CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE, NUTRITIONNELLE ET SENSORIELLE DU POISSON FUME ET DU POISSON FUME-SECHE PRODUITS AU SUD-BENIN

UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI ---»@«---

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI ---»&«---

MASTER EN NORMES, CONTROLE DE QUALITE DES PRODUITS AGROALIMENTAIRES

MEMOIRE

Pour l’obtention du diplôme de Master

Option : Normes et Contrôle de Qualité

THEME

Présenté et soutenu par :

Superviseur :

Co-superviseur :

Année académique : 2016-2017

CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE,

NUTRITIONNELLE ET SENSORIELLE DU POISSON FUME ET DU POISSON FUME-SECHE PRODUITS

AU SUD-BENIN

UNIVERSITY OF ABOMEY CALAVI ---»@«---

POLYTECHNIC SCHOOL OF ABOMEY-CALAVI ---»&«---

MASTER EN NORMES, CONTROLE DE QUALITE DES PRODUITS AGROALIMENTAIRES

Thesis to obtain Master degree Option : Standards and quality control

TOPIC

Presented and defended by:

Ben-Sadek BOUKARI

Supervisor :

Co-supervisor :

Academic year 2016-2017

PHYSICO-CHEMICAL, NUTRITIONAL AND SENSORIAL CHARACTERIZATION OF SMOKED

AND SMOKED-DRIED FISH PROCESSED IN SOUTHERN OF BENIN

INTRODUCTION PHYSICO-CHIMICAL, NUTRITIONAL AND SENSORIAL

CHARACTERIZATION OF SMOKED AND DRIED- SMOKED FISH PROCCESSED IN SOUTHERN OF

BENIN

I

CERTIFICATION

Je certifie que ce travail a été conduit par l’étudiant Ben-Sadek BOUKARI, à la Faculté des Sciences Agronomiques de l’Université d’Abomey-Calavi, pour l’obtention du diplôme de Master en Normes, Contrôle de Qualité des produits agroalimentaires.

Le Superviseur

HOUNHOUIGAN D. Joseph,

Professeur titulaire des Universités du CAMES Enseignant -Chercheur à la FSA/UAC

II

DEDICACES

Je dédie ce travail :

A Allah, le tout puissant, le très miséricordieux, tout en implorant qu’il continue de nous combler de sa grâce et de sa bonté.

A mon père Djibril BOUKARI et à ma mère Brigitte SONOUNAMETO épouse BOUKARI, pour leur soutien morale et financier, puisse Allah vous combler de ses grâces. Recevez par ce travail le fruit de vos efforts.

III

REMERCIEMENTS

A mon superviseur, Professeur Djidjoho Joseph HOUNHOUIGAN,

Malgré vos nombreuses occupations, vous n’avez ménagé ni votre temps, ni votre énergie pour suivre avec attention, patience et rigueur ce travail. Je vous témoigne toute ma profonde reconnaissance ;

A mon Co-superviseur, Docteur Balbine AMOUSSOU FAGLA, pour avoir accepté co- supervisé ce travail et pour sa contribution scientifique ;

Au Professeur Victor ANIHOUVI, pour son accompagnement permanent tout au long de nos travaux. Recevez ici nos vifs remerciements ;

Aux Docteurs Euloge KPOCLOU, Janvier KINDOSSI et Laurent ADINSI pour leurs différentes contributions à la réalisation de ce travail ;

A tous les membres du projet QualiSani en particulier aux doctorants Herbert IKO AFE, François ASSOGBA et Gildas ANIHOUVI pour leur contribution et conseil dans la réalisation de ce travail ;

A tous les enseignants du master en Normes et Contrôle de Qualité des Produits Agroalimentaires pour la qualité de la formation qu’ils nous ont donné ;

Au personnel du laboratoire des analyses physico-chimique et d’évaluation sensorielle des aliments et du laboratoire des sciences des aliments de l’Ecole de Nutrition et des Sciences et Technologies Alimentaires, en particulier Messieurs Issa AMADOU et Mathias HOUNSOU, Mesdames Hermance HOUNGBO, Thérèse GNONLONFOUN pour leur assistance ;

Aux camarades, du master en Normes et Contrôle de Qualité des Produits Agroalimentaires, pour la bonne ambiance de travail et la fraternité qui a régné tout au long de notre formation ; A tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à la réalisation de ce travail.

Au projet PRD-ARES-CCD QUALISANI ; j’exprime ma profonde reconnaissance pour avoir financé ce mémoire.

IV

RESUME

Le fumage traditionnel du poisson tel que réalisé au Bénin pourrait constituer un risque à cause des composés cancérigènes qui peuvent s’y former et contaminer les produits. La présente étude vise à déterminer les caractéristiques physico-chimiques, nutritionnelles et le profil sensorieldes poissons fumés/séchés produits au Sud-Bénin. Trente-six échantillons de poisson fumé (PF) (Scomber scombrus (SS) ; Merluccius polli (MP) et Tilapia guineensis (TG)) et de poisson fumé/séché (PFS) (Cypselurus cyanopterus (CC) ; Sphyraena barracuda (SB) et Ethmalosa fimbriata (EF)) ont été collectés dans les principaux marchés et sites de fumage. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) ont été analysés suivant la méthode HPLC/FLD et les ABs par UPLC/FLD/PDA. L’évaluation sensorielle a été faite selon la méthode Check all That apply (CATA). Il en resulte que pour respectivement pour le PF et le PFS, la teneur en eau (TE) varie de 53,5±15,5% à 67,2±5% et de 18,8±7,6% à 32,4±12,5% ; la teneur en protéine (base seche) de 70,5±11,3% à 90,1±5,0% et de 77,4±5,7 à 90,8±5,1 ; la teneur en matière grasse totale (MGT) des espèces de de 17,5±3,9% à 39,4±8,7% et de 11,2±5,0% à 22,1±6,3%. Pour les PF et PFS confondus, les concentrations en Benzo(a)pyrène (BaP) et en somme 4HAPs varient respectivement de 2,06 µg/Kg à 183,42 µg/Kg et de 21,91 µg/Kg à 1265,74 µg/Kg, dépassant les limites respectives de 2µg/Kg et 12µg/Kg, recommandées dans la règlementation européenne (CE No 1881/2006). Tous les échantillons (PF et PFS) analysés sont contaminés en amines biogènes, avec des concentrations en histamine (3/19 échantillons) au-delà de la limite de 200 mg/Kg (poids frais) recommandées dans le règlement CE No 2073/2005. Trois classes de consommateurs ont été relevé pour les PF avec des scores moyenne d’acceptabilité de 7,50 ± 1,47 ; 7,36 ± 1,56 et 7,22 ± 1,70 respectivement pour MP, SS, et TG. Les descripteurs sensoriels relatifs à la "texture sèche et l’aspect non brillant", à la "couleur trop noire, la texture tendre, la texture humide" et à la "couleur dorée, aspect brillant et texture friable" sont respectivement corrélés à l’espèce MP, SS, et TG. Pour les PFS, on note quatre classes de consommateurs avec des scores moyenne d’acceptabilité de 7,3 ± 1,5 pour CC et 7,6 ± 1,5 sur une échelle de 1 à 9, pour EF ; Selon les consommateurs, les descripteurs sensoriels pour le CC et EF sont respectivement les textures dure et ferme ; l’aspect brillant et la couleur relativement dorée.

Mots clés : Poisson, Fumage, Fumage-séchage, Hydrocarbures aromatiques polycycliques, Amines biogènes,CATA.

V

ABSTRACT

Such fish that made Benin's traditional smoking might be a risk because of the carcinogenic compounds that may form and contaminate the products. This study aims to determine the physicochemical, nutritional characteristics and sensory profile smoked/dried fish produced in Benin South. Thirty-six samples of smoked fish (PF) (Scomber scombrus (SS) ; Are polli (MP) and Tilapia guineensis (TG)) and smoked/dried fish (PFS) (Cypselurus cyanopterus (CC) ; Sphyraena barracuda (SB) and Ethmalosa fimbriata (EF)) were collected in the main markets and sites of smoking. Hydrocarbons polycyclic aromatic (HAPs) were analyzed following the HPLC/FLD method and the ABs by UPLC/FLD/PDA. The sensory evaluation was made according to the method Check all That apply (CATA). It follows that for respectively for the PF and the PFS, the water content (TE) varies from 53, 5±15, 5% to 67, 2±5% and 18, 8±7, 6% at 32, 4±12, 5%; content (dry basis) protein of 70, 5±11, 3% 90, 1±5, 0% and 77, 4±5, 7-90, 8±5, 1; the-total fat (MGT) of species of 17, 5±3, 9% at 39, 4±8, 7%

and 11, 2±5, 0% at 22, 1±6, 3%. For the PF and combined PFS, concentrations in Benzo (a) pyrene (BaP) and sum 4HAPs range respectively from 2.06 Μg/Kg to 183,42 µg/Kg and 21,91 Μg/Kg to 1265,74 µg/Kg, exceeding the respective limits of 2µg/Kg 12µg/Kg, recommended in the European regulation (EC No. 1881/2006). All the samples (PF and PFS) are contaminated in amines biogenic, with concentrations in histamine (3/19 samples) the limit of 200 mg/Kg (wet weight) recommended in the EC Regulation No. 2073/2005. Three classes of consumers was noted for the PF with scores average of acceptability of 7.50 ± 1.47;

7.36 ± 1.56 and 7.22 ± 1.70 respectively for MP, SS, and TG. The sensory descriptors related to the "dry texture and appearance not brilliant", "too black color, soft texture, wet texture"

and the "golden color, shiny and crumbly texture" are respectively related to the species MP, SS, and TG. For the PFS, there are four classes of consumers with scores average of acceptability of 7.3 ± 1.5 for CC and 7.6 ± 1.5 on a scale of 1 to 9, for EF ; According to consumers, the sensory descriptors for the CC and EF are respectively the textures hard and firm; the shiny and the relatively golden color.

Key words : Fish, smoking, smoking-drying, polycyclic aromatic hydrocarbons, biogenic Amines, CATA.

VI

TABLES DES MATIERES

CERTIFICATION ... I DEDICACES ... II REMERCIEMENTS ... III RESUME ... IV ABSTRACT ... V TABLES DES MATIERES ... VI LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ... VIII LISTE DES TABLEAUX ... IX LISTE DES FIGURES ... X LISTE DES ANNEXES ... XI

INTRODUCTION ... 1

INTRODUCTION ... 1

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 3

1. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 4

1.1. Importance socio-économique de la pêche et production nationale du poisson ... 4

1.2. Composition chimique du poisson frais ... 5

1.2.1. Lipides ... 5

1.2.2. Protéines ... 6

1.3. Méthodes de conservation du poisson. ... 7

1.3.1. Séchage ... 7

1.3.2. Salage ... 7

1.3.3. Fermentation ... 8

1.3.4. Fumage et fumage/séchage ... 9

1.4. Actions de la fumée sur le poisson ... 10

1.5. Effet du fumage sur la qualité sanitaire du poisson ... 10

1.5.1. Production des hydrocarbures aromatiques polycycliques au cours du fumage du poisson ... 10

1.5.2. Formation des amines biogènes dans le poisson ... 12

2. MATERIELS ET METHODES ... 15

2.1. Zones et conditions de collecte des échantillons ... 15

2.2. Analyses de laboratoire ... 17

VII

2.2.1. Caractéristiques physiques ... 17

2.2.2. Paramètres chimiques ... 18

2.2.3. Paramètres nutritionnels ... 23

2.3. Caractérisation sensorielle des poissons fumés et des poissons fumé/séchés ... 24

2.4. Analyse statistique ... 27

3. RESULTATS ET DISCUSSION ... 29

3.1. Caractéristiques physico-chimiques et nutritionnels du poisson fumé et du poisson fumé/séché produits au Sud-Bénin ... 29

3.1.1. Caractéristiques physiques et nutritionnels du poisson fumé et du poisson fumé/séché produits au Sud-Bénin ... 29

3.1.2. Niveau de contamination en Hydrocarbures aromatiques polycycliques du poisson fumé et du poisson fumé/séché produits au Sud-Bénin ... 33

3.1.3 Formation des amines biogènes dans les PF/PFS du Bénin ... 37

3.2. Caractéristiques sensorielle des poissons fumés et des poissons fumé/séchés produits au Sud-Bénin ... 40

3.2.1. Caractéristiques sensorielle des poissons fumés ... 40

3.2.2. Caractéristiques sensorielles des poissons fumés/séchés ... 44

CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS ... 50

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 51

ANNEXE ... 61

VIII LISTE DES SIGLES ET ABRE

VIATIONS

AB : Amine Biogène

AFNOR : Association Française de Normalisation AOAC: Association Of Analytical Communities CE : Commission Européenne

DP: Direction de la pêche

EFSA European Food Safety Agency FAO: Food and Agriculture Organization

HAPs: Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques ISO: International Standardization Organization

MAEP : Ministère de l’Agriculture de l’Elevage et de la Pêche NF : Norme Française

PAFILAV : Projet d'Appui aux filières Lait et Viande HAPs : Hydrocarbures aromatiques polycycliques HPLC: High Performance Liquid Chromatography UPLC: Ultra High Performance Liquid Chromatography PIB : Produit Intérieur Brute

PSRSA : Plan Stratégique de Relance du Secteur Agricole WHO: World Health Organization

IX LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Principaux composants (en pourcentage) des muscles de poisson et de bœuf ... 5

Tableau 2: Quantités de poissons fumés et de poisson fumé/séché collectées par espèce et par site de collecte ... 17

Tableau 3 : Concentrations du pool et volume HClO4 pour chacun des points ... 21

Tableau 4 : Attributs de qualité / descripteurs du poisson fumé ... 25

Tableau 5 : Attributs de qualité / descripteurs du poisson fumé/séché ... 26

Tableau 6 : Teneurs en eau, en protéines, en MGT et pH des PF/PFS selon les espèces ... 32

Tableau 7 : Teneurs en eau et pH des PF/PFS selon les sites de collecte ... 32

Tableau 8 : Concentration en HAP des PF/PFS (n=19) ... 34

Tableau 9 : Concentrations individuelles de BaP et somme des 4 HAPs dans les PF (µg/Kg poids frais et poids sec) ... 36

Tableau 10 : Concentrations individuelles de BaP et somme des 4 HAPs dans les PFS (µg/Kg poids frais et poids sec) ... 36

Tableau 11 : Concentrations moyennes de BaP et somme des 4 HAPs dans les PF/PFS (µg/Kg poids frais et poids sec) ... 37

Tableau 12 : Concentrations en AB des PF/PFS ... 39

Tableau 13 : Acceptabilité globale des espèces de poisson fumé par les consommateurs ... 40

Tableau 14 : Fréquence des descripteurs suivant chaque espèce de poisson fumé ... 43

Tableau 15 : Fréquences d’utilisation des descripteurs sensoriels ... 47

X

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Dynamique annuelle des productions halieutiques et importations de poissons congelés au Bénin ... 4 Figure 2 : Représentation géographique des Communes constituant la zone d’étude ... 16 Figure 3 : Concentration individuelle des 4 HAPs dans les poissons fumés et fumés/séchés . 35 Figure 4 : Dendrogramme de classification hiérarchique des consommateurs de poissons fumés ... 41 Figure 5 : Niveau d’acceptabilité des espèces de poisson fumé par les classes de consommateurs ... 42 Figure 6 : Analyse en composante principale montrant les relations entre les classes de consommateurs, les descripteurs sensoriels et les espèces de poisson fumé... 44 Figure 7 : Dendrogramme de classification hiérarchique des consommateurs de poissons fumés/séchés ... 45 Figure 8 : Niveau d’acceptabilité des espèces de poisson fumés/séchés par les classes de consommateurs ... 46 Figure 9 : Analyse en composante principale des attributs sensoriels des poissons fumés/séchés ... 48

XI

LISTE DES ANNEXES

Annexe 1: Courbes HAP ... 61

Annexe 2 : Limite de quantification (LOQ) des HAPs ... 64

Annexe 3 : Amines biogènes_courbe poisson ... 65

Annexe 4 : Limite de quantification (LOQ) de la méthode UPLC/FLD/PDA des échantillons de viande de porc pour chaque AB ... 69

Annexe 5 : Test sensoriel auprès des consommateurs de poisson fumé et fumé/séché ... 69

Annexe 6 : Concentration en PDA en AB des PF/PFS ... 73

Annexe 7 : Concentration en fluo en AB des PF/PFS ... 74

1

INTRODUCTION

1 INTRODUCTION

Le poisson et ses produits dérivés jouent un rôle important dans l’alimentation des populations de l'Afrique de l'Ouest. Quinze à vingt pour cent des protéines animales consommées dans cette région sont de sources aquatiques (FAO, 2000). En effet, c’est la plus importante source de protéines animales dans l'alimentation de la population du Bénin (Farougou et al., 2011). Cependant, sa conservation dans les pays tropicaux est difficile en raison du manque d’infrastructures adéquates et du fait des conditions climatiques et d’environnement qui concourent à sa dégradation en quelques heures (Anihouvi et al., 2005).

La conservation du poisson frais dans la sous-région Ouest Africaine est mise en œuvre par des procédés moins coûteux tels que le séchage, le salage, la fermentation et le fumage utilisés individuellement ou en combinaison (Anihouvi et al., 2006). Au Bénin, le fumage est très développé dans la conservation des produits de pêche en particulier celle du poisson (Dègnon et al., 2013ab ; Kpoclou et al., 2013a; Chabi et al., 2014, Kpodékon et al., 2014). Dans les pratiques courantes de transformation artisanale, les produits sont disposés sur les claies de fumage en contact direct avec la fumée de combustion (Dègnon et al., 2013ab ; Kpoclou et al., 2013a ). Pour des crevettes fumées dans ces conditions, Kpoclou et al., (2013b) ont rapporté des concentrations en Benzo(a)pyrène de l’ordre de 91 µg/kg, excédant la limite maximale de 2 μg/kg recommandée par la règlementation européenne (CE N°1881/2006) ce qui pose un problème de santé publique. Par ailleurs, dans les conditions favorables aux développement de certains microorganismes décarboxylase-positifs, le poisson est sujet à la décarboxylation de certains acides aminés en amines biogènes dont l’histamine connu pour ses effets toxiques pour l’organisme (Flick et al., 2001 ; Pawul-Gruba et al., 2014). Du fait du caractère thermostable de l’histamine, des températures et des conditions de conservation (Rapport d’enquête QUALISANI, 2016), cette amine pourrait bien être présente dans le poisson fumé et dans le poisson fumé/séché. Afin d’améliorer les technologies de fumage et de réduire la teneur en contaminants chimiques du poisson fumé et du poisson fumé/séché au Bénin, il est important de connaître les caractéristiques de ces poissons tels que vendus aux consommateurs. C’est dans cette optique que la présente étude se propose d’étudier les caractéristiques physico-chimique, nutritionnelle et sensorielle de quelques espèces de poissons fumés et de poissons fumés/séchés produits au Sud-Bénin.

2 De façon spécifique il s’agit de :

 Caractériser aux plans physico-chimique et nutritionnel des espèces de poissons fumés (Scomber scombrus ; Merluccius polli ; Tilapia guineensis) et de poissons fumé/séché (Cypselurus cyanopterus ; Sphyraena barracuda ; Ethmalosa fimbriata) produits au Sud-Bénin ;

 Etablir les profils sensoriels de ces espèces de poissons fumés et fumés/séchés précités.

3

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

4

1. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1.1. Importance socio-économique de la pêche et production nationale du poisson

La pêche joue un rôle très important dans l’économie nationale béninoise. Elle procure de nombreux emplois et contribue largement à la consommation nationale en protéines animales (40%) (MAEP, 2012). Les activités post capture de la pêche dégagent une richesse de 4 millions d’euros et contribuent à 0,23% du PIB du Bénin (FAO, 2014). Le sous-secteur de la pêche occupe 15% de la population active totale et 25% de la population active du secteur agricole. Il représente plus de 300.000 emplois directs et indirects et assure une part non négligeable de la quantité totale de protéines d’origine animale consommées (PSRSA / MAEP, 2011).Globalement, le secteur agricole contribue pour 32,5% au produit intérieur brut (PIB) national et le sous-secteur pêche et aquaculture pour 11,31% au PIB agricole (DP/MAEP, 2013) et 3% au PIB national. La production (capture) halieutique nationale du Bénin et l’importation des poissons congelés ont respectivement connu une évolution à la hausse de 31 497 à 47 572 tonnes et 45 227,99 à 163 125,5 tonnes de 2005 à 2014 (DP/MAEP, 2014 ; FAO, 2016) (Figure1).

Figure 1 : Dynamique annuelle des productions halieutiques et importations de poissons congelés au Bénin

Au Bénin, la consommation moyenne de poisson par personne et par an a atteint 15,93 kg en 2012. La majorité (¾) de la production est consommée en frais, le reste est essentiellement fumé (80%), séché avant d’être distribué sur les marchés intérieurs (El Ayoubi et Failler,

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000

0 5 000 10 000 15 000 20 000 25 000 30 000 35 000 40 000 45 000 50 000

2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

Quantité (tonne)

Année Production halieutique

Production halieutique Importation de poissons congelés Importation de poissons

5 2013). La balance commerciale en produits halieutiques reste déficitaire en raison d’une demande supérieure à la production nationale. Le Bénin importe les ¾ de ses besoins en consommation en poissons et crustacés. La contribution économique et sociale des pêches a fortement baissé au cours de cette dernière décennie, principalement en raison de la diminution notable du potentiel halieutique du pays (El Ayoubi et Failler, 2013).

1.2. Composition chimique du poisson frais

Le poisson a une haute valeur nutritive (FAO, 2006). Sa composition chimique, à l’instar des autres espèces aquatiques présente une variation liée à l’espèce, l’habitat et les saisons, l’environnement, l’alimentation, le cycle sexuel et l’âge (Huss, 1999 ; Miniadis-Meimaroglou et al., 2007 ; Senso et al., 2007 ; Siddique et al., 2012). Le tableau 1 montre les principaux composants (en pourcentage) des muscles de poisson et de bœuf

Tableau 1 : Principaux composants (en pourcentage) des muscles de poisson et de bœuf Constituants

(%)

Poisson (filet)

Bœuf (muscle)

Minimum Normal Maximum

Protéines 6 16-21 28 20

Lipides 0,1 0,2-25 67 3

Hydrates de carbones <0,5 1

Cendres 0,4 1,2-1,5 1,5 1

Eau 28 66-81 96 75

Source : Huss. (1999) 1.2.1. Lipides

Selon le Codex Alimentarius (CAC/RCP 52-2003), les poissons peuvent être classés en deux catégories en fonction de leur teneur en graisse. On distingue ainsi les poissons gras dont les principales réserves de graisse se trouvent dans le tissu cellulaire et dont la teneur en matières grasses dépasse 2% des poissons maigres (poisson blanc) dont les principales réserves de graisse se retrouvent dans le foie et dont le tissu cellulaire contient moins de 2% de graisse. Les poissons sont les principales sources d’acides gras longs polyinsaturés (AGP) oméga 3 dans l’alimentation humaine. La concentration en acides gras (AG) du poisson augmente avec la teneur en lipides de sa chair. Pour une même espèce, la teneur en lipides musculaires peut varier au cours de l’année en fonction de l’état physiologique et de l’alimentation du poisson.

Les plus fortes variations sont observées pour les espèces grasses issues de la pêche (Médale, 2009). Contrairement aux lipides des mammifères, ceux des poissons sont formés d’acides gras

6 insaturés à longues chaînes (de 14 à 22 atomes de carbone) (Grégoire, 2007). Ce sont ces glycérides, contenus dans la graisse de poisson, qui donnent l’odeur caractéristique de l’huile de poisson. La graisse de poisson contient également une importante quantité d’oléine de 50 à 60%. Elle contient également une plus grande proportion de phospholipides que les autres chairs. Ce contenu en phospholipides fait que la chair de poisson est un aliment particulièrement adapté pour restaurer et exciter les capacités vitales du système nerveux (Grégoire, 2007).

1.2.2. Protéines

Les protéines constituent qualitativement et quantitativement les composants les plus importants du tissu musculaire du poisson (Huss, 1999). Sur le plan qualitatif, le poisson, au même titre que la viande est une source importante de protéines animales qui sont très riches en acides aminés essentiels à divers pourcentages comme l’œuf de volaille, le lait de vache et la viande des mammifères (Huss, 1999). Les protéines des tissus musculaires du poisson peuvent être divisées en trois groupes:

 Protéines structurelles (actine, myosine, tropomyosine et actomyosine) : Elles constituent 70 à 80% de la teneur totale en protéines (comparée à 40% chez les mammifères). Ces protéines sont solubles dans des solutions salines de force ionique relativement élevée (0,5 M) (Huss, 1999).

 Protéines sarcoplasmiques (myoalbumine, globuline et enzymes) : Elles sont solubles dans des solutions salines neutres de force ionique faible (< 0,15M). Cette fraction représente 25 à 30% des protéines (Huss, 1999).

 Protéines du tissu conjonctif (collagène) : Elles constituent environ 3% des protéines chez les téléostéens et environ 10% chez les élasmobranches (comparé à 17% chez les mammifères) (Huss, 1999).

Aussi le tissu conjonctif a une influence significative sur la couleur du filet (Espe et al., 2004) et également sur les propriétés texturales du muscle de poisson (Thakur et al., 2003) car sa dégradation, lorsque le poisson est mort est corrélée avec l’attendrissement du muscle du poisson au cours de la période post mortem (Ando et al., 1995). Le traitement des protéines de poisson avec des concentrations élevées en sel ou par la chaleur peut mener à la dénaturation, après quoi la structure de protéine aurait irréversiblement changé (Huss, 1999). Quand les protéines sont dénaturées dans des conditions normales, leurs propriétés peuvent être utilisées pour des buts technologiques (Huss, 1999). La

7 composition en acides aminés des protéines de poisson est très variable, la variabilité est due aussi bien à l’espèce, l’alimentation, le cycle sexuel, etc. La chair du poisson a un profil en acides aminés équilibré, sa teneur en protéines (16 à 22%) et sa composition en acides aminés essentiels sont comparables à celles des viandes (Médale et al., 2003).

Médale et al. (2003) ont rapporté une variation de la teneur en protéine de 540 espèces de poisson comprise entre 16 à 22%.

1.3. Méthodes de conservation du poisson.

1.3.1. Séchage

Le séchage consiste à éliminer l'eau contenue dans les aliments. C’est une méthode de conservation du poisson très répandue, en particulier dans les régions tropicales. La quantité d’eau à retirer varie selon le produit. La méthode la plus simple et la plus économique est le séchage au grand air (avec ou sans soleil) (Berkel, 2005). Une fois qu'une quantité d'eau suffisante est éliminée, le poisson peut se conserver puisque les bactéries et les enzymes ne peuvent se développer en l'absence d'eau et ne peuvent donc plus provoquer la dégradation du poisson. Le séchage est souvent associé à d'autres procédés comme le salage ou le fumage afin d'augmenter la durée de conservation des aliments (Tuara, 1999). Les poissons maigres ou contenant peu de graisse, comme le tilapia, les requins et la plupart des poissons à chair blanche, se prêtent parfaitement au séchage. Le séchage se pratique le plus souvent au soleil ou à l'aide de séchoirs mécaniques (Tuara, 1999). Toutefois, il existe des méthodes plus difficiles et plus coûteuses utilisant des séchoirs dans lesquels les produits sont séchés artificiellement à l’air chaud. La qualité des produits séchés au soleil est légèrement inférieure car la lumière solaire dégrade certaines vitamines (Berkel, 2005). Pour un bon séchage, le poisson peut être suspendu de plusieurs manières à des bâtons horizontaux. Les lanières de viande à sécher sont suspendues à des crochets ou à des ficelles. Les poissons entiers, les poissons filetés ou la viande peuvent aussi être séchés sur des claies en grillage ou en bambou.

Les morceaux de poisson ou de viande mis à sécher sur des claies doivent être retournés toutes les 2 heures pour obtenir un séchage uniforme (Berkel, 2005).

1.3.2. Salage

Le salage est une méthode ancestrale de conservation du poisson. Elle consiste à diminuer la teneur en eau inhibant en partie l'activité enzymatique et microbienne et donner un goût et une consistance particulière au produit. L'eau est remplacée par le sel qui pénètre. Le sel

8 sélectionne les flores en fonction de l'activité de l'eau, inhibe la multiplication de la plupart des bactéries intervenant dans l'altération, mais favorise la croissance des halophiles. A partir d'une concentration de 5%, le salage inhibe la plupart des bactéries anaérobies et les Pseudomonas et ralentit la croissance des bactéries aérobies (Hette, 2006). Il existe trois méthodes traditionnelles de salage : le salage à sec, le salage dans sa propre saumure ou le salage en saumure (Knockaert, 1995 ; Hette, 2006)

 Salage à sec : Ce type de salage consiste à appliquer du sel cristallisé sur le poisson, généralement par frottement ou par saupoudrage. Les poissons sont ensuite empilés dans des cuves ou des barils percés. L'eau exsudée va s'évacuer par les orifices laissant les poissons relativement secs. Toutefois, le salage ne sera pas uniforme.

 Salage dans sa propre saumure : Les couches alternatives sel/poisson sont empilées dans un contenu imperméable favorisant l'exsudation de l'eau et la création d'une saumure. Le liquide saumâtre exsudé recouvre alors les poissons, les protégeant contre les phénomènes de rancissement. Cette technique permet un salage uniforme des produits.

 Salage en saumure : Il consiste à immerger le poisson dans une solution saline saturée (environ 360 g de sel pour 1 litre d'eau). Le salage obtenu est uniforme (Hette, 2006).

1.3.3. Fermentation

La fermentation du poisson est une technique traditionnelle utilisée pour conserver les produits à base de poisson. Pendant la fermentation du poisson, la protéine est dégradée en présence d’une forte concentration en sel par des enzymes originaires du poisson lui-même ; ces enzymes sont surtout présentes dans l’intestin (Berkel et al, 2005).La plupart des produits de poissons fermentés sont obtenus par fermentation spontanée (Anihouvi et al, 2005). Le koobi et le momone sont connus comme des produits traditionnels de poisson fermenté ghanéens et sont fabriqués par la fermentation spontanée sur un substrat solide (Essuman, 1992 ; Abbey et al, 1994 ; Kingley- Ekow, 1999). Les différentes méthodes de fermentation du poisson varient suivant les localités et la méthode utilisée dépend pour une grande part de la disponibilité en sel et des habitudes alimentaires (Beddows, 1985 ; Olympia, 1992 ; Essuman, 1992). Trois principales techniques de fermentation sont souvent pratiquées dans beaucoup de pays africains notamment : la fermentation avec salage et séchage, la fermentation sans salage mais suivi de séchage et la fermentation avec salage mais sans séchage (Essuman, 1992). On distingue trois types de produits de poisson fermenté :

9

 Sauces: Ces sauces sont obtenues par fermentation de poissons entiers, non vidés, en présence de chlorure de sodium (NaCl). Au cours de la fabrication des sauces, la chair du poisson est complètement hydrolysée.

 Pâtes: Le poisson ou les crustacés (surtout les crevettes) sont écrasés avec un pourcentage de sel. La pâte obtenue est séchée au soleil avant d’être emballée et mise en fermentation à l’abri de l’air

 Poissons entiers: le poisson entier ou en morceaux salé mis en fermentation puis séché garde l’essentiel de sa forme originale.

Au Bénin, la fermentation du poisson conduit à l’obtention du "Lanhouin" un condiment utilisé comme exhausteur de goût dans plusieurs mets.C’est un produit largement consommé dans le golfe du Bénin, notamment au Bénin, au Togo et au Ghana, pays où vivent ces populations (Essuman 1992 ; Anihouvi et al., 2005). Il est utilisé pour assaisonner principalement les sauces légumes mais aussi les sauces à base de tomate et au poisson fumé, le "monyo", et même parfois le riz au gras et les fritures (Anihouvi et al., 2005, Kindossi et al., 2012).

1.3.4. Fumage et fumage/séchage

Le fumage est un procédé de transformation utilisé pour la conservation des aliments en réduisant leur teneur en eau et la charge microbienne (Köse, 2010). Il permet aussi d’améliorer les caractéristiques organoleptiques des aliments telles que le goût, la texture, l’apparence et la couleur (Berkel et al., 2005 ; CAC/RCP, 2009). Berkel et al. (2005) ont identifié trois procédés de fumage que sont :

 Fumage à froid

Ce type de fumage est difficile dans les pays tropicaux où les températures ambiantes sont très élevées. Le produit fumé à froid n’est pas cuit et offre ainsi un

environnement favorable au développement de la flore d’altération. Ainsi une conservation à froid (température maximale de 30°C) du produit fumé est indispensable (Berkel et al., 2005) .

 Fumage à chaud

Ce type de fumage donne un produit cuit, mais qui ne sèche pas. Le fumage à chaud (65°C et 100°C) offre une durée de conservation courte (48 heures au maximum) (Berkel et al., 2005) .

 Fumage-séchage

10 Contrairement aux autres types de fumage, celui-ci est un fumage au cours duquel le produit est fumé à chaud donc cuit et ensuite séché par continuation du fumage.

Dans les pays tropicaux où 70% des poissons pêchés sont transformés par le fumage, c’est le fumage-séchage qui est réalisé et le procédé dure en moyenne 12-18 heures et des fois plusieurs jours en fonction du produit (Berkel et al., 2005 ; Igwebe et al., 2015). Selon le CODEX STAN 311 (2013), le fumage-séchage est le procédé qui consiste à exposer le poisson à des traitements combinés de fumage et de séchage (45°C et 85°C), de telle manière que le produit final puisse être entreposé et transporté sans réfrigération et de façon à atteindre une activité de l’eau inférieure ou égale à 0,75 (Teneur en eau inférieure ou égale à 10 pour cent), selon qu’il convient pour maîtriser les pathogènes bactériens et une altération fongique.

Au Bénin, plusieurs études ont été réalisées sur le fumage du poisson et ces études se sont intéressées à la qualité microbiologique, au procédé et aux équipements de fumage (Van den Berghe et Oliyide, 1988 ; Dègnon et al., 2013a ; Chabi et al., 2014 ; Kpodékon et al., 2014).

1.4. Actions de la fumée sur le poisson

La fumée est composée d’un mélange de plusieurs composés chimiques dont les phénols, aldéhydes, cétones, acides organiques, alcools, esters, hydrocarbures et divers composés hétérocycliques (Toth et Potthast, 1984; CAC/RCP, 2009). Certains composés tels que les phénols, les carbonyles et les dérivés de furane, les acides organiques et esters affecte les propriétés sensorielles (Couleur, arôme, goût et texture) et la durée de conservation de la viande et du poisson par une action inhibitrice sur le développement bactérien (Berkel et al., 2005 ; Stołyhwo and Sikorski, 2005; Ciecierska and Obiedzinski, 2007; Gomez-Guillén et al., 2009; Yusuf et al., 2015; Igwebe et al., 2015). Les poissons fumés selon les techniques traditionnelles peuvent subir une légère dénaturation des protéines. L’action chimique de la fumée est surtout l’effet antioxydant dû aux phénols sur les lipides du poisson en inhibant la phase de propagation de l’autooxydation (Sainclivier, 1985).

1.5. Effet du fumage sur la qualité sanitaire du poisson

1.5.1. Production des hydrocarbures aromatiques polycycliques au cours du fumage du poisson

Les composés présents dans la fumée n'ont pas toujours des rôles bénéfiques. Le fumage traditionnel peut être à l’origine de la production de contaminants chimiques dont les hydrocarbures polycycliques aromatiques (HAPs) due à la combustion incomplète de la

11 matière organique. D’après le CAC/RCP 68-2009, la formation des HAPs lors du procédé de fumage et de séchage dépend d’un certain nombre de variables, dont :

 Le type de combustible (bois, diesel, gaz, déchets liquides/solides et autres combustibles) ;

 La méthode de fumage ou de séchage (par convection ou indirect); le procédé de production de la fumée par rapport à la température de pyrolyse et du courant d’air dans le cas d’un générateur de fumée ou par rapport aux autres méthodes comme le fumage direct ou la fumée régénérée par atomisation de condensé de fumée (fumée liquide) ;

 La distance entre l’aliment et la source de chaleur ;

 La position de l’aliment par rapport à la source de chaleur ;

 La teneur en graisses de l’aliment et l’effet de la transformation sur cette teneur ;

 La durée du fumage et du séchage par convection ;

 La température pendant le fumage et le séchage par convection ;

 Le modèle de la chambre de fumage et le matériel utilisé pour assurer le mélange fumée/air (qui influence la densité de la fumée dans la chambre de fumage).

L’Union Européenne a ciblé 16 (15+1) HAP prioritaires à analyser dans les aliments que sont : le Benz[a]anthracène (BaA) ; le Benzo[a]Pyrène (BaP) ; le Benzo[b]fluoranthène (BbF) ; Benzo[ghi]perylène (BgP) ; le Benzo[k]fluoranthène (BkF) ; le Chrysène (CHR) ; le Dibenz[a,h]anthrace (DhA) ; l’Indeno[1,2,3-cd]pyrène (IcP) ; le Benzo[j]fluoranthène (BjF) ; le Cyclopenta[cd]pyrène (CPP), le Dibenzo[a,e]pyrène (DeP) ; le Dibenzo[a,h]pyrène (DhP);

le Dibenzo[a,i]pyrène (DiP) ; le Dibenzo[a,l]pyrène (DlP) ; le 5-Methyl chrysène (5MC) et le (Benzo[c]fluorène (BcL) (Danyi et al, 2009). Les HAPs sont formés pendant la combustion incomplète de la matière organique comme le bois, le charbon et l’huile (Yusuf et al., 2015).

Ils sont toxiques même à de très faibles doses avec des effets tératogènes, mutagènes et cancérigènes. Ils sont responsables du retard de croissance, du faible poids à la naissance, de la petite circonférence de la tête, du faible Quotient Intellectuel et de l’interruption du système endocrinien tels que les thyroïdes, les stéroïdes et les œstrogènes (ANSES, 2011 ; Essumang et al., 2011). Yusuf et al. (2015) ont rapporté que des changements sur la peau (épaississement, noircissement, boutons) et des effets liés à la fonction reproductrice tels que la ménopause due à la destruction des ovules peuvent être causés par les HAPs. Parmi les HAPs, le BaP est classé dans le groupe 1 (Agent cancérogène pour l’homme) d’après le Centre International de Recherche sur le Cancer (CIRC). A l’instar du BaP, l’Autorité

12 Européenne de sécurité sanitaire des aliments a défini la somme de 4 HAPs (BaP, BaA, BbF et CHR) comme indicateur de toxicité des HAPs dans les aliments (EFSA, 2008).

Au Bénin, le fumage est très développé dans la conservation de la viande et du poisson (Dègnon et al., 2013ab ; Anihouvi et al., 2013 ; Kpoclou et al., 2013a). Dans les pratiques courantes de transformation, les produits sont disposés sur les claies de fumage en contact direct avec la fumée de combustion (Dègnon et al., 2013ab ; Kpoclou et al., 2013a ; Chabi et al., 2014). Kpoclou et al, (2013b) ont rapporté des concentrations en Benzo(a)pyrène de l’ordre de 91 µg/kg dans les crevettes fumées collectés sur les marché du Bénin, excédant la limite maximale de 2 μg/kg recommandée par la règlementation européenne (CE N°

1881/2006), ce qui pose un problème de santé publique.

1.5.2. Formation des amines biogènes dans le poisson

Les amines biogènes sont des amines non volatiles produites dans des aliments riches en protéine tels que le poisson, la viande, les produits laitiers, les boissons fermentées (bière, vin) résultant de la contamination microbienne conduisant à la décarboxylation des acides aminés (Al Bulushi et al., 2009, Chong et al., 2011; Sagratini et al., 2012) ; Tosukhowong et al.

(2011). Elles sont généralement classées en fonction de leur structure chimique en trois catégories : les amines aromatiques (tyramine et phenyléthylamine), les amines aliphatiques (putrescine, cadaverine, spermine et spermidine) et les amines hétérocycliques (tryptamine et histamine) (Tosukhowong et al., 2011 ; Munir et al., 2016). La formation des amines biogènes en particulier l’histamine dans les aliments est indésirable à cause des effets néfastes sur la santé du consommateur notamment l’hypertension, les allergies alimentaires se manifestant par le vomissement, les maux de tête, la rougeur sur le visage, le cou et la poitrine, les éruptions cutanées, la nausée, les crampes abdominales, la diarrhée) (Kim et al., 2002 ; da Silva et al., 2002; Zaman et al., 2010; Chong et al., 2011). L’histamine résulte de la décarboxylation de l’histidine, acide aminé naturel (Kim et al., 2001).Cette transformation est catalysée par l’histidine décarboxylase, enzyme présente dans certains microorganismes tels que Klebsiella oxycota, Klebsiella pneumonia, Morganella morgani (Onal, 2007 ; EFSA, 2011. Lehane et Olley, 2000, Chong et al., 2011). Plusieurs espèces de poisson sont des hôtes des microorganismes possédant une activité histidine décarboxylase. Parmi ceux-ci on peut citer les Scombridés et des Scombérosocidés (le thon, la bonite, le maquereau), les Clupéidés (Sardines, hareng) et les Coryphénidés (mahi-mahi) qui sont de grands vecteurs de l’intoxication à l’histamine (Kim et al., 2001). La formation des amines biogènes en particulier l’histamine dans les poissons fumés pourraient résulter d’une contamination avant

13 ou après fumage. En effet, la contamination post-capture par les bactéries productrices d’histidine-décarboxylase peut se produire dans les bateaux de pêche, les sites de transformation, la chaîne de distribution et au niveau du consommateur avec les différentes manipulations (Taylor, 1986 ; Chong et al., 2011; Sagratini et al., 2012). De plus, après le fumage des poissons, la température et les conditions hygiéniques de leur conservation constituent des facteurs qui favoriseraient la formation de l’histamine comme l’ont rapporté Chong et al., 2011. Kim et al. (2002) ont montré l’influence de la température sur la charge de Morganella morgani et la formation d’histamine dans les filets de plusieurs espèces de poisson en conservation et sont parvenus à la conclusion que la conservation du poisson à 25°C contribuerait à une charge plus élevée de Morganella morgani et une formation plus importante d’histamine dans le Scomber spp. Lehane et Olley (2000) ont aussi rapporté qu’à une température de conservation des aliments compris entre 25°C et 30°C, Morganella morgani est le principal microorganisme producteur d’histidine-décarboxylase. En outre, au Bénin, le rapport d’enquête QualiSani souligne que les productrices et vendeuses du poisson fumé et du poisson fumé/séché conservent leur poisson à la température ambiante (25-35 °C) dans des équipements de type traditionnel.

14

MATERIEL ET METHODES

15

2. MATERIELS ET METHODES

La démarche méthodologique adoptée suit les principales étapes ci-dessous : - la collecte des échantillons dans les marchés et sites de production,

- les analyses physico-chimiques et nutritionnelles au laboratoire, - l’évaluation sensorielle

- le traitement statistique des résultats.

2.1. Zones et conditions de collecte des échantillons

 Zones de collecte

Cinq Communes (Cotonou, Abomey-Calavi, Aplahoué, Comé et Aguégués) ont été retenues en fonction de leur niveau de production élevé. La figure 2 présente leur localisation géographique au Sud du Bénin.

16 Figure 2 : Représentation géographique des Communes constituant la zone d’étude

Source : Rapport d’enquête QualiSani,(2016)

17

 Conditions de collecte des échantillons

Trente-six échantillons de poissons fumés (Scomber scombrus ; Merluccius polli ; Tilapia guineensis) et de poissons fumés/séchés (Cypselurus cyanopterus; Sphyraena barracuda ; Ethmalosa fimbriata.) ont été collectés au niveau des sites de fumage (trois échantillons par espèce de poisson) et dans les principaux marchés (trois échantillons par espèce de poisson) choisis de façon aléatoire dans la zone d’étude. Les échantillons ont été collectés dans des sachets Stomacher stériles et transportés au laboratoire dans des glacières isothermes préalablement conditionnées avec des accumulateurs de fraicheur (Tableau 2).

Tableau 2: Quantités de poissons fumés et de poisson fumé/séché collectées par espèce et par site de collecte

Espèces et type de fumage Sites de collecte

Total Marché (M) Site de fumage (SF)

Poissons fumés (PF)

Scomber scombrus (Ss) 3 3 6 Merluccius polli (Mp) 3 3 6 Tilapia guineensis (Tg) 3 3 6 Poissons fumés/séchés (PFS)

Cypselurus cyanopterus (Cc) 3 3 6 Sphyraena barracuda (Sb) 3 3 6 Ethmalosa fimbriata (Ef) 3 3 6 Total 18 18 36

2.2. Analyses de laboratoire

Les analyses de laboratoire ont porté sur la détermination des caractéristiques physiques (pH et teneur en eau), et chimiques (amines biogènes et hydrocarbures aromatiques polycycliques) et nutritionnelles (protéines et lipides).

2.2.1. Caractéristiques physiques

 Mesure du pH

Le pH des échantillons a été mesuré par la différence de potentiel existant entre deux électrodes plongées dans chaque échantillon selon la méthode décrite par Anihouvi et al.

(2006). Vingt (20) g de poisson broyé avec un broyeur (Laboratory Blender 2 SP) ont été mélangés à 80 ml d’eau distillée, l’ensemble a été homogénéisé à l’aide d’un barreau aimanté

18 sur un agitateur rotatif (Ika-combimag RCO) et le mélange a été utilisé pour mesurer le pH à l’aide d’un pH-mètre électronique (Inolab pH 7110 WTW 82362 Wellheim, Germany) à électrode de verre.

 Teneur en eau

La teneur en eau a été déterminée par gravimétrie avec pesée de la prise d’essai avant et après séchage à l’étuve (Heraeus T5042) à 103°C ± 2 avec trois répétitions par échantillon (ISO1442 :1973). Cinq (5) g de poisson broyé ont été pesés dans une capsule contenant un tube en verre et dix (10) g de sable marin préalablement taré et séché (103°C ± 2) à l’étuve (Heraeus T5042). L’ensemble (Sable marin + Echantillon) est mélangé à 5 ml d’éthanol (96%) à l’aide du tube en verre et passé au bain marie (95°C, 5min) afin de faire évaporer l’éthanol. Après évaporation au bain marie les capsules sont ensuite séchées à l’étuve à 105°C pendant 72h. Après séchage de la capsule contenant l’échantillon jusqu’à masse constante, la différence entre masse avant et après séchage est utilisée afin d’exprimer le pourcentage (%) de la teneur en eau.

2.2.2. Paramètres chimiques

 Teneur en HAPs

Parmi les 16 HAPs prioritaires de l’Union Européenne, 15 HAPs ont été évalués conformément à la méthode décrite par Brasseur et al. (2007), Veyrand et al. (2007) et Danyi et al. (2009). Cette méthode comprend quatre étapes : extraction ; purification ; injection ; quantification.

 Extraction

L’extraction a été réalisée grâce à la technique « Accelerated Solvent Extraction » (ASE). Les cellules ASE, dans lesquelles deux filtres de cellulose ont été disposés, ont été remplies de 0,5 g de célite (Celite Filter cel, Fluka, Sigma-Aldrich, USA) et 7,5g de florisil (Promochem, Germany) avant d’être lavées avec du dichlorométhane pour éliminer les impuretés. Après le lavage des cellules, un gramme d’échantillon de poisson préalablement broyé (type Laboratory blender 8010E) et lyophilisé (lyophilisateur mobile de type Virtis, the vertis company, INC. Gardiner, New York 12525) a été ajouté à chaque cellule. Les échantillons ont été ensuite extraits avec de l’hexane/acétone (50:50, v/v) dans des vials de 60 ml. Les extraits d’échantillons ont été ensuite transvasés dans des tubes turboVap. Les vials d’extraction ont été rincés avec 2 ml d’hexane qui a été ajouté aux tubes Turbo Vap. Le volume total d’extrait

19 a été ensuite évaporé dans un évaporateur de type TurboVap II, Zymark jusqu’à un volume final de 1 ml. A la fin de l’évaporation, le volume ainsi obtenu a été complété par 5 ml de cyclohexane de manière à obtenir un volume de 6 ml dans chacun des tubes.

 Purification

La purification s’est faite sur phase solide en utilisant des colonnes SPE (Solide Phase Extraction) Cartridges, Marchery-Magel Chromabond. Les colonnes sont d’abord conditionnées avec 15 ml d’acétate d’éthyle et 10 ml de cyclohexane. Ensuite, on fait passer lentement les échantillons sur les colonnes. Les colonnes sont ensuite rincées avec 6 ml d’un mélange de cyclohexane/éthanol (70:30, v/v). Les HAPs sont ensuite élués avec 12 ml de mélange de cyclohexane/acetate d’éthyl (40:60, v/v) (Veyrand et al., 2007). L’éluant est transféré dans les tubes TurboVap et évaporé à sec. Ensuite, le résidu sec est remis en solution dans 90 µl d’acétonitrile et 10 µl de DiP d14 (standard d’injection) y sont ajoutés, avant homogénéisation. 25 µl sont transférés dans des vials HPLC et le reste est conservé dans des vials ambrés conservés à - 20°C.

 Injection sur HPLC

Pour chaque extrait, 5µl de chaque extrait ont été injectés dans un équipement HPLC (High Performance Liquid Chromatography) couplé à un détecteur de Fluorescence (HPLC/ FLD) selon Brasseur et al. (2007) et Danyi et al. (2009). L’HPLC est muni d’une pompede Modèle 600 E et d’une colonne de type VARIAN (Pursuit 3 PAH, S100×4,6 ml), d’un détecteur FLD (Multi 𝛌 fluorescence detector 2475), d’un injecteur automatique de type 717 et d’un four mistral, tous de marque WATERS. La solution de DiP d14 a été utilisée comme standard d’injection. Les courbes de calibration ont été réalisées au moyen de sept solutions de calibrations contenant le mélange des 15 HAPs à des concentrations variant entre 2,5 et 200 pg/µL sauf pour IcP et BjF dont les concentrations varient de 10 à 800 pg/µL. A chaque série d’injection d’échantillon, un blanc-procédure (sans échantillon), un blanc matrice (Poisson Pangasius acheté en grande surface, exempt d’HAP) et une matrice dopée (Echantillon blanc matrice lyophilisé, dopé à une concentration de 1 ppb (poids sec) de chaque HAP sauf BaA, IcP et BjF dont la concentration est de 2 ppb) ayant subi la même procédure que les échantillons sont injectés comme contrôles. Une courbe de calibration, une référence (solution de dopage à une concentration de 10 pg/µL contenant le standard d’injection), une solution commerciale certifiée (LA20950183 CY, Dr Ehrenstorfer GmbH, Germany) 183 (Mélange des 15 HAPs à une concentration de 20 pg/µL chacun) et de l’acétonitrile ont été injectés avec

20 chaque série d’échantillon. La solution commerciale 183 permet de vérifier la justesse instrumentale de la méthode en comparant la concentration recalculée au moyen de la courbe à celle de la solution (20 pg/µL pour chaque HAP), ainsi que la fidélité instrumentale, en calculant l’écart-type et l’écart-type relatif (aussi appelé coefficient de variation) associé à l’analyse répétée de cette solution de référence.

 Quantification

La détection de chaque HAP est faite à travers les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission de ces derniers. La quantification des HAPs est faite sur ordinateur via le programme EMPOWER en utilisant une régression quadratique. La méthode présente trois canaux (A, B et C). La quantification est réalisée en calculant le facteur de réponse pour chaque HAP (aire du HAP/aire DiPD14 présent dans le canal C). Ainsi les Benzo[b]fluoranthène (BbF), Dibenzo[a,l]pyrène (DlP) , Dibenzo[a,h]anthracène (DhA) , Benzo[ghi]perylène (BgP) et Dibenzo[a,e]pyrène (DeP) ont été quantifiés dans le canal A, Benzo[j]fluoranthène (BjF) dans le canal B tandis que les (Benzo[c]fluorène (BcL), Benzo[a]anthracène (BaA), Chrysène (CHR) , 5-Methylchrysène (5MC), Benzo[k]fluoranthène (BkF) , Benzo[a]Pyrène (BaP), Indeno[1,2,3-cd]pyrène (IcP), DiP-D14, Dibenzo[a,i]pyrène (DiP) et Dibenzo[a,h]pyrène (DhP) dans le canal C. Les courbes de calibration de chacun des 15 HAPs sont présentées en annexe 1. Pour chaque HAP, le premier point de la courbe de calibration a été considéré comme étant la limite de quantification inférieure (LOQinf) et le dernier point de courbe comme étant la limite de quantification supérieure (LOQsup). Les LOQ sont résumées dans l’annexe 2 en considérant une teneur moyenne en humidité de 50%. L’incertitude de mesure est estimée à 20%.

 Détermination de la teneur amines biogènes

Dix amines biogènes (méthylamine (MA), tryptamine (TRYP), 2-phényléthylamine (2- phényl), putrescine (PUT), cadavérine (CAD), histamine (HIS), sérotonine (SER), tyramine (TYR), spermidine (SPD) et spermine (SPM)) ont été déterminées suivant la méthode de Kim et al. (2009) modifiée avec 1,7-diaminoheptane comme standard interne. Cette méthode comprend les étapes d’extraction, de dérivatisation, d’injection et de quantification.

 Echantillons utilisés pour la courbe de calibration

Deux grammes de matrice blanche (filet de Pangasius acheté en grande surface en Belgique pour les PF/PFS) mixés ont été pesés dans un tube à essai afin d’établir la courbe de calibration à partir de neuf points (C0, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8). On y a ajouté

21 respectivement 200 µL le standard interne (100 ng/µl, TCA 5%), le pool (mélange des 10 amines biogènes) et de l’acide perchlorique (0,4 M) comme l’indique le tableau 3.

Tableau 3 : Concentrations du pool et volume HClO4 pour chacun des points

Volume pool (µL)

Volume HClO4 0,4M (µL)

Concentration (ng/µL) SPM SPD CAD

PUT MA 2-phenyl

SER

TRYP TYR HIS

0 2300 0 0 0 0 0 0 0

10 2290 0,116 0,069 0,139 0,278 0,278 0,324 0,926

30 2270 0,347 0,208 0,417 0,823 0,833 0,972 2,778

100 2200 1,157 0,694 1,389 2,778 2,778 3,241 9,259

200 2100 2,315 1,389 2,778 5,556 5,556 6,481 18,519

300 2000 3,472 2,083 4,167 8,333 8,333 9,722 27,778

450 1850 5,208 3,125 6,250 12,500 12,500 14,583 41,667

600 1700 6,944 4,167 8,333 16,667 16,667 19,444 55,556

800 1500 9,259 5,556 11,111 22,222 22,222 25,926 74,074

 Extraction

Deux grammes d’échantillon broyé (PF/PFS) sont pesés dans des tubes auxquels 2,3 ml d’acide perchlorique (HClO4, 0,4 M), 200 µL du standard interne (1,7-diaminoheptane) sont ajoutés. L’échantillon est ensuite vortexé puis soumis à une agitation rotative (15min) et centrifugé (3700 g, 5 min). La phase liquide est transférée dans un Falcon et une nouvelle extraction est réalisée à l’aide de 2,5 ml d’acide perchlorique (HClO4, 0,4 M). Après avoir réajusté le volume à 6 ml avec de l’acide perchlorique (HClO4, 0,4 M), un millilitre de l’extrait est ensuite prélevé dans un tube Falcon auquel 200 µL d’hydroxyde de sodium (NaOH 2N) et 300 µL de bicarbonate de sodium saturé (NaHCO3) sont ajoutés et le tout est vortexé.

 Dérivatisation

Afin de permettre aux amines de fluorescer pour être détectées, la dérivatisation est faite en ajoutant 2 ml du chlorure de dansyl (10mg/ml dans l’acétone) puis s’en suit une incubation (15 min à 70°C). Après refroidissement 100 µl de glycine (150 mg/ml dans l’eau) sont ajoutés puis une nouvelle incubation a lieu (15 min à 70°C). Une centrifugation a été réalisée (37 000 g, 5 min). Les extraits ont été filtrés en utilisant des filtres dans des vials d’injection.

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 Injection

Une UPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) couplée à un détecteur de Fluorescence (HPLC/ FLD) et un détecteur à barrettes de diode (PDA), tous de marque Waters (Milford, MA, USA), ont été utilisés. Le système est aussi muni d’un injecteur automatique (Acquity Sample Manager FTN), d’une pompe (Acquity QSM H Class) et d’une colonne de type BEH C18 (2.1 x 100 mm, 1.7 µm), précédée d’une pré colonne UPLC BEH C18 VanGuard (2.1 x 5 mm, 1.7 µm), tous de marque Waters (Milford, MA, USA). Deux matériaux de référence constitués de muscle de thon lyophilisé (Tuna muscle (T1530A -1 et - 2) de Progetto Trieste) avec des concentrations connues (CRM1) en histamine de 155 mg/Kg et la seconde concentration de référence (CRM2) en histamine de 88,6 mg/Kg sont analysés avec chaque série de mesures pour vérifier les performances de la méthode.

 Détection et quantification

La détection et la quantification des amines biogènes (ABs) est faite aussi bien à l’aide du détecteur par fluorescence que du détecteur PDA. Ainsi, pour chaque série d’analyse les concentrations des Abs (Amine Biogène) les plus proches de celle du matériau de référence ont été retenues. Les courbes de calibration de chacune de ses amines sont présentées en annexe 3.

La quantification a été réalisée sur ordinateur via le logiciel EMPOWER (version 3.0) en utilisant une équation de régression quadratique. La quantification est réalisée en calculant la réponse pour chaque AB (aire d’AB/aire du standard interne) versus la concentration.

La concentration (C) de chaque AB (Amine Biogène) est calculée à partir du facteur de réponse de chaque AB comme l’indique la formule ci-après :

𝐶 (𝑚𝑔/𝐾𝑔) =𝑅é𝑝𝑜𝑛𝑠𝑒 − 𝑂𝑟𝑑𝑜𝑛𝑛é𝑒 à 𝑙^′𝑜𝑟𝑖𝑔𝑖𝑛𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑢𝑟𝑏𝑒

𝑃𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑢𝑟𝑏𝑒 ×𝑃𝑜𝑖𝑑𝑠 (𝑔) 2

Pour chaque AB, le premier point (hors zéro) de la courbe de calibration a été considéré comme étant la limite de quantification inférieure (LOQinf) et le dernier point de courbe comme étant la limite de quantification supérieure (LOQsup) (annexe 4).

Aussi, le temps de rétention relatif de chaque AB a été calculé en faisant le rapport du temps de rétention de l’amine biogène par rapport à celui du standard interne. Celui qui a été calculé pour chaque échantillon a été comparé à celui obtenu en moyenne pour la courbe de

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calibration, avec une tolérance de ± 2,5% ∆ (%) =

𝑇𝑒𝑚𝑝𝑠 𝑑𝑒 𝑟é𝑡𝑒𝑛𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑓 𝑑𝑒 𝑙^′é𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛

𝑇𝑒𝑚𝑝𝑠 𝑑𝑒 𝑟é𝑡𝑒𝑛𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑓 𝑚𝑜𝑦𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑢𝑟𝑏𝑒× 100

Avec ∆ (%) ± 2.5% (Décision de la commission 2002/657/CE) 2.2.3. Paramètres nutritionnels

 Teneur en protéines

L’azote total a été déterminé par la méthode de Kjeldahl (NF V 04.407:2002). Cette méthode a permis de déterminer le taux de protéines brutes à partir de la teneur en azote, après minéralisation, distillation et titration. Les ions ammonium contenus dans le distillat ont été dosés par l’acide chlorhydrique (HCl) (0,1 N). La détermination des protéines par la méthode Kjeldahl s’est effectuée en trois étapes. La première étape a consisté à minéraliser ( DK8 Heating Digester Velp Scientifica) à 420°C pendant 1h un (1)g de l’échantillon broyé par chauffage avec 12,5 ml d’acide sulfurique (95%) concentré, en présence d'un catalyseur (Pastille de Kjeldahl).. La deuxième étape a consisté l’alcalinisation des produits de la réaction par distillation de l’ammoniac libéré, recueilli dans 25ml d’une solution d’acide borique (4%) à l’aide d’un distillateur BÜCHI Distillation Unit (K-350). Enfin, la titration de l’ammoniac libéré dans la solution d’acide borique (4%) par une solution d’acide chlorhydrique (0,1N). La teneur en azote a été déterminée comme suit :

% d’azote =

avec V0 = Volume de la solution d'HCl 0,1 N utilisé pour l'essai à blanc, en millilitre V1 = Volume de la solution d'HCl 0,1 N utilisé pour l'échantillon, en millilitre m = Masse de la prise d'essai en g

T= Titre de l’acide en normalité 1,4 = poids molaire de l’azote ×10^-1

La teneur en protéine a été déterminée en multipliant la teneur en Azote par le facteur de conversion de 6,25.

 Teneur en lipides

La matière grasse totale a été déterminée en utilisant la méthode décrite par Folch et al.

(1957). Environ 4,05g d’échantillon broyé ont été traités par 45 ml du mélange de Folch (V1-V0) × T × 1,4

m

24 (chloroforme (2v CHCl3/1v CH3OH) dans un pot en verre contenant environ 1g d'hyflosupercel (poudre abrasive de diatomée facilitant l'extraction de la matière grasse). Le méthanol (CH3

OH) a été utilisé pour rompre les liaisons lipides-protéines, alors que le chloroforme (CHCl3) solubilise la matière grasse. Ensuite, le mélange a été homogénéisé à l’aide de l’Ultra Turrax (IKA T18 basic) 3 fois à 18 000 tours/min en laissant reposer 1 à 2 minutes entre chaque broyage. On y a ajouté ensuite 37 ml de solution de NaCl à 0,73% qu’on a agité fortement et laissé reposer une nuit à température ambiante. Après équilibration complète des phases, on a soutiré la phase inférieure qui contient la matière grasse dans un ballon de 250ml préalablement taré muni d'un entonnoir contenant un filtre séparateur de phase (délipidé 24h dans du chloroforme). Après évaporation du solvant à 50°C grâce à un évaporateur rotatif de type Salvis, la matière grasse a été solubilisée à nouveau avec 10ml de mélange de Folch, puis le ballon a été séché à l’étuve (Heraeus T5042) à 103°C ± 2 pendant une heure. La pesée du résidu de matière grasse permet de calculer la teneur en matière grasse totale.

2.3. Caractérisation sensorielle des poissons fumés et des poissons fumé/séchés

 Echantillons expérimentaux

Cinq (05) espèces de poisson sur les 6 préalablement analysés ont été soumises à une évaluation sensorielle : soit trois (03) espèces de poissons fumés (Scomber scombrus ; Merluccius polli ; Tilapia guineensis) et deux (02) espèces de poisson fumé/séché (Cypselurus cyanopterus et Ethmalosa fimbriata.). La 6^ème (Sphyraena barracuda) espèce de poisson fumé/séché est une espèce saisonnière qui n’était pas disponible pendant la période au cours de laquelle l’évaluation sensorielle a été réalisée. Ces différents poissons fumé et fumé/séché ont été produits sur un site à Xwlacodji dans la ville de Cotonou. Les poissons ont été fumés ou fumés/séchés suivant la méthode traditionnelle décrite dans le rapport d’enquête QualiSani (2016).

 Test sensoriel

La caractérisation des paramètres sensoriels a été faite à l’aide de la méthode CATA (Check All That Apply) décrite par Adams et al. (2007). Cette évaluation sensorielle a été faite en quatre principales étapes.

 Choix et validation des attributs sensoriels

Les attributs sensoriels ont été choisis à partir des critères d’appréciation de la qualité du poisson fumé et du poisson fumé/séché tels qu’évoqués par les acteurs (producteurs,

25 consommateurs et commerçants) de la filière du poisson fumé et du poisson fumé/séché au cours de l’enquête quantitative QualiSani (2016) réalisées dans cinq Communes du Sud- Bénin. Un focus groupe a été ensuite réalisé avec un panel restreint de consommateurs pour la validation de ces attributs. Il a consisté à réunir des consommateurs qui ont un usage fréquent dans l’achat et la consommation du poisson fumé et du poisson fumé/séché. Cet exercice a permis de ne retenir que les attributs purement sensoriels et non ambigus de manière à ce que les juges discriminent au mieux les produits qui leur seront présentés pendant le test sensoriel.

Les tableaux 4 et 5 ci-dessous présentent respectivement les attributs sensoriels retenus pour l’analyse sensorielle du poisson fumé et ceux retenus pour l’analyse sensorielle du poisson fumé/séché.

Tableau 4 : Attributs de qualité / descripteurs du poisson fumé

Attributs de qualité / Descripteurs Définition

Couleur Couleur dorée Couleur caractéristique du poisson bien fumé avec moindre dépôt de fumée

Couleur brillante Aspect de poisson fumé présentant une surface luisante

Couleur trop noire Poisson fumé avec dépôt excessif de tâches ou points noirs

Goût Goût de crevette fumée

Goût caractéristique de produit fumé Goût salé Présence de sel

Goût amer Goût de la nivaquine

Odeur Arôme de fumée Odeur résultant d’un produit cuit au feu de bois Odeur de rance Odeur de l’huile altérée

Odeur ammoniacale Odeur proche de celui du Afitin ou du Lanhouin Texture Texture humide Texture de produit contenant encore de l’eau,

produit un peu humide

Texture ferme Texture compacte (non friable)

Texture tendre Texture de poisson pouvant être mastiqué avec aisance

Texture sèche Texture de produit sec, contenant peu d’eau Texture friable Texture de poisson fumé/séché pouvant s’effriter Degré de Absence de trace de Indicateur d’une bonne cuisson du poisson fumé