Développement d'un modèle de cicatrisation épidermique après une désépidermisation laser

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ TOULOUSE III

Discipline: Ingénierie Médicale et Biologique

Par

M. younes FERRAQ

TITRE DE LA THÈSE:

DÉVELOPPEMENT D'UN MODÈLE DE CICATRISATION

ÉPIDERMIQUE

APRÈS UNE DÉSÉPIDERMISATION LASER

Directeur de thèse:

Professeur Jean-Louis GROLLEAU

JURY

Président Jean Louis GROLLEAU professeur des Universités & praticien Rapporteurs Hassan ZAHOUANI professeur des Universités, UMR 5513

Dominique CASANOVA PH PU, Hôpital Nord, Marseille

Examinateurs Serge MORDON Directeur de recherche, INSERM- Lille Jean-Pierre CHAVOIN PH PU

Membre invité Anne Marie SCHMITT Dermatologue

Je tiens d'abord à remercier le professeur Jean-Louis GROLLEAU, pour avoir

accepter de diriger cette thèse, au sein du laboratoire d'Anthropobiologie, sous la

direction de Monsieur Eric CRUBEZY.

De la même manière que je remercie le Dr Anne-Marie SCHMITT

pour m'avoir

accueilli au sein du Centre européen de Recherche sur la peau [Institut de Recherche

Pierre Fabre], dans l'équipe d'Ingénierie cutanée, et tout particulièrement M.

Jean-Michel LAGARDE et le Dr David BLACK, pour m'avoir accueilli à leurs côtés, pour

la confiance qu'ils m'ont accordé, pour leur enthousiasme et leur plaisir à partager

leurs connaissances. Je remercie également le Pr. Serge MORDON et le Dr Serge

DAHAN pour leurs aides précieuses, ainsi que G.JOSSE, G.GEORGE et N.DZIK

pour leur disponibilité et leurs conseils avisés.

Je suis très sensible à l’honneur que m’ont fait Messieurs Hassan ZAHOUANI,

professeur à l'École Centrale de Lyon, le professeur Dominique CASANOVA

dermatologue à l'hôpital Nord Marseille, en acceptant d’être rapporteurs de ce travail

et de le juger.

J’adresse mes remerciements à Monsieur Serge MORDON, Directeur de recherche

dans une unité de recherche INSERM, d’avoir accepté de faire partie de mon jury de

thèse.

Je remercie également les personnes du laboratoire avec qui j’ai travaillé, pour la

contribution qu’ils ont apportée à mon travail de doctorat et spécialement le Dr

J.Theunis, les membres du laboratoire de biologie cellulaire et du laboratoire de la

biochimie cutanée du centre Jean Louis Alibert. Sans oublier le personnel et les

étudiants du laboratoire de neuro-Gastroentérologie et nutrition à l'INRA-Toulouse.

Je tiens à remercier tous mes collègues du laboratoire et très spécialement M. Jean

Louis FRERE et Madame Sabine PUTAU pour leur bonne humeur.

Je n’oublie pas dans mes remerciements tout le personnel du CRP (Chercheurs,

Techniciens, Secrétaires) que j’ai côtoyé et qui ont facilité mon intégration au sein du

Ce manuscrit étant, pour ainsi dire, le point final à de nombreuses années

d’études, c’est ici l’occasion de remercier les deux personnes sans lesquelles ce

travail n'aurai pas pu être réaliser: Mes Parents qui ont toujours étés là pour moi

et qui ont su m’encourager dans mes choix. Sans oublier Ma Pharmacienne, et

Mon Informaticien "Privés", qui ont su me soutenir dans mon travail.

TABLE DES MATIERES

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Liste des annexes

Annexe 1: Illustration des différents types cellulaires de la peau, avec ses différentes couches. (1) SC, (2) le stratum compactum, (3) la couche épineuse, (4) la couche granuleuse et (5) la couche Basale.

Annexe 2: Différents types de laser utilisés en dermatologie.

Annexe 3: Valeurs mesurées des épaisseurs de l'épiderme séparé thermiquement. Annexe 4: Fluences appliquées en fonction des paramètres du faisceau laser utilisée Annexe 5: Protocole et paramètres d'acquisition des images par technique de projection de

frange.(Protocole EoTech.)

Annexe 6: Valeurs mesurées des épaisseurs de l'épiderme de peau entière

Annexe 7: Protocole de réalisation et de coloration de coupes histologiques (inclusion en paraffine).

Annexe 8: Valeurs des profondeurs de trois lésions réalisées au moyen de 10, 50 et 200J/cm². Annexe 9: Valeurs mesurées des différentes profondeurs réalisées par 10, 20, 30, 40 et 50 J/cm² Annexe 10: Valeurs mesurées des différentes lésions induites chez des rats Hairless. Étude de

reproductibilité de l'induction des lésions (fluence=20J/cm²).

Annexe 11: Valeurs mesurées des différentes lésions induites chez des rats Hairless. Étude de reproductibilité de l'induction des lésions (fluence=100J/cm²).

Annexe 12: Valeurs mesurées de la PIE en fonction du temps.

Annexe 13: Protocole comité de l'étude clinique de validation du laser Er:YAG. Annexe 14: Prototype de la pompe utilisée pour créer les bulles de succions

Annexe 15: illustration du laser SMART 2940 (DEKA ). (a): le laser SMART 2940, (b): le scanner, (c): pièce à main pour le balayage.

Annexe 16: Évaluation de la taille des lésions, après induction, par photos couleur calibrées. les lésions induites par laser et BS.

Annexe 17: Mesure de profondeur d'exemple de lésions induite par laser et par bulle de succion Annexe 18: Évaluation de la taille des lésions par photos couleur calibrées en fonction du

temps. Les valeurs sont des moyennes de toutes les lésions des différents volontaires. Annexe 19: Évaluation de la profondeur des différents types de lésions, après induction, par

technique d’empreintes cutanées couplée à la projection de frange.

Annexe 20: Évaluation de la mise en place de la fonction barrière de la peau par mesure de la perte insensible en eau (PIE).

Annexe 21: Mesure du flux sanguin cutané par laser doppler, au niveau des différentes lésions. Annexe 22: Mesures de la contraction des deux types de lésions.

L

APTD Ar2 CO² CSF1 EGF Er: YAG Er3+ HeNe IGF IR IL1 ILGF1 KGF Kr2 KTP MCP1 MEC MMP Nd3+ OCT PDGF PDL QS TGFα&β TNFα UV VEGF Xe2 YAG β FGF CW ROI PIE

Argon Pumped Tunable Dye Argon

Dioxyde de carbone

Colony-stimulating factor 1 Epidermal growth factor

Erbium: Yttrium Aluminium Garnet Erbium

Hélium-néon

Insulin-like growth factor Infrarouge

Interleukin-1

Insulin-like growth factor 1 Keratinocyte growth factor Krypton

potassium-titanyl-phosphate

Monocyte Chemoattractant Protein 1 Matrice extracellulaire

Matrix Metalloproteinase Néodyme

Optical Coherent Tomography Platelet differentiation growth factor Pulsed Dye Laser

Quality-switched

Transforming growth factor α & β Tumor Necrosis Factorα

Ultra violet

Vascular Endothelial growth factor xénon

Yttrium Aluminium Garnet β fibroblast growth factor Continuous Wave

Region Of Interest Perte Insensible en eau

C

Contexte

La peau et les épithéliums sont en général les seuls tissus humains capables de se régénérer. Cette propriété confère à la peau un rôle protecteur essentiel au maintien de l'homéostasie de l'organisme. Cette régénération est normalement active pour renouveler et maintenir la fonction barrière, ou exceptionnellement active lors de la réparation suite à une lésion ou plaie cutanée. Ce processus coordonne la prolifération synchronisée de plusieurs tissus (épithélial, connectif, endothélial) afin de restituer la barrière cutanée le plus rapidement possible. Ainsi, chez des sujets sains, ce processus se déroule sans complication. En revanche, chez les personnes développant certaine maladie systémique peuvent être sujet à des complications. En effet, ce processus de régénération tissulaire est compromis et se traduit par un dysfonctionnement d'un ou plusieurs composants du processus, entraînant une cicatrice non-réparée, prolongée ou dystrophique.

Un exemple d'une complication de cicatrisation est l'ulcère de jambe chez des personnes atteintes d'une insuffisance veineuse chronique. La pathologie est complexe, mais en générale, la cicatrisation est ralentie laissant exposer la plaie à des infections microbiennes, qui ralentissent encore processus.

L'impacte socio-économique de telles complications est très important, notamment par le coût élevé des soins des malades en raison d'un long séjour d'hospitalisation. Il a été estimé, en 2002, aux États Unis, que sur 350 patients, 14% présentent des complications post-chirurgicales au niveau des lésions. En Europe, les dépenses engendrées par ces complications sont importante est se chiffre entre 1.45 à 19.1 milliards d'euros[1]. Ces constatations s'appliquent aussi à d'autres types de lésions, ainsi les ulcères de jambe qui touchent 3.6% de la population au Royaume-Uni et coûtent 150 à 400 millions de livres sterling par an. De la même manière, les ulcérations par pression représentent, à eux seuls, 4% des dépenses du NHS (National Health Service) au Royaume-Unis. L'augmentation de ces dépenses est d'autant plus importante que la durée des séjours hospitaliers de ces patients est prolongée.

Ce problème risque de s'aggraver en raison des changements du style de vie (sédentaire, alimentation…) qui seraient à l'origine d'une augmentation de l'incidence de diabètes qui est souvent la cause des plaies chroniques sur les membres inférieures.

De ce fait, il est impératif d'améliorer la prise en charge des malades avec des plaies chroniques et leurs traitements afin de prévenir ces dépenses. Les recherches portant sur la compréhension du processus de cicatrisation sont nécessaires à la définition des meilleures modalités thérapeutiques.

Un des obstacles dans la recherche sur la cicatrisation est le manque d'un modèle humain du processus qui est suffisamment fiable pour permettre des études d'investigation objectives et non-invasives. La fiabilité d'un tel modèle dépend donc de plusieurs critères tels que l'endroit d'induction des plaies qui doit être standardisée afin d'être comparable.

L'originalité de cette thèse est la présentation d'une nouvelle technique d'induction des lésions épidermiques chez l'homme par laser, et leur évaluation par des méthodes instrumentales non-invasives.

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Chapitre I

Introduction: La peau

I. LA PEAU

I.A. GÉNÉRALITÉS

Figure 1: Représentation 3D de la peau humaine avec les structures annexes. [2]

La peau est définie comme étant l'organe de revêtement extérieur du corps de l'homme et des animaux. Elle est constituée de trois tissus superposés: l'épiderme, le derme et l'hypoderme (Figure 1). Ses annexes, localisées dans le derme, sont représentées par les phanères (poils et ongles), les glandes sébacées et les sudoripares. Le derme contient aussi des récepteurs sensoriels à la pression et à la température, associé à un réseau microcirculatoire et de fibres nerveuses. L'épaisseur de la peau varie selon le sexe, l'âge et la région du corps. Elle est plus mince chez les femmes, chez les personnes âgées, au niveau des paupières et des organes génitaux (1 mm). En revanche, elle est plus épaisse au niveau de la zone palmo-plantaires (environ 4 mm).

La peau possède de nombreuses fonctions impliquées principalement dans le maintien de l'homéostasie de l'organisme, et notamment dans la thermorégulation, la défense contre les agressions extérieures et les agents exogènes. Elle joue également un rôle dans les fonctions sensorielles et métaboliques tel que la synthèse de vitamine D.

I.B.1. L'

ÉPIDERME

L'épiderme est la couche la plus superficielle de la peau. Il est constitué d'un épithélium pavimenteux, stratifié et kératinisé et mesure en moyenne 0,1mm d'épaisseur. Il est constitué de quatre populations cellulaires différentes: les kératinocytes, les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les cellules de Merkel.

I.B.1.1. CELLULES DE L'ÉPIDERME

Les Kératinocytes (du grec kéras, corne) sont les cellules les plus abondantes, environ 80% de la population cellulaire de l'épiderme. Leur principale caractéristique est leur capacité à se différencier en fabriquant de la kératine selon un processus appelé kératinisation. La kératine est une protéine fibreuse, qui confère à l'épiderme sa fonction de protection.

Les kératines (ou cytokératines) appartiennent à une famille de protéines fibreuses à structure α-hélicoïdale. Il s'agit de dimères à six chaînes polypeptidiques s'organisant pour former des filaments de 8 nm de diamètre. Il existe vingt formes distinctes de kératine dans l'épithélium humain et dix autres dans les cheveux et les ongles [3].

Les kératinocytes naissent au niveau de la couche la plus profonde de l'épiderme (la couche basale), et migrent à la surface en se différenciant. La différentiation des kératinocytes se fait de façon centrifuge, au fur et à mesure qu'elles s'éloignent de la jonction dermo-épidermique. Ces cellules épithéliales se chargent de kératine pour se transformer de kératinocytes basaux en kératinocytes cornés (cornéocytes). Ces derniers sont caractérisés par un cytoplasme rempli de tonofilaments et un feuillet interne épaissi.

Les mélanocytes (du grec melas, noir) sont des cellules capables de synthétiser la mélanine localisée dans des granules appelés mélanosomes. La mélanine possède la propriété d'absorption des rayons UV du soleil qui n'ayant pas été réfléchis par la surface de la peau. Elle absorbe les rayonnements de 200 à 2000 nm, et protège ainsi les cellules et ses organites vitaux.

Seules les cellules de Langerhans localisées au niveau de l'épiderme appartiennent au système immunitaire. Ces cellules ressemblent à la famille des cellules dendritiques, et remplissent le rôle de sentinelle au niveau de l'épiderme. Elles jouent un rôle dans l'immunité non-spécifique par présentation d'antigène phagocyté aux lymphocytes T au niveau des ganglions lymphatiques.[4]

Les cellules de Merkel: sont des cellules neuro-endocrines. Elles sont impliquées dans le tact et produisent des substances neuroactives tels que le VIP ( peptide intestinal

Chapitre I

Introduction: La peau

vasoactif), la substance P[5], la somatostatine et la sérotonine. Ces molécules permettent probablement l'échange d'informations avec les neurones adjacents.

I.B.1.2. ORGANISATION DE L'ÉPIDERME

L'ensemble des cellules de l'épiderme est organisé en plusieurs strates. Les kératinocytes sont ainsi répartis en quatre ou cinq couches superposées, expliquant le caractère stratifié de l'épiderme (Figure.2):

Le stratum basal appelé aussi couche germinative est la couche la plus profonde de l'épiderme, en contact avec la jonction dermo-épidermique. Ses kératinocytes, de forme cylindrique et perpendiculaire aux papilles dermiques, forment une couche monocellulaire.

Comme la plupart des cellules, les kératinocytes sont reliés par des jonctions de types gap, canaux transmembranaires formés de molécules de connexines, qui permettent des échanges directs entre les cellules. La communication par ces jonctions joue un rôle essentiel dans le contrôle de l'homéostasie kératinocytaire, et l'apport de nutriments à l'épiderme.

Le cytoplasme des kératinocytes de la couche basale est riche en organites cellulaires ainsi qu'en mélanosomes. Ces derniers, synthétisés par les mélanocytes voisins, migrent dans les kératinocytes pour se concentrer autour du noyau le protégeant ainsi en partie contre les UV.

Au niveau de cette couche, le nombre de cellules germinatives est justifié par l'activité mitotique intense de ces cellules. En effet, ces kératinocytes se divisent activement, chacun donnant naissance à deux cellules filles identiques. L'une des cellules filles reste sur place pour se diviser à nouveau alors que l'autre peut suivre trois voies distinctes: rester quiescente, être rapidement éliminée par apoptose ou, pour la plupart d'entre elles, s'engager dans un processus de différentiation afin de reconstituer les couches suprabasales de l'épiderme.

Le stratum spinosum ou couche épineuse est constitué d'une superposition d'environ 5 strates de kératinocytes. Volumineuses, elles ont une forme polygonale et ont tendance à s'aplatir dans les régions les plus superficielles. Ces cellules sont pourvues d'un gros noyau possédant souvent deux nucléoles. On y trouve de nombreux ribosomes impliqués dans la fabrication de la kératine. Ces cellules sont attachées par un nombre plus grand de desmosomes, ce qui leur donne une allure épineuse en observation histologique. Ces attaches desmosomiales assurent une grande cohésion entre les cellules et sont responsables, en partie, de la très grande résistance mécanique de cette couche cellulaire.

Figure 2: Schéma d'une coupe transversale de l'épiderme avec ses 4 différentes couches. Et les différents stades de la différentiation des kératinocytes.1) couche basale, 2) couche granuleuse, 3) couche épineuse et 4) stratum

corneum. [6]

Le Stratum granulosum ou couche granuleuse est formée de 3 strates de kératinocytes aplatis, possédant un noyau ovale et dense, dont la chromatine se raréfie, de la même manière que les organites cellulaires. Au niveau cytoplasmique on trouve deux sortes de granulations: les premières sont des granulations de kératohyaline, volumineuses et basophiles, les secondes, plus petites, appelées kératinosomes ou corps lamellaires d'Odland. Ces structures migrent vers la périphérie de la cellule, fusionnent avec la membrane plasmique et déversent leur contenu dans l'espace extracellulaire. Il s'agit de lipides qui vont jouer un rôle de ciment intercellulaire pour consolider, avec les desmosomes, les adhésions cellulaires.

Le stratum corneum (SC) est constitué suivant la région du corps, de 4 à 20 couches de cellules aplaties et complètement kératinisées. Les kératinocytes appartenant au SC ne possédant plus de noyau, ni d'organites cytoplasmiques sont les cornéocytes. La cellule est remplie de kératine qui se présente sous forme de faisceaux de filaments enrobés dans une matrice dense inter-filamenteuse amorphe. Cette couche peut être subdivisée en deux sous-couches. Le stratum compactum, faisant suite à la couche granuleuse, est formé de cellules kératinisées étroitement soudées. Il assure la fonction barrière de l'épiderme. Les desmosomes sont remplacés par des structures très simplifiées, les cornéodesmosomes qui continuent à assurer une certaine cohésion entre les cornéocytes. On trouve dans les cornéodesmosomes des protéines spécifiques comme la cornéodesmosine. Cette strate est surmontée par une couche desquamante ou stratum disjonctum qui se trouve en surface et au niveau de laquelle les cellules