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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Lonez, C. (2007). Propriétés anti-inflammatoires des lipides cationiques: rôle des phospholipides (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Chimie, Bruxelles.

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D 03456

ULB

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES Ecole Interfacultaire de Bioingénieurs

Propriétés anti-inflammatoires des lipides cationiques : rôle des phospholipides

Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Agronomiques et Ingénierie Biologique

Février 2007 Caroline LONEZ

Promoteurs : Michel Vandenbranden, Jean-Marie Ruysschaert Centre de Biologie Structurale et de Bioinformatique

Structure et Fonction des Membranes Biologiques

ULB

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES Ecole Interfacultaire de Bioingénieurs

Propriétés anti-inflammatoires des lipides cationiques : rôle des phospholipides

Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Agronomiques et Ingénierie Biologique

Février 2007 Caroline LONEZ

Promoteurs : Michel Vandenbranden, Jean-Marie Ruysschaert Centre de Biologie Structurale et de Bioinformatique

Structure et Fonction des Membranes Biologiques

REMERCIEMENTS

Voicf le moment de remercier tous ceux qui m’ont soutenue durant cette thèse. Ca fait finalement beaucoup de personnes...

Tout d’abord, évidemment, je tenais à remercier Jean-Marie Ruysschaert, qui a dirigé mon travail durant ces quelques années. Merci d’avoir suivi, toujours avec un grand intérêt, mes expériences et les résultats qui en sortaient, pas toujours enthousiasmants... Merci aussi pour votre humour, vos grands discours sur la résurgence de Je ne sais plus quoi (il faudra que Je m’entraîne. Je crois) ou sur les (polis) sacs à rides, vos coups de fils anonymes (ou ceux de Brad Pitt)...

Un tout grand merci également à Abdelatif Elouahabi pour m’avoir appris tout ce qu’il s’avait, enfin presque, enfin beaucoup de choses... Merci pour ta patience, ton exigence et tes conseils.

Toute ma reconnaissance va également à Michel Vandenbranden, l’encyclopédie universelle en 15 volumes, à qui J’ai du poser mille et une questions (par Jour) sur tout et n’importe quoi et qui a toujours répondu patiemment et avec le sourire. Merci aussi pour ta bonne humeur constante et tous les conseils que tu as pu me prodiguer.

Merci aussi Bénédicte pour ton amitié et tout ce qu’on a pu partager durant 9 ans Ÿ

(eh oui, déjà...). Merci d’être toujours là au bon moment.

Je me dois bien sûr de remercier les membres du plus chouette bureau (si si c’est le nôtre. Je vous assure) du labo avec qui J’ai passé tant de temps et sans qui peut-être J’aurais étranglé certaines personnes (Je me comprends...) ou Jeté mon ordinateur à la fenêtre: Vanessa (sniff, le bureau paraît bien vide sans toi... grand merci pour tous tes conseils, les discussions et les coups de nerfs. Ca me manque déjà...), Louis (merci pour tes bruitages incessants qui mettent tant d’ambiance - surtout ceux des pigeons, que J’adore..., tes recettes de cuisine à tester, tes talents de mécanicien - Louis : Tordre, l’efficacité, la méthode - et tout le reste...) et Amandine (merci pour toutes nos longues conversations, les plus sérieuses et les autres, c’est un plaisir de travailler à tes côtés).

Je n’oublie pas non plus tous les membres du labo SFMB (les z’anciens autant que les autres) ; Je ne me risquerai pas à vous citer tous, de peur d’en oublier un ou deux, mais Je vous remercie pour l’ambiance qui règne au labo et toute l’aide que vous avez pu m’apporter.

Merci enfin à ma famille, qui me soutient et m’encourage continuellement.

Merci pour votre confiance.

RESUME DE LA THESE

Les lipides cationiques sont des molécules amphiphiles chargées positivement et couramment utilisées comme vecteur de transfection tant in vitro qu'in vivo avec une bonne efficacité.

Cependant, la transfection in vivo par voie intraveineuse à l'aide de complexes lipides cationiques/ADN (lipoplexes) induit une réponse inflammatoire, attribuée à la présence de séquences CpG dans les plasmides transportés, et qui limite l'efficacité de transfection des complexes.

Il a été montré dans notre laboratoire que la pré-injection de liposomes de diC14-amidine, un lipide cationique mis au point dans notre laboratoire, avant l'injection des lipoplexes diC14-amidine/ADN permettait d'augmenter l'efficacité de transfection tout en diminuant la production de TNF-a dans le sérum [Elouahabi et al., 2003b]. Ce résultat suggérait une nouvelle propriété anti-inflammatoire de la diC14-amidine dans le cas d'une inflammation causée par les lipoplexes de diC14-amidine/ADN.

Dans le présent travail, nous démontrons que les macrophages de la rate sont les principales cellules productrices de TNF-a suite à l'injection intraveineuse des lipoplexes à des souris. Ces mêmes cellules sont également la principale cible des liposomes de diC14-amidine après injection intraveineuse. Nous avons dès lors centré notre étude sur ce type cellulaire, en utilisant une lignée établie de macrophages murins.

Nos résultats ont permis de confirmer la capacité des liposomes de diC14- amidine à inhiber la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires induites par des séquences CpG, des lipopolysaccharides ou des poly(l :C). Fait intéressant, la présence de sérum est indispensable à la propriété anti­

inflammatoire des liposomes de diC14-amidine. Par fractionnement successifs

des composants du sérum, nous avons pu montrer que seuls les phospholipides

des lipoprotéines pouvaient conférer cette propriété aux liposomes de diC14-

amidine.

ABBREVIATIONS

ADN : acide désoxyribonucléique AP-1 : activated protein 1

APC : antisen presenting cell, cellule présentatrice d’antigènes COX : cyclo-oxygénase

CpG ; 2’-déoxyribo (cytidine-phosphate-guanosine)

diC14-amidine : N-t-butyl-N’-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidine

DC-Chol: 3ft-[N-(N',N'-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]Cholesterol Hydrochloride 15dPGJ2 : 15-deoxy-A^^’^''-prostaglandin J2

DDAB : dimethyldioctadecylammonium bromide DMA : acide docosahexaenoique

DMEM : Dulbecco Modified Eagle Medium

DOTAP : 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane DPPC : 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine ELISA : Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay EPA : acide éicosapentanoique

FACS : Fluorescence Activated Cell Sorting FBS : foetal bovin sérum

GPl : glycoinositolphospholipides HBS : hepes buffer saline

HDL : high density lipoprotein

HETE : acide hydroxy-éicosatétranoique HODE : acide hydroxyoctadecanoique

HPETE : acide hydroperoxy-éicosatétranoique IDL : intermediate density lipoprotein

IFN-y : Interféron gamma I k B : inhibiteur de NF- k B IKK : I k B kinase

JNK : c-Jun NH

-terminal kinase LBP : LPS-binding protein

LDL : low density lipoprotein LPS : lipopolysaccharide LTs : leucotriènes LXs : lipoxines

Lyso-PC : lysophosphatidylcholine

MAPK : mitogen-activated protein kinase MyD88 : myeloid différenciation factor 88 NF- k B : nuclear factor kappa-B

ODN : oligodéoxynucléotide

PAMP : pathogen associated molecular pattern

PAPC : L-A-phosphatidylcholine,B-arachidonoyl-gamma-palmitoyl PBS : phosphate buffer saline

PC : phosphatidylcholine PE : phosphatidyléthanolamine PG : phosphatidylglycérol PGs: prostaglandine PI : phosphatidylinositol

PLPC : 1-palmitoyl-2-linoléoyl-L-3 phosphocholine

POPC : 1 -palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine Poly(l :C) : acide polyinosine-polycytidylique

PPAR : peroxisome proliferator-activated receptor PS : phosphatidylsérine

SM : sphingomyéline

SR : scavenger receptor (récepteur éboueur) TLR : toH-like receptor

TNF-a : tumor necrosfs factor-a TRL : triglycéride rich lipoprotein TXs : thromboxanes

VLDL : very low density lipoprotein

I. Introduction... 1

A. Généralités...1

B. Les lipides cationiques...1

B. 1 .Structure... 1

B.2. Propriétés... 3

B. 3. Les lipides cationiques : applications...4

B.3.1 Transfection... 4

B.3.1.1 Les lipoplexes...4

B.3.1.2 Mécanisme d’entrée des lipoplexes dans la cellule...6

B.3.1.3 Utilisation des lipoplexes en transfection... 10

B,3.2 Transport de protéines...11

B.3.3 Les vaccins : adjuvants... 12

B, 3.4 Autres propriétés...12

C. Composants plasmatiques...14

C. 1. Les lipoprotéines... 14

C. 1.1 Structure des lipoprotéines... 14

C.1.2 Composition des lipoprotéines... 15

C. 2. Interaction des composants plasmatiques avec les lipides cationiques... 16

D. Le système immunitaire inné... 18

D. 1 .Principe... 18

D.2.Récepteurs Toll-like...19

D. 3.Réponse inflammatoire induite lors de la transfection par les lipoplexes...20

E. Modulation de la réponse inflammatoire par les lipides... 22

E. I.Les lipides immunomodulateurs...22

E.1.1 Les acides gras...22

E.1.2 Dérivés de l’acide arachidonique...23

E.1.3 Les lipides des lipoprotéines...24

E.1.4 Les phospholipides membranaires... 26

E.1.5 Les lipides associés aux pathogènes...27

E.1.5.1 Lipides immunomodulateurs endogènes induits par les pathogènes... 27

E.1.5.2 Lipides immunomodulateurs exprimés par les pathogènes 27 E.2.Récepteurs de lipides impliqués dans l’immunomodulation... 28

E.2.1 Généralités...28

E.2.2 La liaison des lipides à CD14...29

E.2.3 Les récepteurs scavengers (récepteurs éboueurs)... 29

E.2.4 Les récepteurs PPARs (peroxisome proliferator activated receptors)...30

F. La diC14-amidine... 31

II. But du travail...34

III. Résultats et discussion...35

A. Etude de la source cellulaire de TNF-a après transfection... 35

A. 1 .Biodistribution des lipoplexes dans les différents organes de la souris... 35

A.2.Identification de la source cellulaire responsable de la sécrétion

de TNF-a dans le sang... 37

A.2,1 Production de TNF-a dans les organes... 37

A.2.2 Séparation des différentes populations cellulaires de la rate 38 A. 2.3 Utilisation d’agents supprimant momentanément les macrophages de la rate et/ou du foie...40

A. 3.Biodistnbution des liposomes... 42

B. Effet anti-inflammatoire in vitro...47

B. 1. Importance du sérum...47

B.2. Caractérisation de l’effet anti-inflammatoire...49

B. 2.1 L’effet inhibiteur des liposomes est dépendant du temps de préincubation avec les cellules...49

B.2.2 Inhibition d’une réponse inflammatoire déjà initiée... 50

B.2.3 Plusieurs autres cytokines sont également inhibées... 50

B.2.4 Utilisation d’autres agents inflammatoires... 52

B.3. Identification du composant sérique permettant à la diC14- amidine d’exercer son effet...53

B.3.1 Les lipoprotéines... 54

B.3.2 Les lipides... 55

B.3.3 Les phospholipides...57

B.3.4 Le phospholipide... 58

B.3.4.1 Comparaison avec la PARC oxydée... 59

B.3.4.2 Est-ce que d’autres phosphatidylcholines permettent aussi d’inhiber la sécrétion de TNF-a induite par les séquences CpG ?.... 63

B. 3.4.3 Est-ce que cette propriété est dépendante de la tête polaire du phospholipide ?... 64

B.4. Interaction lipide cationique - phospholipide... 65

B.4.1 L’interaction entre les deux lipides est indispensable à l’effet anti-inflammatoire... 65

B.4.2 Utilisation d’autres lipides cationiques... 69

B.4.3 Capture des phospholipides par les lipides cationiques... 71

IV. Conclusions...73

V. Matériel et Méthodes...78

A. Matériel... 78

A. 1. Tampons et Milieux... 78

A.2. Composés... 78

A.3.Souris... 79

A. 4.Plasmide...79

B. Méthodes... 79

B. 1 .Préparation des liposomes cationiques... 79

B.2. Préparation des lipoplexes de diC14-amidine/ADN...80

B.3. Biodistribution dans la souris de lipoplexes et liposomes radioactifs...80

B.4. Dosage du TNF-a dans les organes après injection des lipoplexes. B.5. Dissociation des cellules de rate... 81

B.6. Enrichissement en cellules adhérentes... 81

B. 7. Déplétion des macrophages de souris...82

B.8. Cytométrie de flux... 82

B.9. Gradient Nycodenz...82

B. 10.Microscopie confocale... 83

B. 11.Culture cellulaire... 83

B. IZ.Traitement des cellules par les lipides cationiques... 83

B.13.Séparation des lipoprotéines du sérum...84

B.14.Extractions lipidiques... 84

B. 14.1 Délipidation des lipoprotéines [Osborne 1986]... 84

B. 14.2 Extraction des lipides totaux [Bligh and Dyer 1959]... 84

B. 14.3 Extraction des phospholipides... 85

B.15.Chromatographie sur couche mince... 85

B. 16.Oxydation lipidique... 85

B.17.Spectrométrie de masse... 86

B. 18.Dosages... 86

B. 18.1 Dosage de TNF-a...86

B. 18.2 Dosage des protéines totales... 86

B. 18.3 Dosage des phospholipides...86

B. 18.4 Détection des cytokines sur membrane... 86

B. 18.5 Capture des liposomes... 87

B.19.Tests statistiques...87

VI. Bibliographie...88

VII. Publications...106

I. INTRODUCTION A. Généralités

Depuis leur utilisation par Peigner en 1987 [Peigner et al., 1987] comme vecteur de matériel génétique, les lipides cationiques n’ont, depuis, cessé d’être étudiés et utilisés pour transférer des gènes dans les cellules tant in vitro qu’in vivo [Legendre et al., 1996 ; Martin et al., 2005]. Bien que leur efficacité in vivo soit bien inférieure à celle obtenue à l’heure actuelle avec la plupart des vecteurs viraux, leur facilité d’utilisation et de production, ainsi que leur faible immugonénicité en font un vecteur non-viral de choix pour la thérapie génique [Karmali and Chaudhuri 2006, Montier et al. 2004].

Des essais cliniques portant sur la mucoviscidose ainsi que sur la thérapie du cancer ont d’ailleurs donné des résultats prometteurs [Hyde et al., 2000 ; Caplen et al., 1995; Alton et al. 1999 ; Montier et al. 2004].

Les études menées actuellement visent principalement à améliorer l’efficacité de transfection in vivo et la spécificité cellulaire des complexes lipides cationiques/ADN, autrement appelés lipoplexes [Karmali and Chaudhuri 2006]. D’autres études ont permis une meilleure connaissance du cheminement des lipoplexes dans la cellule et de leur biodistribution [Elouahabi and Ruysschaert 2005, Zuhorn et al. 2006, Wasungu and Hoeckstra, 2006]. Cependant, les études de leurs effets sur le métabolisme cellulaire sont encore limitées et l’on possède à l’heure actuelle encore très peu d’informations quant aux conséquences de leur utilisation sur des cellules. De plus, les effets du vecteur lui-même sur la physiologie cellulaire sont, de manière générale, assez peu connus.

fi. Les lipides cationiques B.1. Structure

Les lipides cationiques sont des molécules amphiphiles composées généralement de trois domaines (FjsureJ).

La tête polaire détermine la propriété cationique du lipide. Dans la majorité des lipides utilisés en transfection, elle est composée d’un ou plusieurs groupements amines avec différents degrés de substitution. Cependant, d’autres groupements sont utilisés dont, entre autres, des guanidinium, pyrimidinium, phosphonium, arsonium ou amidine [Chesnoy et Huang, 2000 ; Martin et al., 2005].

Puisque la tête polaire est impliquée dans les interactions entre les liposomes

et l’ADN ainsi que dans les interactions avec la surface cellulaire, le nombre

de charges portées par le lipide déterminera, entre autres, son efficacité de

transfection. On distingue de ce fait les lipides monovalents des lipides

multivalents. Puisque ces derniers peuvent former des liposomes portant une

plus grande densité de charge, ils sont généralement considérés comme étant

plus efficaces pour la liaison et le transport de l’ADN [Martin et al., 2005].

HO'

DOTIM

R = R

FIGURE 1 : structure de différents lipides cationiques couramment utilisés A. présentant un squelette dérivé du glycérol (entouré), B. présentant une structure non dérivée du glycérol C. présentant une structure dérivée du cholestérol. DOTMA : 1, 2-dioleyloxypropyl- trimethylammonium chloride ; DMRIE : 1, 2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide ; DOTAP : 1, 2- dioleoyloxy-3-(trimethylammonio) propane chloride; DOSPA: 2,3-dioleyloxy-N-2-(sperminecarboxamido) ethyl-N,N-dimethyl-1- propanammonium ; di-C14 amidine : N-tert-butyl-N’-tetradecyl-3-tetradecyl aminopropionamidine ; DOTIM: 1-[2-(oleoyloxyethyl)2- oleyl-3-(2-hydroxyethyl) imidazolinium chloride ; DDAB : dimethyldioctadecylammonium bromide ; SAINT : synthetic amphiphiles interdisciplinary ; DC-Chol (36)-[N-(N’, N”-dimethylaminoethyl) cartjamoyl] cholestérol ; CTAP : N15-cholesteryloxycarbonyl-3,7,12-tri- azapentadecane-1,15-diamine ; BGTC : bis(guanidinium)-tren-cholesterol [Karmali et Chaudhuri 2006].

La présence de plusieurs sites de protonation facilite la déstabilisation de l’endosome (ypjr. paragrajjbe fl De même, la présence de plusieurs charges par molécule permet l’utilisation d’une moins grande quantité de lipide cationique dans la formulation et de ce fait d’éviter une cytotoxicité [Martin et al., 2005].

Des ligands spécifiques, comme l’acide folique, l’halopéridol, la transferrine, des anticorps spécifiques ou le polyéthylène glycol, peuvent être attachés au groupe cationique pour améliorer la spécificité cellulaire du lipide et sa stabilité dans le sérum [Karmali and Chaudhuri 2006].

La partie liante connecte les parties hydrophile et hydrophobe du lipide et détermine la stabilité et la biodégradabilité du lipide [Legendre et al., 1996 ; Tang et al., 1998]. Elle peut être constituée de groupements esters, éthers, amides, carbamoyles, ou disulfures [Chesnoy et Huang, 2000]. Les liaisons éthers sont généralement plus toxiques que les liaisons biodégradables comme les esters, les amides ou les carbamoyles, cependant, in vivo, il semble que ces groupements éthers stables soient plus efficaces, en terme de transfection, que les liens esters [Ghosh et al., 2000 ; Aberle et al., 1998].

L’utilisation de parties liantes clivables selon certaines conditions (changement de pH, changement de potentiel redox, sensibles à certaines enzymes...) peuvent également faciliter la transfection permettant une meilleure décomplexation des lipoplexes lipides cationiques/ADN dans la cellule [Guo et Szoka 2003 ; Martin et al., 2005].

La queue hydrophobe est composée d’une ou deux chaînes hydrocarbonées ou d’une molécule de cholestérol.

Les lipides cationiques ne portant qu’une seule chaîne aliphatique forment des micelles en solution ; ces lipoplexes sont peu stables et toxiques pour la cellule [Pinnaduwage et al., 1989]. Ils sont donc peu utilisés en transfection.

Les lipides cationiques formés de deux chaînes hydrocarbonées représentent la majorité des lipides synthétisés. Ils forment généralement des liposomes en milieu aqueux, mais sont souvent utilisés avec des co-lipides pour la transfection. La chaîne oléique (C18 :1) est la plus répandue mais des chaînes saturées en Cl4, Cl 6 ou Cl 8 sont couramment utilisées. La longueur de la chaîne alkyle et le degré d’insaturation influencent l’efficacité de transfection [Peigner et al., 1994]. En effet, les chaînes insaturées permettent de meilleures efficacités de transfection car elles augmentent la fluidité de la membrane mais elles sont sensibles à l’oxydation. Les chaînes plus courtes facilitent quant à elles les mélanges intermembranaires, un facteur important pour sortir de l’endosome [Peigner et al., 1994] (yo/r PûCdSr<?P.(??..5.3..1..2). Les lipides dérivés du cholestérol sont quant à eux généralement mélangés avec des co-lipides neutres pour former des formulations liposomiales stables [Gao et Huang, 1991].

Le squelette général du lipide est variable et peut être classé en 3 groupes [Karmali and Chaudhuri 2006]:

Les premiers lipides cationiques étaient tous dérivés du glvcérol. Dans ce

groupe on retrouve le DOTAP, DMRIE, DOSPA, ...

Micelles

>•

Liposomes (bicouche)

Micelles inverses

FIGURE 2 ; représentation schématique de l’organisation des lipides en phase aqueuse en fonction de la géométrie de la molécule. [D’après Wasungu et Hoeckstra 2006]

Le deuxième groupe comprend les dérivés du cholestérol qui possèdent un cholestérol comme partie hydrophobe et une liaison carbamate. Dans ce groupe l’on retrouve le DC-Chol, BCTC, CTAP, ...

Le troisième groupe est constitué de structures plus hétéroclites. Des exemples importants de ce groupe sont le DOGS, diC14-amidine, DOTIM, SAINT...

Le mécanisme d’entrée par endocytose (vp/r paragraphe ayant été établi, l’acidification du compartiment endosomial a été exploitée pour construire de nouveaux lipides cationiques fusionnant avec les membranes aux ph acides, facilitant leur sortie de l’endosome. Parmi ces lipides cationiques plus récents, citons les surfactants jumeaux ou « gemini » (dérivés de sucres ou de lysine) obtenus en reliant deux surfactants simple chaîne par leurs têtes polaires [Wasungu et al., 2006 ; Bell et al., 2003].

B.2. Propriétés

De par leur nature amphiphile, les lipides cationiques forment des liposomes ou des micelles en milieu aqueux [Wasungu and Hoeckstra, 2006]. La structure formée dépend de la répartition entre les domaines hydrophiles et hydrophones (F/gure 2).

Si le volume occupé par les deux domaines est équivalent, la molécule adopte une forme cylindrique qui favorisera la formation de bicouches lipidiques menant à une structure liposomiale. Si par contre les deux domaines ont des volumes différents, le lipide adopte une forme conique qui favorise la formation de micelles (si la tête hydrophile est plus volumineuse que la partie hydrophobe) ou de micelles inverses (si la partie hydrophile est moins volumineuse que la partie hydrophobe). L’ajout d’un co-lipide tel que la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) ou le cholestérol permet de modifier la stabilité de la structure formée [Hui et al., 1996 ; Liu Y. et al., 1997].

Comme pour les phospholipides classiques, plusieurs techniques de préparation des liposomes sont utilisées. La méthode la plus répandue est celle de l’hydratation de films lipidiques obtenus après évaporation d’un solvant organique sous flux d’azote. Le film est hydraté puis mélangé sous agitation mécanique. On obtient alors des vésicules multilamellaires (MLV) de tailles variables (300 à 700 nm). Pour obtenir des vésicules de plus petites tailles et unilamellaires (SDV, de 20 - 100 nm), la préparation liposomiale est soniquée. Toutefois ces préparations sont moins efficaces pour la transfection in vitro que les vésicules multilamellaires. De plus, cette méthode peut causer la dégradation des lipides [Peigner et al., 1994; Liu Y. et al., 1997].

Une méthode plus douce peut être utilisée pour réduire la taille des liposomes

: Textrusion au travers de filtres de polycarbonates percés de pores de tailles

définies. La population liposomiale obtenue présente une stabilité colloïdale

et des caractéristiques intéressantes pour leur utilisation in vivo [Zelphati et

al., 1998].

DMRlE:DOPE(1:1) (+1)

Figure 3 : Modèle théorique du complexe liposomes/ADN [Peigner and Ringold, 1989]

DOSPA;DOPE (1:1) i+51

Figure 4 : Illustration schématique de l’effet de la force Ionique sur la structure des lipoplexes. A faible force ionique, l’ADN se lie très fortement à la surface des vésicules cationiques. A force ionique élevée, l’ADN est partiellement déplacé de la surface des vésicules de lipides cationiques [Eastman et coll., 1997]

Figure 5 : Représentation schématique du modèle "spaghetti-boulettes" [Sternberg et al., 1994]

B.3. Les lipides cationiques : applications B.3.1 T.r.ç!.o.?I.?.ç.P.i.ç.n.

En raison de la taille des plasmides d’ADN et de leur charge négative, l’entrée spontanée d’ADN nu dans les cellules est souvent un procédé inefficace. Si l’on veut transférer des gènes avec succès dans des cellules, l’utilisation d’un vecteur est indispensable. Les vecteurs de transfection peuvent être classés en deux groupes : les vecteurs viraux et les vecteurs non-viraux. Le lecteur trouvera une description détaillée des différents types de vecteurs non-viraux (lipides cationiques, polymères, dendrimères, électroporation ...) dans des revues récentes [Brown et al. 2001 ; De Laporte et al., 2006 ; El Aneed 2004 ; Montier et al., 2004]. Nous ne décrirons ici que les lipides cationiques, qui sont couramment utilisés pour le transfert de gènes dans les cellules.

B.3.1.1 Les lipoplexes

(a) Structure des lipoplexes

Chargés positivement, les liposomes cationiques forment facilement des complexes appelés lipoplexes avec les acides nucléiques par interactions électrostatiques. Plusieurs études ont été menées pour caractériser la morphologie des lipoplexes formés. Divers modèles ont été proposés pour les complexes lipides cationiques/ADN, autrement nommés lipoplexes. De manière générale, ces modèles peuvent être classés en deux catégories selon l’orientation de l’ADN et des lipides cationiques. Dans les premiers modèles, l’ADN est adsorbé à la surface des liposomes cationiques, dans les seconds, des bicouches de lipides cationiques recouvrent l’ADN. Cela nécessite dès lors une réorganisation complète des lipides. La variabilité de ces modèles peut dépendre de la nature du lipide cationique utilisé, du rapport lipide/ADN, ainsi que des techniques utilisées pour les étudier (par diffraction des rayons X aux petits angles, microscopie électronique, mesures de potentiel de charges...). D’autre part, les différences observées avec un même lipide cationique peuvent être attribuées au manque de contrôle de certaines variables impliquées dans la préparation des complexes (température, vitesse du mélange, agitation, ...) [Rakhmanova et al., 2004]. Enfin, il semble qu’au sein d’une même préparation, plusieurs structures puissent coexister [Zabner et al., 1995].

O Modèles externes

Initialement, un modèle théorique basé sur le calcul du nombre de charges positives par liposome et de leur neutralisation par les résidus phosphate de l’ADN propose que les lipoplexes sont formés de 4 liposomes cationiques intacts liés à une copie d’ADN plasmidique à l’aide d’interactions électrostatiques {fisure 3) [Peigner et Ringold , 1989].

Eastman et ses collaborateurs [1997] ont ensuite démontré que la majorité des molécules d'ADN était adsorbée à la surface des liposomes {fisure 4).

Cette organisation dépend de la force ionique du milieu. A faible force

ionique, l’ADN est fortement lié aux liposomes et les charges sont

neutralisées. Lorsque la force ionique augmente, l'ADN est moins fortement

lié aux têtes polaires et se détache de la surface liposomiale.

Fleure 6 : Images par microcopie électronique des complexes DOTMA:DOPE/ADN préparés à différents rapports des charges lipides/ADN. Pour des faibles rapports lipides/ADN, les complexes forment des agrégats (A), et lorsque ce rapport augmente, les liposomes fusionnent en une structure tubulaire (B) [Gershon, 1993]

Figure 7 : Modèle de la structure multilamellaire des lipoplexes constitués de la superposition de bicouches lipidiques et de monocouches d’ADN. doNA ■ espace interaxial ; D=5„+ôm est l’espace intercouche [Radier et al., 1997].

Figure 8 : Modèle de structure en phase hexagonale Hn' inverse [Koltover et al., 1998]

O Modèles impliquant un réarrangement de la bicouche lipidique

Sternberg et ses collaborateurs [1994] ont décrit des lipoplexes formés de DC- Chol comme des agrégats de liposomes cationiques entourés de molécules d’ADN (boulettes) qui co-existent avec des structures tubulaires composées de molécules d’ADN recouvertes de bicouches lipidiques (spaghetti) ({îsure.S).

Gershon et ses collaborateurs [1993] ont décrit la même structure pour des complexes de DOTMA/DOPE {fjsure 6). Aux faibles rapports de charges lipides/ADN, les lipides sont adsorbés à la surface des molécules d’ADN formant des agrégats qui entourent progressivement de larges segments d’ADN, Au delà d’une certaine concentration critique en lipides, il y a fusion des membranes et condensation de l’ADN. Dès lors, l’ADN est recouvert d’une bicouche lipidique sur toute la longueur du plasmide.

Radier et ses collaborateurs ont décrit une structure multilamellaire [Radier et al., 1997], Le mélange des lipides cationiques (DOTAP/DOPC ou DDAB/Chol) avec l’ADN (à des concentrations élevées compatibles avec les mesures de diffusion aux rayons X) provoque la réorganisation de la structure des liposomes en une structure globulaire (LS), composée de monocouches de filaments d’ADN orientés parallèlement et pris en sandwich entre des bicouches de lipides cationiques (//^ure 7). Une structure similaire a également été proposée pour d’autres lipoplexes [Lasic et al., 1997 ; Cherezov et al., 2002].

Le remplacement de DOPC par du DOPE dans les liposomes composés de DOTAP provoque la transition d’une structure multilamellaire (L*^a) à une structure en phase inverse hexagonale (11*^0) qui consiste en des filaments d’ADN recouverts de monocouches de lipides cationiques organisés en un réseau hexagonal bidimensionnel [Koltover et al., 1998] (/isure.Jt). Les auteurs ont pu établir une corrélation entre cette structure et leur capacité à transfecter. Cette structure est en accord avec les structures décrites par May et Ben-Shaul [1997] ou Dan [1998].

(b) Caractérisation des lipoplexes

En plus de leur morphologie, d’autres caractéristiques physico-chimiques des lipoplexes doivent être considérées.

La proportion relative de lipides cationiques et d’ADN détermine notamment la taille, la charge superficielle (potentiel zêta), l’efficacité de complexion, et l’activité biologique. Des complexes fortement chargés présentent des tailles homogènes (avec un diamètre moyen entre 100 et 450 nm) [Radier et al., 1997 ; Eastman et al., 1997 ; Pires et al., 1999], Par contre, les complexes de charge neutre sont caractérisés par une distribution de tailles plus hétérogènes (diamètre moyen de 350 à 1200 nm) et présentent une stabilité inférieure à celle des complexes formés avec un excès de charges.

Ceci peut être attribué au manque de forces répulsives entre les complexes qui empêcherait leur agrégation [Peigner et al., 1994 ; Pires et al., 1999 ; Zelphati et al., 1998]. De même, les lipoplexes sont généralement préparés à faible force ionique afin de favoriser l’interaction entre l’ADN et les liposomes

-

5

cationiques évitant de ce fait l’agrégation et la sédimentation des complexes [Hirota et al., 1999].

(c) Formulations

L’ajout d’un peptide ou d’une protéine au complexe lipide cationique/ADN permet quelques fois d’améliorer l’efficacité de transfection. Par exemple, le complexe tertiaire lipide cationique/protamine/ADN (LPD) est plus efficace que le complexe lipide cationique/ADN [Li and Huang 1997]. Compacter l’ADN avec un peptide dérivé de l’histone H1 a permis d’améliorer le transfert par des lipopolyamines [Schwartz et al., 1999]. Le complexe composé de DC- chol/DOPE et du peptide mu, dérivé de l’adénovirus, (LMD) a également permis d’obtenir de bonnes efficacité de transfection à des doses très faibles d’ADN [Tagawa et al., 2002].

B.3.1.2 Mécanisme d’entrée des lipoplexes dans la cellule Le mécanisme d’entrée des lipoplexes dans la cellule peut être divisée en plusieurs étapes : la liaison et la capture des lipoplexes par la cellule, la dissociation du complexe et libération de l’ADN et enfin, l’entrée dans le noyau (//'sure ?) [Elouahabi et Ruysschaert 2005].

(a) Liaison à la membrane cellulaire

De manière générale, on considère que l’interaction des lipoplexes avec les cellules en culture, en l’absence de sérum, est non spécifique et implique principalement des interactions électrostatiques entre les complexes chargés positivement et la surface cellulaire chargée négativement (à cause des protéoglycanes de la matrice extracellulaire, des glycoprotéines portant des acides sialiques, et des phospholipides anioniques membranaires) [Pires et al., 1999]. Néanmoins, une étude sur une lignée de macrophages (RAW 264.7) démontre l’importance d’une protéine sensible à la trypsine dans la liaison des lipides cationiques aux cellules [Arima et al., 1997].

L’utilisation de cellules CHO déficientes en protéoglycane cellulaire a permis de démontrer le rôle important de l’héparine et du sulfate d’héparan (et dans une moindre mesure, du sulfate de chondroïtine) dans le mécanisme de transfection [Mislick et Baldeschwieler 1996]. L’inhibition drastique de l’efficacité de transfection dans ces cellules a été corrélée avec une perte de liaison des lipoplexes à la surface des cellules. Ces données ont été ensuite confirmées par des expériences de compétition avec des protéoglycanes libres ainsi qu’en utilisant des enzymes dégradant de manière spécifique les différents protéoglycanes cellulaires [Mislick et Baldeschwieler 1996].

(b) Entrée du complexe dans la cellule

Dans un premier temps, la fusion des lipoplexes avec la membrane plasmique a été suggérée comme le mécanisme permettant l’entrée de l’ADN dans le cytoplasme [Peigner et al., 1987]. Cependant, les résultats expérimentaux ne confortent pas l’idée d’un mécanisme d’entrée passant par la fusion et montrent au contraire que lorsque les lipoplexes fusionnent avec la membrane, l’ADN semble rester à la surface cellulaire et n’entre pas dans la cellule (ypir fisure 9) [Elouahabi et al. 2003b].

-

6

2 .

Fusfc>n.

Dégradatton lysosomiale

Fusion avec la membrane

plasmide

Lésende:

Lipoplexe:

Plasmide: CM»A Liposome: 0

Protéines avec séquence NLS: #

Noyau

Transport au travers des pores

nucléaires

^ 7.

Dbsaclatlon Déstabilisation

la membrane

r Réticulum endoplasmique

Fusion Tr port

des en wsomes

LIberatton près de la membrane

plasmique D^radation

Membrane Plasmique

Figure 9 : Cheminement intracellulaire des lipoplexes. Les lipoplexes, représentés par des disques hachurés vert et bleu, se lient principalement à la cellule, en absence de sérum, à l’aide d’interactions électrostatiques (1). En présence de sérum, les protéines liées aux vecteurs peuvent se lier à des récepteurs à la surface cellulaire. La fusion de certains lipoplexes avec la membrane plasmique est possible mais ne résulte pas en l’entrée de l’ADN dans le cytoplasme (2). L’endocytose est considérée comme le mécanisme principal d’internalisation des lipoplexes dans la cellule (3). Les lipoplexes qui se libèrent de l’endosome trop tôt (près de la membrane plasmique) vont rester loin du noyau et l’ADN sera dégrade par les nucléases cytoplasmiques (4). Le transport cytoplasmique des endosomes peut permettre au vecteur de s’approcher de la région périnucléaire de telle manière que l’ADN libéré ait de grandes chances d’entrer dans le noyau (5). Le schéma actuel de transfection postule que l’ADN doit s’échapper des endosomes avant d’entrer dans le noyau. Le mécanisme de libération des lipoplexes de l’endosome fait intervenir des interactions lipides/lipide telles que la fusion (6) ou le transfert de lipides et la déstabilisation de la membrane endosomiale (6’). La dissodation des lipoplexes résultant en la séparation de l’ADN et des lipides peut se passer durant la sortie des endosomes (7) ou dans le cytoplasme (7’) après la fusion des lipoplexes libérés avec un réseau de membranes cytoplasmiques comme le réticulum endoplasmique. Les lipoplexes incapables de s’échapper des endosomes sont probablement dégradés par les lysosomes (8). L’ADN libéré des lipoplexes peut entrer dans le noyau via deux mécanismes différents et non mutuellement exclusifs. D’abord, l’ADN transfectant peut entrer dans le noyau durant la mitose alors que la membrane nucléaire se dissocie (non représenté) mais ce mécanisme dépend de l’activité de division cellulaire et du temps de vie de l’ADN dans le cytoplasme. Le second mécanisme (9) est un mécanisme actif de transport nucléaire qui requière la présence de séquences spécifiques dans le plasmide permettant son interaction avec des protéines. Le complexe est alors transporté dans le noyau via un mécanisme de transport médié par des signaux de localisation nucléaire (NLS). Il se pourrait aussi que les endosomes remplis de lipoplexes fusionnent directement avec la membrane nucléaire, permettant l’entrée directe de l’ADN dans le noyau (non représenté) [d’après Elouahabi et Ruysschaert 2005].

Diverses études ont révélé que la voie majeure d’entrée des lipoplexes passe par un mécanisme d’endocytose (ou un mécanisme similaire). En effet, par microscopie électronique, on a observé que les lipoplexes (visualisés par coloration de l’ADN par des métaux lourds) sont internalisés dans des vésicules formées à la surface cellulaire par invagination de la membrane plasmique. Plusieurs groupes ont conclu à un mécanisme d’endocytose spontané et non spécifique impliquant des larges vésicules dont les tailles dépassent celles des vésicules tapissées de clathrine {coated pit) [El Ouahabi et al., 1999; Zabner et al., 1995 ; Labat-Moleur et al., 1996 ; El Ouahabi et al., 1997]. D’autres études ont suggéré un rôle probable de l’endocytose via les récepteurs [Zhou et Huang 1994 ; Friend et al., 1996].

Par marquage fluorescent de l’ADN et du lipide cationique, il a été montré que les lipoplexes entiers entrent dans le cytoplasme des cellules et qu’ils se dissocient par la suite [El Ouahabi et al., 1999].

L’utilisation de drogues interférant avec l’endocytose a également confirmé que ce mécanisme représente une voie d’internalisation efficace des lipoplexes mais a surtout permis de spécifier le type d’endocytose impliquée et le rôle de la maturation de l’endosome dans le processus de transfection.

Cependant, l’interprétation de ces données doit être prise avec précaution puisque l’utilisation de telles drogues peut aussi affecter la physiologie cellulaire. Zuhorn et ses collaborateurs ont utilisé la méthyl-6-cyclodextrine pour extraire le cholestérol de la membrane plasmique des cellules [Zuhorn et al., 2002]. Ils ont démontré que l’efficacité de transfection par les lipoplexes, ainsi que leur endocytose était dépendante du cholestérol (l’association des lipoplexes n’étant pas affectée). En utilisant des expériences de co­

localisation avec la transferrine (internalisée via les vésicules tapissées de clathrine), de suppression de potassium (ce qui inhibe la formation des vésicules tapissées), ainsi que des drogues interférant sélectivement avec l’endocytose dépendante de la clathrine (chlorpromazine) ou avec l’endocytose dépendante des cavéoles (Filipin III), ils ont démontré que l’endocytose dépendante de la clathrine était la voie majeure d’entrée pour la transfection par les lipides cationiques [Zuhorn et al., 2002]. De même, un autre groupe a démontré que l’utilisation de cytochalasine B (qui inhibe les voies d’endocytose non dépendantes de clathrine) permettait d’augmenter l’efficacité de transfection par les lipoplexes [Zhou et Huang 1994]. Par contre, d’autres auteurs utilisant les mêmes drogues (suppression de potassium et la cytochalasine B) ont conclu que l’endocytose ne nécessitant pas les récepteurs, ou un mécanisme similaire à la phagocytose, constituait la voie d’internalisation majeure des lipoplexes [Matsui et al., 1997 ; Simoes et al., 2000].

Les divergences entre les conclusions obtenues par les différents groupes pourraient être attribuée aux différents types de lignées cellulaires utilisés pour l’étude du mécanisme de capture [Elouahabi et Ruysschaert, 2005].

D’autre part, la taille des lipoplexes peut, elle aussi, influencer le type

d’endocytose. Ainsi, Rejman et ses collaborateurs [2004] ont montré, en

utilisant des particules de latex fluorescentes de tailles définies, que les

particules de petites tailles (entre 50 et 200 nm) sont principalement

endocytées via les vésicules tapissées de clathrine alors que les particules plus grandes (de 200 à 500 nm) sont internalisées via l’endocytose dépendante des cavéoles. Les particules de 1 pm ne sont, quant à elle, pas internalisées [Rejman et al., 2004], Cependant, cette étude utilisait des cellules non phagocytaires. Les résultats pourraient être dès lors différentes pour d’autres types cellulaires.

(c) Libération cytoplasmique de l’ADN

Le fait que les lipoplexes soient internalisés via un processus d’endocytose pose la question du mécanisme responsable de l’entrée du vecteur dans le cytosol. Les endosomes subissent une maturation rapide se terminant par la fusion avec les lysosomes, une destination qui aboutirait à la dégradation massive de l’ADN. Il faut donc que le complexe puisse s’échapper de l’endosome avant la fusion et la dégradation par les lysosomes. Cette étape, qui nécessite la déstabilisation et la rupture locale de la membrane endosomiale, est cruciale pour l’efficacité de transfection médiée par le complexe lipidique.

La fusion des lipoplexes avec la membrane endosomiale peut permettre la libération de l’ADN et/ou des lipoplexes dans le cytoplasme. Cette hypothèse est étayée par le fait que l’efficacité de la transfection nécessite généralement la présence du lipide fusogène DOPE dans les lipoplexes [Peigner et al., 1994 ; Farhood et al., 1995 ; Fasbender et al., 1997]. La DOPE peut induire la transition d’une structure de bicouche à une structure hexagonale inverse qui catalyse le processus de fusion [Mok et Cullis, 1997 ; Koltover et al., 1998]. La démonstration que les lipoplexes fusionnent avec les membranes endosomiales a été fournie par plusieurs études [Pires et al., 1999

; Stegmann et Legendre, 1997 ; Farhood et al., 1995]. Cependant, aucune évidence expérimentale ne permet de corréler la fusion des lipoplexes avec les cellules et l’efficacité de transfection [Pires et al., 1999 ; Stegmann et Legendre, 1997]. De plus le rôle du co-lipide DOPE ne semble pas limité à la fusion mais concerne également la capture des lipoplexes et la dissociation de l’ADN des lipides [Fasbender et al., 1997].

Xu et Szoka [1996] ont émis l’hypothèse que des mouvements de flip-flop des phospholipides chargés négativement de la face cytoplasmique de la membrane endosomiale vers la monocouche interne permettrait l’interaction avec les charges positives des lipides cationiques. Cela réduirait les interactions électrostatiques entre l’ADN et les lipides cationiques et permettrait la dissociation des lipoplexes. Cependant, considérant la surface occupée par la bicouche de lipide cationique par rapport à celle de la membrane endosomiale (les endosomes apparaissent en effet complètement remplis par les lipoplexes dans les images de microscopie électronique), la plupart des charges ne peuvent pas être neutralisées et seule une faible proportion d’ADN serait libérée. En accord avec cette hypothèse, des lipoplexes non dissociés ont été observés dans le cytosol par microscopie électronique [El Ouahabi et al., 1997 ; Zhou et Huang 1994].

Le mécanisme de libération des lipoplexes de l’endosome vers le cytosol peut

aussi résulter d’une déstabilisation de la membrane endosomiale similaire à

celle que provoquent les détergents {voirfigure 9) [Elouahabi et Ruysschaert 2005]. Une fois largués dans le cytosol, les lipoplexes se dissocient après interaction et/ou fusion avec le réseau de membranes cytoplasmiques (le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, la mitochondrie et la membrane nucléaire). Cela a en effet été suggéré par des expériences de marquage fluorescent des lipoplexes montrant la diffusion de la fluorescence dans tout le réseau membranaire après 1 à 2h d’incubation avec la cellule [El Ouahabi et al., 1999]. Le même phénomène a été observé lorsque les lipoplexes fluorescents sont microinjectés directement dans le cytoplasme cellulaire [Cornelis et al., 2002]. De même, la rupture de l’endosome par choc osmotique, libérant des lipoplexes entiers dans le cytoplasme, ne diminue pas leur efficacité de transfection. Ceci démontre que les lipoplexes ont la capacité de se dissocier après l’étape d’endocytose [Zuhorn et al. 2002b].

Le rôle de la libération des lipoplexes dans la transfection a aussi été étudié en utilisant des drogues interférant avec l’acidification de l’endosome. Par exemple, l’incubation des cellules avec la chloroquine permet d’augmenter l’efficacité de transfection des lipoplexes sans doute de par sa capacité à tamponner le pH de l’endosome/lysosome et en empêchant de ce fait la dégradation de l’ADN [Zhou et Huang 1994 ; Peigner et al., 1994 ; résultats non publiés]. Cependant, cela ne semble pas être une règle générale pour tous les lipoplexes [Peigner et al., 1994]. D’autre part, l’incubation des cellules avec des inhibiteurs de protéases lysosomiales a également permis d’augmenter significativement l’efficacité de transfection par les lipoplexes [Coonrod, A. et al., 1997].

(d) Entrée de l’ADN dans le noyau

Une fois libéré dans le cytoplasme, l’ADN doit migrer rapidement dans le noyau pour être transcrit d’autant plus que la stabilité de l’ADN dans le cytoplasme est compromise par la présence de nucléases [Lechardeur et al., 1999 ; Pollard et al., 2001]. Le noyau est entouré d’une double membrane qui contient des structures de transport hautement régulées, appelées pores nucléaires. Le diamètre fonctionnel moyen de ces pores est d’approximativement 10 nm et paraît limité pour la diffusion libre d’un plasmide dans le noyau. L’entrée passive d’ADN dans le noyau pendant la division cellulaire, lorsque la membrane nucléaire est temporairement désintégrée, est probable pour des cellules en division active, mais la transfection in vivo cible majoritairement des cellules différentiées quiescentes [Brunner et al., 2000]. L’efficacité de la translocation nucléaire de l’ADN plasmidique a été estimée à 1 sur 1000 plasmides et la microinjection d’ADN seul dans le cytoplasme ne conduit à aucune transfection détectable [Pollard et al., 1998, Cornelis et al., 2002].

Néanmoins, l’ADN peut être détecté dans le noyau environ 1 heure après la transfection par les lipoplexes, ce qui suggère que d’autres mécanismes sont impliqués dans ce transport nucléaire [Akita et al., 2004].

Il se pourrait que les lipoplexes délivrés dans le cytoplasme des cellules fusionnent directement avec la membrane nucléaire, permettant ainsi la libération d’ADN dans le noyau [Kamiya et al., 2002]. Cependant, la microinjection cytoplasmique de lipoplexes mène à une faible transfection

^-9-^

alors que leur microinjection nucléaire transfecté 100% des cellules [Cornelis et al., 2002]. La libération des lipoplexes dans le cytosol n’est donc pas suffisante pour la transfection. Par contre, dans les mêmes conditions, l’incubation des cellules avec les lipoplexes mène à une transfection significative. Ces résultats indiquent clairement que l’endocytose possède un autre rôle, encore inconnu, dans la transfection [Cornelis et al., 2002].

Le modèle le plus généralement admis a été proposé par Xu et Szoka [1996] et implique la dissociation de l’ADN et des liposomes cationiques pendant la déstabilisation de l’endosome, ce qui libérerait l’ADN libre dans le cytosol.

Puisque la diffusion de plasmide dans le cytoplasme cellulaire est un processus très lent, l’endocytose pourrait peut-être transporter l’ADN dans la zone périnucléaire, cela augmenterait la probabilité d’entrée de l’ADN dans le noyau [Neves et al. 1999]. En accord avec cette hypothèse, il a été montré que la microinjection d’ADN loin du noyau présente beaucoup moins d’efficacité d’expression que la microinjection près du noyau [Dowty et al.

1995].

Une autre possibilité est la fusion des endosomes contenant les lipoplexes avec le réticulum endoplasmique. Du lumen du réticulum, l’ADN aurait accès au noyau via le réseau continu existant entre les membranes du noyau et du réticulum [Elouahabi et Ruysschaert, 2005]. Cette hypothèse reste cependant à vérifier. Le réseau de microtubules du cytosquelette pourrait être aussi impliqué dans le transport de l’ADN dans le noyau [Vaughan et Dean, 2005].

Enfin, le transport actif du plasmide au travers des pores nucléaires, nécessitant la présence de signaux de localisation nucléaire (NLS), a été suggéré dans certains cas. La présence de certaines séquences dérivées du génome de SV40 dans le plasmide permettrait la liaison de celui-ci avec des facteurs de transcription cytoplasmiques contenant des séquences NLS [Wilson et al., 1999; Dean 1997]. Ce mécanisme pourrait être amélioré en associant des peptides de localisation nucléaire aux lipoplexes mais la faisabilité de cette stratégie n’a pas encore été démontrée pour les études de transfection in vivo.

B.3.1.3 Utilisation des lipoplexes en transfection

Depuis la description du premier lipide cationique comme vecteur de

transport de gènes par Peigner en 1987, de nombreux autres lipides ont été

synthétisés et sont couramment employés pour la transfection de différents

types de cellules eucaryotiques [Peigner et al., 1987 ; Martin et al., 2005 ;

Karmali et Chaudhuri 2006]. De nombreux facteurs peuvent moduler

l’efficacité de transfection in vitro par les lipides cationiques dont

notamment le choix du promoteur dans le plasmide, les caractéristiques

physico-chimiques des complexes (force ionique, rapport lipide/ADN...), les

conditions de transfection (doses de complexes, temps d’incubation, présence

de sérum...) et les conditions de culture cellulaire (type cellulaire,

confluence, ...) [Mahato et al., 1997].

In vivo, les lipoplexes ont été administrés via de nombreuses voies de transport : l’injection intratumorale, intramusculaire, intraveineuse, subcutanée, intratrachéale, ... [Templeton 2002]. L’administration systémique des lipoplexes par voie intraveineuse a été la plus étudiée de par sa facilité d’utilisation et sa capacité à administrer les lipoplexes dans différents organes de la souris (dont principalement les poumons, le foie, la rate, le cœur et les reins) [Zhu et al., 1993, Liu F. et al., 1997, Templeton et al., 1997, McLean et al., 1997]. Les cellules endothéliales des poumons sont les principales cibles des lipoplexes injectés par voie intraveineuse. Quelques formulations liposomiales ont aussi fait l’objet d’études cliniques pour la thérapie génique contre le cancer et la mucoviscidose [Hyde et al., 2000 ; Caplen et al. 1995; Alton et al. 1999 ; Montier et al. 2004]. L’utilisation des lipides cationiques pour transporter des ADN codant pour des antigènes (vaccins génétiques) fait aussi l’objet de diverses études [Sasaki et al., 1997;

Gregoriadis et al., 2002 ; U’Ren et al., 2006].

Le transport d’acides nucléiques dans la cellule ne se limite pas à TADN plasmidique contenant le gène d’intérêt et quelques travaux ont étudié la possibilité de transporter par des lipides cationiques de l’ARNm codant pour une protéine spécifique dans des lignées en culture [Malone et al., 1989 ; El Ouahabi et al., 1996]. Le transport d’oligonucléotides a été beaucoup étudié;

l’utilisation des lipides cationiques permet d’améliorer leur capture par les cellules et leur distribution subcellulaire [Zelphati et Szoka 1996 ; Lindner et al., 2006]. L’utilisation d’oligonucléotides antisens est un outil prometteur pour l’inactivation de gènes dans les cellules tant in vitro que in vivo et l’utilisation de lipide cationique permet d’accroître considérablement leur efficacité [Capaccioli et al., 1993 ; Lebedeva et al., 2000]. Plus récemment, quelques études ont aussi rapporté l’utilisation de lipides cationiques pour le transport de petits ARN interférants (siRNA) [Sioud et Sorensen 2003 ; Dalby et al., 2004 ; Spagnou et al., 2004].

L’utilisation des lipides cationiques pour le transfert de gènes est prometteuse. Les avantages de ces vecteurs sont leur faible cytotoxicité et une apparente tolérance par le système immunitaire, leur facilité d’utilisation et de production [Karmali et Chaudhuri, 2006]. Par rapport aux méthodes virales, les lipides cationiques permettent le transport de larges fragments d’ADN. Certaines études ont même démontré le transfert, bien que très faible, de chromosomes artificiels humains de l’ordre de 1 Mbp dans des cellules en culture [Harrington et al., 1997].

B. 3.2

Les lipides cationiques ont aussi été étudiés comme vecteur de protéines fonctionnelles dans les cellules [Sells et al., 1995 ; Zelphati et al., 2001 ; Dalkara et al., 2004]. L’efficacité du transport varie selon les propriétés de la molécule à transporter, du tampon utilisé pour former le complexe, du temps d’incubation ainsi que du type cellulaire mais de manière générale l’efficacité du transport est supérieure à celle des autres techniques plus classiques (électroporation, précipitation au phosphate de calcium, ...). Les formulations

-

11

de lipides cationiques testées ont permis de transporter divers types de protéines (dont des anticorps et des enzymes) dans des types cellulaires variés dont des cellules primaires ; ces protéines sont fonctionnelles dans le cytoplasme [Zelphati et al., 2001]. L’applicabilité de cette technique dépend principalement de la charge portée par la protéine et de la présence de domaines hydrophobes accessibles. C’est pourquoi elle reste limitée principalement aux protéines anioniques.

6.3.3 Lesxçccjnsj^adiu^^

Les lipides cationiques font également souvent partie des formulations d’adjuvants utilisées pour accroître l’immunogénicité des antigènes dans les vaccins. D’une part, les liposomes permettent d’augmenter la réponse immunitaire en stimulant la formation d’agrégats au site d’injection et en augmentant leur capture par les cellules présentatrices d’antigènes [Gregoriadis 1994 ; Alving 1992 ; Alving 1995]. D’autre part, les charges positives présentes à la surface des liposomes cationiques permettent d’encore accroître leur capture par les cellules et représentent un facteur important dans l’induction de la réponse immunitaire spécifique à l’antigène [Nakanishi et al., 1997; Nakanishi et al., 1999]. De plus, les lipides cationiques interagissent facilement avec beaucoup de molécules utilisées dans les formulations de vaccins (acides nucléiques, antigènes, glycolipides, lipides dérivés de bactéries). Il n’est donc pas étonnant que différents lipides cationiques (DC-Chol, DDAB, DOTAP,...) aient été utilisés seuls ou en combinaison avec d’autres adjuvants pour stimuler, renforcer ou orienter la réponse immunitaire de divers antigènes [Guy et al., 2001; Brunei et al., 1999 ; Rosenkrands et al., 2005 ; Jacquet et al., 2005].

B.3.4

Comme les liposomes classiques, les liposomes cationiques peuvent encapsuler des drogues dans leur phase aqueuse interne [Sengupta et al., 2001; Sanderson et Jones 1996]. Ce type d’application est très limité en raison du faible rendement d’encapsulation de ces drogues.

En dehors des applications citées ci-dessus, des propriétés immunomodulatrices des lipides cationiques ont été rapportées par différents groupes.

Des liposomes constitués de DOPE et de certains lipides cationiques (DOTAP,

DDAB, DMTAP) peuvent inhiber la synthèse de médiateurs de l’inflammation

induite par les lipopolysaccharides (LPS) ou par LPS/interféron-y (IFN-y) sur

des macrophages [Filion et Phillips, 1997a]. Ces lipides permettent d’inhiber la

sécrétion de TNF-a et de NO induites par LPS, mais pas celle de l’interleukine

6 [Filion et Phillips 1997b]. Or la sécrétion de TNF-a et de NO est dépendante

de l’activité de la protéine kinase C alors que celle de l’IL-6 ne l’est pas. De

ce fait, la propriété inhibitrice de ces formulations liposomiales pourrait être

expliquée par l’action inhibitrice des lipides cationiques sur l’activité de la

protéine kinase C (PKC) [Bottega et Epand, 1992; Farhood et al., 1992, Filion

et Phillips 1997b]. Filion et Phillips [1997b] ont également démontré la capacité de ces différents liposomes à inhiber plusieurs modèles inflammatoires in vivo. Il faut noter que le remplacement de DOPE par de la DPPE-PEG2000 (qui diminue l’interaction des liposomes avec la membrane cellulaire), de la DPPC ou de la DMPG (qui ne sont pas fusogénes) suppriment l’activité anti-inflammatoire des lipides cationiques [Filion et Phillips, 1997a, Filion et Phillips 1997b]. Ces résultats suggèrent que la libération des lipides cationiques dans le cytoplasme des macrophages est essentielle pour l’inhibition de l’inflammation.

Ces mêmes auteurs ont montré que l’incubation prolongée (24h) des macrophages (mais pas de cellules non phagocytaires) avec ces formulations de lipides cationiques (pour des doses comprises entre 10 et 1000 pM) induisait un haut degré de toxicité [Filion et Phillips, 1997a]. Alors que la toxicité était déjà observée avec les lipides cationiques seuls, elle est clairement augmentée par l’addition de DOPE. A nouveau, l’addition de DPPC (en remplacement de la DOPE) ou de la DPPE-PEG2000 abolit cette toxicité. Il faut remarquer aussi que si les liposomes sont incubés dès le départ avec du sérum, la toxicité des lipides cationiques est moindre [Filion et Phillips, 1997a].

D’autres auteurs ont également rapporté une cytotoxicité des lipides cationiques (à des doses élevées) pour des incubations prolongées (> 24h) qui provoquerait l’apoptose des macrophages via une voie mitochondriale [Aramaki et al., 1999 ; Aramaki et al., 2001].

Plus récemment, Vangasseri et ses collaborateurs [2006] ont montré que différents lipides cationiques, à l’instar des lipopolysaccharides (LPS), activent l’expression de molécules de co-stimulation (induites lors de l’activation des cellules) à la surface des cellules dendritiques. Cependant, cette activation ne mène pas à l’expression des cytokines pro-inflammatoires habituellement exprimées en réponse aux lipopolysaccharides. Cette propriété dépend de la nature du lipide cationique utilisé, avec une préférence pour les parties hydrophobes à courtes chaînes saturées et les têtes polaires phosphocholines. De plus, les lipides cationiques pouvaient inhiber l’expression des cytokines pro-inflammatoires induites par LPS ce qui suggère aussi une propriété anti-inflammatoire des lipides cationiques [Vangasseri et al., 2006].

Remarquons cependant que les auteurs ont ajouté les LPS aux cellules en présence de lipides cationiques, permettant aux lipides cationiques de s’associer au LPS et d’éventuellement former un complexe. Une autre étude avait montré que des complexes lipides cationiques/LPS, bien que mieux internalisés, étaient incapables d’initier la réponse immunitaire associée au LPS, probablement en empêchant l’interaction de LPS avec son récepteur [Leon-Ponte et al., 2004].

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13

TG et CE

Phospholipides

Apoprotéine Choiestérol

FIGURE 10 : Représentation schématique de la structure d’une lipoprotéine. TG = triglycérides, CE = Esters de cholestérol

C. Composants plasmatiques

Le plasma sanguin contient une grande quantité de protéines solubles (telles que l’albumine, l’haptoglobine, le fibrinogène, les immunoglobulines...) ainsi que des lipoprotéines chargées de transporter les lipides dans l’organisme.

C.1. Les lipoprotéines

C.1.1 SJjuçture,des^^^^

Les lipoprotéines se présentent sous forme de macromolécules globulaires dont la surface est recouverte de groupements polaires et dont le noyau est totalement apolaire (/(sure ,/O). La partie externe des lipoprotéines est composée d’apoprotéines, de cholestérol libre et de phospholipides. Le noyau quant à lui est constitué de triglycérides et de cholestérol estérifié.

Lorsque la teneur en lipides (triglycérides) augmente, la densité des lipoprotéines diminue et le diamètre de la particule augmente, car l’épaisseur de la monocouche externe (apolipoprotéines) ne varie pas (environ 20 Â) et sa densité est supérieure à celle du noyau central. De ce fait, on utilise le paramètre densité pour classifier et séparer les différentes lipoprotéines [Chapman, 1986].

On distingue alors 5 grandes classes de lipoprotéines {tableJ) :

O Les chylomicrons, qui transportent les triglycérides et le cholestérol exogènes (fournis par le régime alimentaire) de l’intestin aux tissus.

O Les lipoprotéines à très faible densité (VLDL) synthétisées par le foie et qui transportent les lipides vers les tissus périphériques.

O Les lipoprotéines à densité intermédiaire (IDL) sont des VLDL métabolisés (ils ont perdus des glycérides).

On regroupe souvent ces trois premiers groupes (chylomicrons, VLDL et IDL) sous la dénomination de lipoprotéines riches en triglycérides (TRL).

O Les lipoprotéines de faible densité (LDL), qui dérivent des IDL sont enrichies en cholestérol et le transportent vers les tissus.

O Les lipoprotéines de haute densité (HDL) qui transportent le cholestérol endogène des tissus au foie.

Table 1 : Propriétés des lipoprotéines plasmatiques humaines Diamètre

(nm)

Densité (g/ml)

Prot Chol PL L CE TG apoprotéine

% massique

VLDL 30 - 80 0.93-1.006 7.7 6.7 18.6 14.9 49.9 B-100, Cl, Cl, C3, E IDL 25 - 35 1.006-1.019 19 8.4 23.3 29.1 20.2 B-100, Cl, C2, C3, E

LDL 18 - 25 1.019-1.063 20.9 9 22.1 38 11.2 B-100

HDL 5 - 12 1.063-1.210 51.9 2.9 22.7 15 8 Al, Al, Cl, C2, C3, E TG ; Triglycérides ; Chol : Cholestérol ; CE : esters de cholestérol ; PL ; Phospholipides ; Prot : Protéines.

D'après Chapman J., 1986, in Methods in Enzymoiogy, Voi 128, p 70-143