est oentFlfuge et remis en so1·ut1on par 'Wl peu d.c. saiude oonoentree. Oet.te pr6e1p1tat1.on est effectuee une seconde fo:t.a.

La erni~Pe pr~oif)itat,.ion est efi'ectuae par' deux volunles

d

:aloo l a ^94{) i apres centrifugat1on, l 'ao1de nuol~ique est. i.av6

troi ^$ :tois a ^{l aloool} absolu dans les tubes a oent.rtf\\ser, pl11 s se.oh·e dewc fois a l

ether. La poudre amorphe jest enfin s Oh'e dane le d esiocat&,UI' a Vide, SUI" ~O.ide Sul.furique. .

entlement: 4o a 50

.II·.- ,l?raparation des I'iueleotides pur1quQ4.

On obt1ent lea nuel.::otid a puriques pe.~ action d~s ~loa- lia ~1lu s sur 1 '.a.ctde zymonu dl.tflque; l 'hydrol.~ree ne do1 t. pa.s •tr:e

1d; ltliJrer

't!rop p:rolongele, sous pe!iiB'les nuolaosides ou mime lee prodU.1\a

d

Me d~grndatio~ pl'us protonda (ouverture des cy di.es, d,af:lamJ:ng'\tion et O~·datlon). La ee'pal'f,lti0.n des nucl~otidea peut ^S

flffe.ct.uer par eristall1111ation :r:racttona6e de leurs eels de brllCine (Leven.a·, 1.919) J il es·t Cepend.e.nt. plue eommode d'ut1liser la metbc>d.e de Steudel et

1ser.

Dans l)ette m'thocle, on ~ ~a.11 ae avant tout la separat.1on

tte 1 'a.·c1dta ~ZQ"l.iquo en se b ·sant aur son insolubilit~ ex'l pr6s~ee

4!e.o.~t1iLte 4e soud~·. ^{lea utree} nucl~ottdes rest n1't en so1u.t1on

et

on pe·ut alors pr6el!\11ir~r, 1 'aclde ad.s.nylique. par 1 'ae6tat.e d· pl·~mb~

-- 15 --

1..eei dElU.."'11 acides sa~:t ensuite pu:r.if:!lfii:i de f'.aQOll identiquG, en 1es pr~c!pttant seue torme de secl de plomb; c.e der1'iet- est. d&tr·uit per

·'

1 'h.ydrogene aulful' , avse solubil~ sa ti on cJ.e. l 'm,eide, libre et prici- pitirt..ion du sulfure de. p.lomb. La so1uti©n filt:r(f1.e est ~vaperee

so:us v1 de et le nuol 6crt~ de pr~ ci,p1 te apont.anemen't, eu peut ltx~e prr€l- ·

e&pt·'ti· par 1 •a10001 ~ La,' mt!ltboda est pt>a'bique et. d.onne de bGt'ii ren~

d~'ments.

i\.ssaz rtlc~ment, Buell (194J; of ^{Suell, l$fS{7) a doM.€1 dt}

nouvel;t.ee metnocies de. pr ·paratton dee nucltctides purf.ques; 1.·~elde

att.~·rlJl;l.que, notatmnant, est .sapei.re soua formo de pia~ate o.oin1tlexe d 'Alunilni.um. On o'bt.tent a:ln$1 des nuoleot.idas eri stallt ae ^$ et pair•

faitem.ent pu.rs; ma.lheureusement, les rendement.s sont t'a1ble$ et la

m~tih.l)dEI eat surt.out utile lorsqu'on desire de pa·t1t.es quant.1tea seut:ement de ees oomp.oa,s.

MQmtl Ql?nlti&iQIRi •

. . !)e g:vi:unmoa a 'ao1d:o zymonueleiq,u• sont stu\\pencl.ue dan.e ~oe

ee d.'ellu $t ~;fssous par la soude aop.atntrfe juaqu'a reaotiort lle'\l.tl'Et;

on a:Qoute a.lot's I :eo dG soude l 33it ^et. fa:lt bou1l.11P 10>s.c>:i,~t.1on.

l ~Ci'flWK: d.urant, deu:J. he:ures. J pre ^SI refro1dissem$nt., on· ~lo~Qne p~r Ci!lti~l'ifqation le preoi:pite q111 s•·e.st r·or01e et on dissout dans l~

solution ~o grammes d'ec~te.te de sodium solide; le ml1ilaDBG des nu- OleQt.1des est, ln:tmlldiatement p:r~~~ipit~ par 1,511tr~ d'a10001.

A1rr&s o.enir.1fu.gat.i~n, le cu.lot est. redisaou1iJ paF· 20 ·eo

a·• eau.J on neutrali.ee ·1a solution par· l 'aeid;e aoetique J,.aq·t.l' au mQ- m~t oil le ~~u1ylate · oommeno.e A pl'l!iQ.lpJ.ter; on disseu.t, eneore 40 i

.!JO g:ramttu~s d ''e.~·~i:ra't-$ de .$od,tum solide dans la ltqueu·r. t.e m&lans;e

eat abandonne 24 h~ur$s a QClC; par oent.rifugation, on sftpare. 1.e ou- lot (guanyl.ata de S~dlum) et la solution (adeinylate de ~odium).

1.) ·~ ~~ (Je Guaeyl 1q~e :. Gua.n:l,ne- [d-ri bofu:ra.no si d.e-;_,~ph.o sphei:, t!j-( 9) •

. .. Le cu1ot · ~e.t. d.l saoua dan.s 50 ^Q e d.e soutle ~lf, pul s ()ft »».,_

oip:t\t l$ nuo1,etide. par 500 co df.a1eoo1. Le preatp1t~ &at sti·par~.

pa't' 0c;u1~.is1tuaat,iQ~ et r•mt.e en solution dane l'° co. d

e~u.; e.ven\ue1- 1

leme~t, Qn een't;ri,tuge et x-e jet.te la part:le lnrnoll.\ble. La ~~S4t.,1 ta• ,- t:l·•n ~ .. :1.•a1eo~l.et lE\ mi~ en $olut1on sont rt1p~t.{;·e$ Jusqu a 1'4'.i>b'Lel'l,

t1.0n d 'un Pf&dutt, b.ten ~l nc. · · .

. · . :t e.c~d:e gun.GJ;L:J.qlle. est a.lore p.:reeipit.lS p~r une. ~uan\1t~ .

$'ufftea:nte d.'aQeta:tie de plomb (solution saturrfje) et cen:trifu$e1 le ' g:U&nJ.l~t.e d, plOmlJ i,nsoli,uble est le.Vt\ deux to!. S a l, ^t eau. t1&4EJ

.,~18

·\rlJs 1"1.nement d·1~e;riee dan.s 200 ^CQ env'!:ron d'eau. ~]ir&a pr.~~.iplta• ¹

t:t;o~ oomplM1e du. plomb paJ' l •a..,1de sulfhy.d.riq'-le, on ~l(f18ne i-e, su).- ,, ful'e. ~nsol.uble et on $h,a~$&·l' exo&s d'aoide s~lfh1td:r·ique ·par ~pe ·

co;~tie ~b)41.itlon. La solutlon aside .du l'.lmcleotld.'e eElt neuf.itt$l10Ge

l,lllll' 1 •~:u~mooi~que,· pnit;s. oonoentrf.e, ^pa11 ~vaporat1on soua vlQe ~. telnpe-, nt.ure mlltd6r6e ( 4o•c). ^·On r•nou'Vli91-le. la puri:f'ica t!Qn par l• sel d·e p1()~b,. (.ft .ii~ •o1u,ion o'btsnue &st oonoen·tr&e syua '1,d.e . jus<r'2'b. ot>~- ·

&! steACJe .dt sel. e (10 l 2Q oe); pnza a.deli tic>~ tt. e.l·Oool :absa:Lu (10 ' . 1!j vo:;L~mes) et AS!l .1tt9n, la ge).Eie ~e transtorme en un, ba\d,1l~e ·

SfiUli""'~i'·1tt.a111rn~ qu'()n ~~~a.-~ ~ar oeQtr1.tu.g~\1on. · te mxol~o\lcte EU1t

lRV{ dewc: f.ois i. l 1'1tf~Cool, _, pui!$. dewit fols a 1

~il!i~r, et S'oll&.

--· l~ --

lh.1 1.a aolut1.Qn m&re hydroalao!;)l1que, on peut sneere r~ou- p(l;rGlr ce petite ^la quant.1 t ,s d "aoide guanylique sous f'o1~me. de sel ^de plomb.

6 ,So .gr. ^OU 8 ff;

L,a liqueur do:i:1t cm vfent de eep. rer .. ~1e gu':nylate. est add1- t~onn~e d

ao~tate de plortib (solution ^Sf.ttUI' e) j.usqu a fin de prae.1pi'iil tation. t'.ndenylt.tte de pJ.o:rx1b,J~.et oentrU'ug6, lava deux :f'ois 1l. 1 ^'eQ\1 ohau.de, reni.1.s en e1ump$nsion fine· dans l' eau, et. on pr· cipi te le plornb par l ~aa$de filUlt'h1dP1Q,ue. A:pr&s avoir sfip1M.:•' le sulfut'·e da plomb et ohasse l'hydrogene sulfure par ~bullition, la solution est netltr~.li site. et eonoentree, eomm.e pour l • aoid.e gue'l.nyliqu.e, ju.squ.' a ·

u.n. volume d 50 cc env&ron. iar aa. i tion.. d" un volume triga.l d ., a:lcao1 ab.OOl\1, on aeh~ve .:le pr oifii te.r lee \races d' cide guanyl1que qui

~bai ste:rate,nt. enao're dans la. solution.

La purifiuation par le sel e pl.01nb est renouve1ee de:u,x foi , Qpres quoi on ooncentre le. ~olutlon Roide sous vide, jus·qu.'l ..

corHl\;l.st· nee leig~i-ement eirupeu..;e. On peut laiseer 1 •aoide adfnJli-

.que er1·stall1$el" de fia solution, ma1s, oonnne dans le cas de l aoide

gua.O.fl.1qu.e, 1

0.p&1t0.tion est t.r·e .. longue. 11 e$t pl.ua comm.ode de

.oonoentrer la solution dav

ntage et d'en preoipiter le nucl oti~e

pe.r u:n excea.··'e.10001. Apr~a 1e.vage a 1

alcool et 1

ether, on. s6ohe

$otte vida .... ia.ur aoid.e su furique.

Remdement: 5,70 gr. ^OU 4 /&.

:s)-Acide A8inttwi19ue1 "'tanth1ne-[d-ribofuranoeide-3-phosphnt.~J-(9).

l},50 ^grammes d'acide guanyli ue sont suspendus dax~s l~iO ec d'e u. et add·1tionn6s <le 35 00 a'e.cide aQetique g,l.s.oial; la gel~e! ain

~·<>:rn, f est ,, g,t,tee m.oani

uement et on ~ .. joute goutte a goutte, en .. ,

314, 4 :b,e:ure environ, 25 e·c ^d 'una aolutlon cont.en n'i $ grammes de nitrit dEt no·tas~1um. fpres a.d.dftion eomplite, on ma1n.tien~ 1'at1·

tatto:n f5 S,.jJ heurel$ dUt'l\ll.l.ta j;..,SqU

a la @6S""ation dU cl. gag,men;to·~-~O·

te et 1 sp0.rU11on du earactare vi squ~u.x. Apr~s repos 'a ^.1a ~UuU.eit'e.

on filtre l$s cuelques floaons d'ac1de guanyli.qae non d.6e·m1:ne •

. La solution ac1d.e eat ex otement. neutr-• .1.1 see pai- de· 1.a. ^SQ'U•

{le ooneentr~e.- et on

eff•ct.ue ·1a prfie1pit,ation u xanthylat.e de·

;plQmb par l. •a~flto.:te de plPID'b-; a.pr6s centrifuga.t.1on. l~ pr Cip:l.t.~ eat iave tro1s £,01~ a 1 ^t eau froid .•. ztemis en suspensi.on ft.ne, et. d'compo-

r::~ ,par un c:ourant d'aclde auWhydxi.:tq,ue. t•exof}s de gaz a\1lfhydr1~~e

est Qhasa" par airatign {ba.rbottage d.'un rapicle Qcur·ant d ''"':Lr froid.); 11 est JMHmiie:1 d~ ... ~e pae ahauff'e~ la solution aotde .•

~es nuot.~ot,1des d~aamin€1s,. en· effet., sont bea.ueoup plus sens:flbles e.u¥, ion.a hy-dr:0geµea 'lue ~. ous leur fo.rme aminae.; le~r hydrolys.e, en z.1bo,se-)-faho$pl),nte et baEte·. puriqu.e se fai t trlu~ rapitleu1~nt en mi- lieu ..,.c1<1e at h co.ud (t.revEn-1$, l jl). ·

. La solqt:1on e.c1de a t~ divi•ee en eux pa:rtiea altquot0s

·OO!'rea~ond:!i.nt, l'un~ a ·.aux. gram es d,$ l'.aotde gw.·u:iyl.tque in1t·1at

(vouJ' l • 1s9le~sant de 1 • ac.lde Kanthyl,.1que}; 1 'autre a 3,5 gJ;1ax~e~

d a.oid:e su'lnyl,1.que (pour 1a p:r·~paration d ribose-phosph~te: p,.18).

· La eoll,l't,ion co~respondant & la nremiere pB't't1e a11q~ot..e.

a ·~fitl1 ax ete ent neutral1 e, et· le nueleot1de. p\U'ifi~ W'l-EJ. fQla

e.nQot'e, p~t." l• eel <te plOmb. La solution o.o1i!e. t!cmti c:m avalt obp,e-

S~ ·l 'a"a~e de gaz sulfbydri~ue$ a t6 amen~ a pR=.4, (sel monos'l'J-

d1qUl'I)) ~·}· l.e velu.me ~eautt ooue ^vide, a terap~rature .. ^{t.r s ba$ ·e·} p.f;>UJ' _

6vit'r l hydrolyse (;;.$

L'aelde xanthyli ue p.eut aiera At-pe

11

p?J001pit~ de sa solti.t.1or1 co'1o.entr ie pal4 le m61~.nga a,loool a'beolu.- M .. he:r."' (5 v.olU:mms); all)rem .· votri t6 s ,dhe a. l' ~ther, puis seua v100, le· nu.eleol11de se l.).roaente seue :f'erme d'une ,oudre blanohe s~mi-

c~ist lline.

Rendement: 1,17 gr. ^OU

Lr~ d samimltion de six gromme a'acide ad~nyliqth~ a et~

real,talle El~30te·ment .... comme la d&.s~min~tion de 1•aclide guanyl.ique, ·t en 0baerwnt le .m&m.e~4 pr~·eautiC'..me. b.pr~s purification par lEI· sel.

de plomb, l-ef\ deux tiers d.e. la fllelution acid.e au nuci,ot,itl·· d"1e~- min·. o.1it Cit~ trait~s a, par&ment pour l pr~par1;1tion du r1b©se..;phoe,- p:tiete (p. l8 )., tandis que le restant (2 gr. d:u nucl~otide) a sarvi ~ 1·' 1 sol. 'ro.ent de 1

a(lid\S lno siqu.e.

Apr~s tme nouvelle purif'io ti<:>n p~X- l,.e sel ·de plomb et cQn•

oeniratiotl d 1· solution, on p~ut pr61alpi·ter le nuclSioticl oeiea.mi.ni ..

par 1~ m~lang·e 10001 absolu-ether.

Rendement1

.

I :tl. - l?r6para·t1on du Ribo ee-J-pho s•pha.t••

Cb.eide d-ribof'qrano s!de-3-pho aphctriqu..e).

Com.me nou~ 1' a.vons deja sign.ale, .las rtucltioi>idea d~·siatrdn.llfla sont a1senient hydrolysris, en ia;olut1on aqueuse at ~ leur p~opre _,, pH

(a~j..tJ.e l.Uare), avea 11b ra.t1on du ribose-phospha.te; le. 1ta1so~

e·~ter-ph<H!phorique n'.est $O:l.nd&e que be·ucoup plU.'1 lentement. en mi- . l"eli, a..o:tde. l?.rxr c~imt.re, 1 •hyd.rolyee des e.minonuoleotldes e.n .solution

QOi·d.e eat i~nt.e, et. l(:ls' deux tywes de liaison (g1ucoside et $$tet-

z:iho spll.o~lque) mont euverte-s aveo de.$ vi te.saes ptat..tquement ~d.ent.1qUEH'llJ

lib4t·r~.nt sil'!\\ltan~ment lea tro1s oo.n.$t1tuants: d-ribose, aold.e o;r:i·tb.Qpb'9spboriq'U.~, ta.minapur1ne (Levene, 1931 a ^1933). u. ^{faut et.-}

gnd.er q,µ,~ i.en11'aw

a et,. Kom1ta (1936) ont pu r~aliser J.a pr~.pattatiio.n du ~U:>9se-phospb~te par hydrolyse ferment.a1,_.e, de 1 •aotde gue.nyliqu,.s.

: eependt',nt,, les rendt·nit

mts obtenus sont trop faibles pour q,'1e l ^1opa.;.

t-t\tlon ·soit d' :tnt.&ret prAltique.

Les eidee Xij.ntlhyl1que et inoaique de l.ewre fou.rni~ee.~t pal' hydrolyse le mlm.e ti.Cide ribose-3-phosphoI'lque, oea d&wt nuel~o-

.t'i(f& s .ne · ·.1ff r ^r.it que par la .baQe puriquete

7-8 --

Ln solution a.aide d' aeid· · xanthylique ( oorre sponde:nt ill

;,,!;) g.rr:mmes d'aoid.e guanyli .ue: p.16) est ohau.ffee b:tt!'«J*N.x au bai:n-mai:oie A 5 °0 pendant. ql,liatre jours; a.pres ret~ro:I.cU ssetnent a la glaC1 ere· pendant une nuit, oni fil tre la xan\h1ne l1br~ qui a p?•'- cipl t.~; lEL x.emthine enaore en solution est pr~aipitee par un l~gtn•

ex.aes d'une solution l 5 ·· de su1f'ate mercurique. .~ pr~s voir se- par. le pr~,o1pite, la solution e1a1re est soumf ae A 1

ag1tat1.on mi- aanique et n0utral1s~e (a.u tournesol} pari du onrbonat.e de baryum sol1de; o~ aentrifu.ge le sUJ.fate d.e baryum f'orme et i ' e.Kces d~ ear- bone. te. Qn eature t\lo.rs 1r.~ solution d 'acide eulfhydrique 1 pour

~loigner 1•e.xe&s d11ons n1ercu?'iques. On eha sae 1'exoes d aoide sulfhyd1'1que -pa.r aeration at on a.1oalinise. l€lg~rament par une solu- tion oonoent:r~e·de b ryte (ph(!!nolphtaleine); o.pres filtration, t~

solution limp1de est,.. concentr~e. S0\4S Vide ^jusqu' ti. un volume de i · ee , On filtre le carbonate qui se a6pa.re par refroidiS~·ement et. <)n p19'~1oipite le riboae-ph.Psphate de baryum par dam~ volumes ^{cl t •} 10001

absolu. r.av~ d.eux fois ~· 1•a1000l absolu et deux f'oie a l

~t:tui.r, le ribose-phospha.te est enfin ~6ehif; sous vide.

endement: 65 mgr. ~z4 $~ (ca.le. p. ao. guanyl.ique) 43 % (calo. p. ac. xanthyliqlae).

La Solut.ien a.aide d'aoide 1nosique (oorrespondant a 4 Qll"•

d'aeld.e ad~nyl1que: p.17) est maintenue a une douca ebullition

'pemdartt 90 minu.tes. A.pres re.pof:1 u'une nuit a ^le.. Glaeiere, o'Q i'il•

tl"e le prtA>ipit · -d.'hypoxanthine; les opeirations ultc§r1eures. sont id .ntJ.qUE'Hl a Gelles de 1

0pArat1on pree6dente.

I\endernent: 5 .o mgr. 12 %. (cal c. p.

4 ^{-I (}

J ;¢ ^{<ialo. P• ao. o. ~4d 1no nyl1que) .. 1que).}

1 ...

1

gramme de t:'ibGS$•phosphate de baryutn son\ diSSQUS e

froid d as 4!5 ^CG d' eau; on oentrifuge la part1.e inaolubJ.e et, au liquid(: clai.r, on ajout. une eolution ooncentree de ba.ru~e jUEHi~'ll fin . e pr .oipit.ation d.u phosphate. de baryum. On filt;re ce dernier

et on .neu~raliae la ~olution exactement par 1

a.aide· SUlfur1qu.e O,J,NJ

apr~s avo1r aloalinis6 par ).a bat'yt.e jusqu'a pH·

on cEmtr1fu.;e. ' le sulfo.te de b ryum, p11is on concentra la solution aous vide jus- que l.$ co <ibnviron ( 4·0°0). la solution ahaude, on ajoute W1 peu de no1J' an:Lmal et Qn fil.t.re a al'fiidJ la ribose-p~'loephate 4• ba.ryua e$t P,r eip.t.t~ pat-9 (leux volumes d' a.looel abso1u.

Rend.erne.n.t: 8.00 mgr.

oul" la pr€~paration des nuol O>C!ides, on ne dispoea:it.,

jl.lsqu,·•11 y S> u.ne dlza.1ne d'e.nn.6es, que de la m6thodf,( d or!te pal'

N=C-NH2

I I

HC C-N

11 II

~c

N-C-N---CH ~

H-t-oH I

I

o

H-1~

H-C

CH20H I

Adcnosine (nucleoside d'adenine)

HN-CO

I I

H2N-C-C-N

II II ^:>CH

N-C-N IH ~

H-C-OH I

I o

H-1-_:_J

H-C

CH20H 1 Guanosine

(nucleoside de guanine)

..

r ..

-- 15) --

. ^{. '}

Levene (1910);· qs ... '3etto t·chniq:u.e. l aei e ~ymoni101oj.q e aubtt.

l 'hY" ):IOJ.y~e "tnttton:ta.oale a 180<:! 1::). Out:re 1~·~ daaa.gre ^Gl: t1on 'brutu.1,a

t: e , 'a.el e nuclr2iiq:u@, avec ~ 1minution de~~ 1~e1nlc.\lme;.tlts, oettca m~tho- d 1r~!U.t. eneore le 4i:, .. remont d.'j .. mpoaer d0 t:ras 10.bo:nJ.eux frEi.o- t1on:nementa et d

1nnombrables purif'ic.tions •

. a tr&s €11 ··g •. nte m."1thod~ de · redereel~ (1.9 ·t} e·t 193 ) a

done €tt 161, bi&nvenue; Brederee a n il.ntrl4 qu

on peut. extr·a1re dee um.anf.la.e dou.oes un priip 1"& t.,1on l)bo sph .t.natque aueeertM,.ble ~ 'b.y :ro•

lyae.,r $pec1:f'1que ent 1 'aoir.l zymonuolt ·.1que en nu.el.~ 1.n~tdam :o;vao (1

exe.elJ.(!nts rena.emeitt ; l

:tsolament des pllodu.itm d.e la rt{act.10,n s fait ·tri> 11£mplem.ent

pm.• C0l'1C!3ntratie·n du m.1l10U :J:Tb@.Ot.ie>nn.@.1 i

pr€~clp1 tat,ion apo~tnn _•

J)n 1941, B~edereok r.~ rnontr qu.'on poLaw.it encore su.beti- t\le:r i. le. p,,. pa.ra\1.on fe'1'mentrt r. une solution queuse de ptr1r1..ne#

. 1• op~:r~itiot1 est. plU.$ o,0urte et ie t' ndements ne eont pas uwine bonra. e'ee.t oett.e dex•nle'r'e m thode. que nous awns ut.llisee, fians

~U$ U1 tou.te.fols a t"eprodU1~e lee ~ndements elevis que it

edereek la1:s~sa1t- pr · o1r ,(11 ~t tonnant, d

e.illeua:•s. qu. l~ r$ildem:ent n gue.no~~lne. . u' u. · ^{ci fJ} tl<tlpasae 10

d 1"1 qi.utnti ta ~e~e .mee d<-xnr."'

l •act· & nuol e:t que mi.$ an oeuvre a ) •

o · gt-amm d'acide zymonuol i<111e, staspend.us da:n$ lOQ co

d 'eau., ^sent di s.sQtta pnr 10 ce de pyr1 dine; ll:\ so.l ~tian es Qb .uf-

f ~e ~. ·refl"WC p.end.a.nt l O h ure , pUi~ vapo~ .e l see sou vtd(i'I

(40 ). Le r'stdu aut reprii:a ans 150 oe d'eau, dissoue y·era 6 ~ •

. . t ori ·eentz-tfuge

part.ie v ntuell.e eat. 1ru:lolabltH. apJ-es un di-

J~~ ~e.;;, heur~a h le. s1nc1 'l° • on centrifuge la 8':1anos1·aie qui s' eat. e@p~lte • Les ux-mi)rea aont con~ .rv es attn d 'en eatr·Q.!.~e 1' d n~slne.

l )- g~,o ln.er ··

·Le Qulc;>t · 4e oen.tr·ifugat1on est 1uv' d~ux fota l l • eau g;t.aee<a., pui;. %' 1ssous pat' 75 oe 'eau ~ l

~bull1\1on; on filtt'e

a ^ohfJ.11111

^pUiS 1~1sGe cr$stn1U.$er l guano~tne ' la gl ot~re. On la

or1$talllse l.lft~ nouv lle: fois apr s fil tra\ton Q.e l~ $olutton

en p~ a noe e nolr an.\m.l.

. ·end&ro nt. : ^OU.

... ' .

... ~~o --

.

2)- 1 danosiQei1 · ·A Alline- ~-ribcrf u!'rei.nord.11eJ-(9) •

. l)a · 0 . .$U.K-m~res,

pr~ctpit.e, :ree phosphm.tias par· tm0 sol - tiGn de bfl.ryt.e ~at\.U."ee et chaudct, ,j squ ~. e.V'oir un milieu l0g&·rrr:~- ment a1~~11n (phfinolpbtt.. lf!J.n.); 1e p·rAcipitf.i ea~ oent.r1tusll et 1· v .•

tes $Olu;t1orts ot,eJ.re:s r- uni.es aont ~vapor~es ~ a e f3Qus vida (4

~.,1© .P©t111.dl1 G·St r·eprie (if:UlS 30 GO a• ^{Eiiil'tl a .5c;i}

pu1s abm.ntlenrn( une

re & o<»; a.p!'.'as avc·tr ftl trA la pet! te (_t.mnt.1 t#~ de guano.s:i.ne r~u1 ~

pr~eJ.~itdi, on e.jo~te A J.n ~o.1u.t.ion lQO cc d'e<ilcool t on t'U':ltlt:t1ft2i~

l ·.pt eipit.€1. ^l},e f.te.rl'J.ier e~t rep:ris dens 15 co < "eau et pJr~o1p1t;i:

!?£ n(H.\V~au. ^{'(.!I .tt} (i.O ae d'a.J.0001. Cetta addition d'e.10001 a pcitr bJJ.

<J' &l1mb1Qr 1etta nuo.l~ot;t. es ql.li aur,aient 11"',si~~1h~ a l 'hydl'olyeie .•

LO'-' ~ux-m<!lties a1eool.:lt1u:&' aont. r(lunies et 0011cebtril$s soua \"1de jtu;(iu.'ilt. ~). QO; apr&·s avoil! n.eutra11s6 pf,\r 1

ae1de "¢~~-

tiqu.0, e>n 1~1$itHi 1 'a.d.tinosina c:r1stall1eer la. g1eoi~re- Le nu-

0.14!0 1de est purif'le par :r0cril sta.lli f;lation, eomme dana lG o. ^Q (i,e

'le~ er1:.1enos1na.

ndem nt-; _OU lS "''•.

;LIA d samiruit1on e la guanostn.e eat r~a.lis6a ditne le~

m me& eon iti()n~ . u$ la d." saminatlon es nu.el ·ot1des. La KQntho- sine peu:'t t\it.re pu.Plfi(ht pn.r l • intaFmediatr·EJ du eel tn olubl& de mercur , .d0nt on r ·all.ea la pr€;Qip.itatlen entre ptl:::.I· Qt p ^·=~.I en p;r~s~nea d'acll!tatea, 1 'oxyde de ercure ne pr6cip' t.e pas an.co-

re. J?B ::..9 • ·

R ndmnt:. OU 66 _•

$'11.1~ chi; petites ~iu:an\t't,iis, cha.que foi t1u•11. ,4ta1t. nl)c~saal,re, au

1AO e~~ t1 'utr:i.li s r ^1.• 1noslne.

Lea bo.ees pu:ri, es l1bres, a· nopurtnes et 0~1purt.l')es., n'ont .. ·pa· 4'1 &tire ^Iil riar~es car· nous disposiona de pred:uits

e o o o o O o • o o

' l'· ... ,,

-- Jl --

e detel'mina.t;tona suiV" nt,es ont €it0 $ffeotueee, cior>.t

les :riau.l\at.a sont oenfront(b avea leEi <Valeu.rs c~leul€1ee . dans

o:lds. ^{EH!lC -} QeJl4re~.

l' mgr· environ de ohaque substance, pe!l'1s au l/~O de l!lSr

aan$ un mtoroor use~, oni t~ saohee ~ 1'etuve jusqu*a p~1ds eons- ta.~ti .la (tliff re.no· di1,1 pQlds perm~t le cal.cul d0 l 'hum1d.it€#. Le p~oau::ltt ;ec a @t caloin' en e?*eu et ouvert, avec un pau t.t•aoid~

ill t;t'iq;ue <U>l).OIEintr·. '5ventuellanient., et le r~~aidu. de o~\10i,Mt10n p -

m& A aouve u (l?~1d$ total des CHJnl~es). Le r~ idu,. EJnfi.n, a ~t.

repr·is pa.r .6buJ.1it1on du orauset et son conte:nu d.ans 20 ep annron

d'~O:l.,(\t,$ ,Oh1Qrby<Sr1q'1e ~lf, de faq.on a ·sol.ubiliser le1;3 phCtiph tee;

(nucl6Qtide.s et ribos -phosphate) J apr4ls a just.em.en\ de l~ solut.ion acid~ a un velwne oohnu, le phosphotte min~ral y ~ et€! d~s~ at l$

po1d$ . corl'EtspQndant de phosphate d oompte des oend~·es ( l'ab. i:) •

Un oo de sol.ut1on, eon.tenant. 2Q· A ~jUO d de phoe:iphore,

a \e tninA:ralise pa~ ~bu111tJ,on avee un ao ~'aeide perohlori(Jue (6.0 ,·). . ,a,a,ns ^. ~ pet;.tt baJ.lon de !Jel®hl. f·pr~s avoi..r port~ ie vft.>- l'W'!l . b. 25 oc

le pbosphore in r:;.1 ett, doe~ e~1on la ?net.bod · de Berenbll'Un e\ Ohain ( d, iat."l.l e plus loin). Vo:lr tn'bl ~ t.t. ·

zote ,te)tal (tdcro-. jeld~.hl).

llle:ux o' de so:\ut1on, oontenant 5 · a 90 'O d 'azot.e, ont

. t 1tt:1naraite€le par tm ocs d'o.clde $tllfu~1que 9 + ^{4 mgr de o -}

~1yae\W ( l pa•tS• d: st.l~nlwP .+ ^{!? pat'tles 4Hg +} ~o part.1·es .41~>;

fl

1 ¹ ammonia• toPTA a ~t{ di etlll' n J. ·~ppa.re:Ll de ~a.rnas 'Elf. Wagn$l'

(l'frf.fi!l(!r1eth et Lac.ovt, 1939), rect6.111 da.ns 10 co. d'a-01de &Ul.f'1~1· ·

llG V100 et t1tr~ pai' N& H /100 (1ndicateur e. ~a hli-o). ~ b. 11·

-- 2~

uen(,llii.lS Uen(lr.•1iH~~ oen~rtias d ~oompf.6c.u1 1!'~e1J.es f ^poids

nature ^{I t gr'} sec

·a:ndres apree

oa.1atnat1on mgr

~tV nyl1 cfu.e 13,a 1,5 r205 1,5 0 guanyliqu.e 14.,~~ 2,6 _P- 5

'.2,6 ⁽⁾

ino iq,ue 14,9 5,S ^p 3K ^{( 5,0} ••

Yi'

j.\.i). m.nthylique 1a,6 ~~ _Jp 7 _{3Na I}

o,, ⁴ crt

B!bose-phosphaia l~·,O 3,0 ( }o 3) i3a I 3,0 0 '

4

6nos1ne 9 •"" ~ ^',5 - ⁽

^{.. o,6 6 .!.r~}

G anoaine '16

. l 0 _~ - ⁰

Xa11tbos ne 1;;,5 4,:, I

- 4,3 Jl, ..

'l'ableau I

Oendras.

O.ompG.lG§ ... :zct.$ J~ _ !h! ~P.h!"'! ,.;... !a£P2_X'_!_ - _{.. omule} ^o:1de

obs. oe.10 obs. ^{Qa\.lO• oa1.o. obs.} molec.

'

e. ad.~n. 19,0 19,1 s,oo $,46 2,26 l ^{m,38 01off 15N507P ·R20}

⁵⁶

' c. gucnyl. 19,4 ^{lj,g 8 60} S,52 ^{2,ta:~ 2,25 0} 1o"tti5N5o B )

••

A.a. :f.noa ·q. 14,4 14,5 6,32 t,01 1,ao 1,73 _OlOHlj 1/>9f!K _.:Jr

7

Ao. ^xa.nthNl 14,5 14,5 a,15 ^{Q,ol 1, 0 1,78 c 1 ,a 13 N40. iNa : 38'7}

R.lb .. pho.aph. -- -- ^{8,40 ,47} -- ^{-- 0;11 oog: Ba 366,}

")' ^{,_. .. 26,1 --} -- ^{01.o!i130 5 ···.67}

a4,9 ^1')4

^{7 0} 10H130~.115 ~s;.

ntho~lne 9,a 19,7 -- ^{Gl R10 6 144} --~·&4 _~

't'e.bleau I 1 - zote et pho apbor •

arbone (fer· euJ.en).

·'

;-on:flem.ent consider.able ete la. ma se svee ^demh dra:tation br\11 qua et ~m1s'!'lion . e v eure nitreu es;. il reet.e alors d.an$ la naee11e une aort.e de colt:e, r l)r sent.ant souvent plus de la 101 ti du oat'- bone, .u' 11 est :tmpe· aible d br er eomplltt.ement ann2 1;,oFt.~·~· la

t'flUX'-~e. ·dt> 1 'analys il pluaieurs beures.

Nou avonis pu tou:~r la. d1f iculte · n mtta.nt. 1nt1m: m nt.

la su.lSstanoa pUlv~r1 .. e l d e oxya.ants (Ou , 2"n0 8); 1· combustion e$t €1.l.Qrs :r' gu3,1~re et le aonf'l.ement, lorsqu.'11 tend n~anmo1ne -

s pttoduS.re •. prend u.ne import. not> be~ :ueaup moine grande. L oa..ta-

ly eur ctxyd~nt q'1t nou ilRQn utili ⁽¹ v · e aa ti s:fao t 1 n est y.n

mi-ilange p 'l'°tiea. go.l·es d~ b1<>*Y e e u:iangan&s0 e't t, ^{'oxy de.}