A MATÉRIELS ET MÉTHODES

II.A.1. M

ODÈLE DE PEAU

Des explants cutanés humains (Cf. partie I) ont été utilisés comme modèle de peau pour cette étude.

II.A.2. A

BLATION LASER

Après immobilisation des rats, les plaies ont été induites à l'aide d'un laser Erbium:YAG (Yittrium-Alluminium-Garnet) (Dermablat, Aesculap-Allemagne), avec une longueur d'onde de 2,94 µm et d'une durée de pulsation de 3 ms. 'Les paramètres de réglage du faisceau laser focalisé, utilisés étant un diamètre de 1,6, 3 ou 5mm, avec une fréquence de 10Hz et des énergies de 100, 200, 400, 600, 800 ou 1000mJ.

Chapitre III

II.A.3. É

VALUATION TOPOGRAPHIQUE DE LA PROFONDEUR D

'

ABLATION

Camera CCD

Projecteur

Zoom objectif

A B

Figure 22: Appareil de projection de franges, (A) l'ensemble du système, (B) schéma de l'arrangement projecteur et caméra.

L'évaluation tri-dimensionnelle topographique de la lésion induite par le laser a été réalisée avec une technique basée sur la projection de franges d'interférence. Cette technique permet de reconstruire en 3D le micro- et le macro-relief d'une surface et de quantifier sa rugosité, son volume et sa profondeur [76].

Le système est composé d'une caméra CCD et d'un module de projection de franges. Ces dernières sont projetées sur la surface à analyser et des images de franges sont acquises par la camera à un angle de 45° par rapport au projecteur de franges (Figure 22). La résolution du système dépend de la largeur de la frange projetée et de l'angle entre l'axe optique de la caméra et celui du projecteur. La déformation des franges au- dessus du plan de référence est proportionnelle à la hauteur séparant l'objet de ce plan. Ainsi, une série d'images de franges, contenant l'information de la hauteur de l'objet analysé, est reconstruite en une seule image 3D.

Le système de projection de franges utilisé est un Dermatop® comportant un logiciel d'acquisition d'images OPTOCAT® (Breuckmann-Allemagne). Ce système a été utilisé directement sur la surface à évaluer, comme la peau ou indirectement sur des répliques ou empreintes en polymère siliconé de la même surface. Un logiciel de traitement d'images Toposurf®(Imagerie Digitale, Besançon, France), permet d'analyser la topographie reconstituée en 3D avec des paramètres standards de rugosité et des outils d'analyse de la profondeur et du volume. C'est avec ces derniers outils que des profils de profondeurs des lésions ont été générés permettant le calcul des profondeurs moyennes des lésions. Ainsi, pour chaque lésion induite, nous avons extrait 4 profils dont la profondeur moyenne est mesurée en 10 points du profil (Figure 23a, b).

(1) (2) (3) (4) A B

Figure 23: Représentation tridimensionnelle d'une ablation tissulaire induite par laser (A), et un exemple d'un profil en 2 dimensions (B).

II.A.4. É

VALUATION

H

ISTOLOGIQUE

Des biopsies de 6 mm de diamètre ont été réalisées, incorporant la lésion et un peu de peau saine autour. Les biopsies ont été fixées à froid (cryo-congélation).

Les cryocoupes sont réalisées par congélation, dans l'azote liquide, des biopsies incluses dans une résine (Tissu tek®, OCT™ SAKURA, Pays-Bas). À l'aide d'un cryotome à - 25°C, on réalise des coupes de 7µm. Ces coupes sont colorées à l'Hématoxyline - Éosine (HE).

L'observation des coupes histologiques a été réalisée au moyen d'un microscope optique (Axioskop 20, ZEISS). Les images acquises à l'aide du logiciel d'image (Spot V3.5, Diagnostic Instruments. Inc, Sterling Heights, MI, USA), permettent la mesure de l'épaisseur des couches de la peau.

En pratique, ces mesures ont consisté en la mesure de la longueur des traits dessinés perpendiculairement entre la surface de la peau et la base de la couche à mesurer (SC et épiderme) (Figure 24). Le logiciel permet le calcul de la taille moyenne des traits et par conséquent le calcul de l'épaisseur moyenne de la couche analysée. Ainsi, l'épaisseur moyenne de l'épiderme et du SC ont été mesurées sur la peau normale non-lésée afin de connaître les dimensions de ces structures. La même approche a été appliquée sur les images des lésions, dans la limite du possible, pour évaluer la profondeur du tissu ablaté.

Chapitre III

Derme Stratum corneum

Épiderme

Figure 24: Mesure de l'épaisseur du stratum corneum et de l'épiderme. (Gx200).

II.A.5. P

ROTOCOLE D

'

ÉTUDE EX VIVO

:

LA PEAU HUMAINE

Les énergies à tester ont été choisies à partir de la littérature. Ainsi nous avons choisi des énergies qui sont un multiple de 10 J/cm². De ce fait nous avons induit des lésions en appliquant les fluences suivantes: 10, 50 et 200 J/cm². Ces différentes fluences nous permettent d'atteindre des niveaux structuraux différents de la peau (SC, épiderme et derme). Des explants mammaires de deux sujets (17 et 66 ans) ont été obtenus lors d'interventions de chirurgie plastique. Le même jour, un échantillon de chaque explant a été placé dans une boîte de pétri, puis des lésions ont été induites au moyen du laser. Ainsi, chaque fluence a été appliquée une fois sur chacun de ces échantillons. Au total six lésions ont été réalisées. Immédiatement après l'induction, des images ont été prises par la technique de projection de frange pour une analyse de la profondeur. Les biopsies de ces lésions ont été prélevées et préparées pour l'histologie.

II.B. R

ÉSULTATS

II.B.1. É

VALUATION

T

OPOGRAPHIQUE

Les résultats de cette évaluation sont présentés dans les figures 25 et 26 montrant respectivement les images reconstruites en trois dimensions des trois lésions induites, et leurs profils moyens calculés. Avec la fluence de 10 J/cm², l'emplacement du faisceau laser est visible par une absence du microrelief de la peau (Figure 25a). Cette absence est illustrée au niveau du profil de la lésion (Figure 26), qui montre une faible dépression d'une profondeur moyenne d'environ 18 µm par rapport à la peau saine. Dans le cas de la fluence 50 J/cm², la dépression est plus marquée avec une profondeur moyenne d'environ 44 µm. On observe aussi la présence d'irrégularités au niveau de l'image 3D (Figure 25b), qui semblent être présentes également au niveau du profil (Figure 26). La fluence de 200 J/cm² a permis quant à elle la réalisation d'une lésion profonde aux bords bien nets (Figure 25c). Au fond de la cavité, la présence de pics correspondrait à une présence de débris tissulaires ou à un artefact de mesure lié aux

parois abruptes de la lésion. Le profil calculé, de cette dernière, montre une cavité d'une profondeur maximale d'environ 800 µm (Figure 26).

a b

c

Figure 25: Exemples d'images reconstruites en 3D des ablations laser réalisées à des fluences de (a) 10J/cm², (b) 50J/cm² et (c) 200J/cm².

II.B.2. É

VALUATION

H

ISTOLOGIQUE

Les figures 27 b-d montrent des exemples de coupes histologiques correspondant aux 3 fluences appliquées ainsi qu'une coupe de peau témoin (Figure 27a). La figure 27b montre un SC fragmenté et déstructuré à la suite d'une application de 10 J/cm². L'utilisation de la fluence de 50 J/cm² (Figure 27c) montre une ablation complète de l'épiderme à l'endroit de l'impact du faisceau, avec la présence d'une bande de tissu amorphe et sombre qui serait une partie coagulée du derme papillaire. On observe également des irrégularités sous forme d'ondulations pourrant correspondre aux micro- cavités visibles au niveau de l'image 3D de la même lésion (Figure 27b).

Chapitre III

Dans le document Développement d'un modèle de cicatrisation épidermique après une désépidermisation laser (Page 63-68)