PARTIE 2: PEAU DES RATS HAIRLESS IN VIVO À l'issu de l'étude ex vivo, il a été constaté que la fluence nécessaire pour une ablation

de l'épiderme est comprise entre 10 et 50 J/cm² environ. Par conséquent, dans cette partie nous avons testé cette gamme de fluence.

III.A. MATÉRIELS ET MÉTHODES

III.A.1. M

ODÈLE DE PEAU

Dans cette partie nous avons choisi les rats Hairless (Charles River France, Les Oncins, France) comme modèle d'étude. L'absence de poils chez ce modèle facilite la visualisation des lésions induites. Deux rats mâles âgés de 7 semaines sont utilisés pour l'induction des lésions au niveau de la région dorsale de part et d'autre de la colonne vertébrale.

Avant l'induction des plaies, le rat est anesthésié (120mg/kg kétamine, IMALGÈNE® 500). Cette solution anesthésiante est mélangée, volume pour volume, à l'acépromazine (Calmivet®, Vétroquinol, France), avant administration.

III.A.2. A

BLATION LASER

Au moyen du même laser utilisé précédemment Erbium:YAG (cf. II.B.). Les lésions ont été induites à l'aide d'un faisceau laser d'un diamètre de 5mm, des fluences de 10 à 50 J/cm² ceci par une multiplication de passage à l'aide d'un faisceau de 10J/cm² et une fréquence de 1 Hz.( cf.Annexe.4)

III.A.3. É

VALUATION

T

OPOGRAPHIQUE DE LA PROFONDEUR D

'

ABLATION

La morphologie de la plaie est évaluée à l'aide d'empreintes cutanées avec un polymère siliconé (SILFLO®, Flexico Developements, UK). L'empreinte est réalisée en mélangeant 4 gouttes du catalyseur à 3ml du polymère siliconé, et en étalant le mélange sur la région cible.

L'analyse des empreintes cutanées est réalisée par acquisition et traitement d'images de projection de franges (cf. II.A.3).

Chapitre III

III.A.4. É

VALUATION

H

ISTOLOGIQUE

Des biopsies de 6 mm de diamètre ont été réalisées, incorporant la lésion et un peu de peau saine au tour. Les biopsies ont été fixées au Formol à 10% dans du tampon phosphate 0,2 M, à pH 7,2.

Par la suite les biopsies sont montées dans des blocs de paraffine, et qui seront coupée par la suite à l'aide d'un microtome à des épaisseurs de coupes de 5µm. Ces coupes sont colorées à l'Hématoxyline - Éosine (HE).

III.A.5. D

ÉROULEMENT DE L

'

ÉTUDE

Une gamme de fluence allant jusqu'à 50J/cm² a été appliquée sur chacun des deux rats Hairless. Ainsi, sur deux rats les fluences 10, 20, 30, 40 et 50J/cm² ont été appliquées deux fois sur chaque rat, de part et d'autre de la colonne vertébrale (Figure 29).

Immédiatement après induction des lésions, des empreintes siliconées ont été réalisées pour analyser la profondeur par la technique de projection de franges. Dans ce but, "n" profils ont été évalués sur chaque lésion (n=4 lésions par fluence)

Figure 29: Schéma représentatif des zones ablatées. (Flu.: Fluence)

III.B. R

ÉSULTATS

III.B.1. É

VALUATION

T

OPOGRAPHIQUE

Les résultats de cette évaluation sont présentés dans la figure 30 montrant les images reconstruites en trois dimensions des cinq lésions induites. Les profondeurs moyennes atteintes par les différentes fluences utilisées sont montrées au niveau du tableau 2. Ces profondeurs augmentent en fonction des fluences utilisées. Ainsi, une fluence de 10J/cm², induit une lésion avec une profondeur d'environ 28µm, cette profondeur

Ar. Av. Flu-5 Flu-4 Flu-3 Flu-2 Flu-1

Témoin 1,5 cm

augmente en fonction de la fluence utilisée pour atteindre une profondeur moyenne de 69µm. La représentation graphique de ces résultats (Figure 31) montre clairement la progression de la profondeur des lésions atteintes en fonction des différentes fluences.

III.B.2. É

VALUATION

H

ISTOLOGIQUE

L'analyse histologique des lésions induites par le biais du laser montre une ablation nette des tissus superficiels de la peau. La détermination des profondeurs atteintes est rendue difficile par la déformation des échantillons du aux traitements histologiques. L'utilisation d'une énergie de 10 J/cm²permet l'ablation d'une partie de l'épiderme dont l'épaisseur témoin moyenne est de 56±9 µm (Figure 32a). Cette ablation est bien visible au niveau de la figure 32a qui laisse apparaître le reste des cellules épidermiques non pulvérisées. L'augmentation de la fluence utilisée à 20 J/cm² permet une ablation de l'épiderme sauf à quelques rares endroits, pouvant correspondre aux papilles épidermiques. La limite de l'impacte du faisceau laser est visible au bord de la lésion par l'absence du SC et de l'épiderme (Figure 32b).

Chapitre III

(a) (b)

(c) (d)

(e)

Figure 30: Exemples d'images reconstruites en 3D des abrasions laser réalisées par les fluences (a) 10, (b) 20, (c) 30, (d) 40 et (e) 50 J/cm².

Fluences (J/cm²) 10 20 30 40 50 Profondeurs (µm) 27.7± 7.7 38.2± 9.4 53.1± 25.8 66.6± 8 68.6± 10.8

Tableau 2: Mesures des profondeurs moyenne des lésions (n=4).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 Fluence (J/cm²) Profonde ur (µ m)

Figure 31: Courbe de profondeur en fonction de la fluence du faisceau laser. Les essais sont réalisés par un simple tir.

L'utilisation d'une fluence de 30 J/cm² permet l'ablation complète de l'épiderme ainsi qu'une partie du derme papillaire (Figure 32c). L'épaisseur des tissus ablatés, est difficile à déterminer en se basant sur les coupes histologiques, qui sont déformées sous l'effet des traitements histologiques. Au niveau de cette coupe histologique une région de coagulation est décelée au milieu de la coupe. Cette zone de coagulation est bien présente et de plus en plus importantes au niveau des lésions induites par des fluences plus importantes (40 et 50 J/cm²)(Figure 32d,e).

Une fluence de 40 J/cm² permet d'induire une lésion qui atteint la partie supérieure du derme réticulaire, de même que la fluence utilisée de 50 J/cm² permet d'avoir une ablation plus profonde. Ces lésions atteignent les glandes annexes (glande sébacée).

Chapitre III

Figure 32: Coupes histologiques, représentatives d'abrasions cutanées induites au moyen d'un faisceau laser de 1,6 mm et les fluences 10, 20, 30, 40 et 50 J/cm², respectivement a, b, c, d et e. (Coloration HE. La barre=250 µm

Gx200.)

IV. DISCUSSION & CONCLUSION

L'acquisition d'images par projection de frange des empreintes cutanées permet une reproduction des reliefs de la peau. Les empreintes ou répliques cutanées ont déjà été utilisées pour l'évaluation morphologique des ulcères de jambe pour une détermination précise de leurs volumes [41]. Depuis lors cette technique est largement utilisée dans l'étude du relief de la peau [77], elle permet d'obtenir des résultats précis et répétables

[76]. Cette précision permet son utilisation dans la détermination des profondeurs des lésions induites par lasers.

Les résultats obtenus lors des études ex vivo nous ont permis la vérification du rapport entre l'énergie utilisée et la profondeur des tissus atteints. Ces résultats vont dans le même sens que ceux obtenus par Lee et al. [53]. Ainsi l'application d'une fluence de 10 J/cm² enlève tout le relief de la peau et par conséquent enlève la totalité du SC, ce qui est visible au niveau de la représentation 3D (Figure 25a), et confirmé à l'aide des coupes histologique (Figure 27b).

La comparaison de la mesure du diamètre de la lésion histologiquement montre un diamètre inférieur au diamètre théorique du faisceau laser (diamètre 1,4 mm), avec une diminution de 20% du diamètre au niveau des coupes histologiques. Cette différence pourrait être due à une contraction des tissus, notamment le derme suite au prélèvement et sous l'effet du traitement histologique. La correction de valeurs des profondeurs mesurées par histologie permet d'obtenir des résultats identiques à ceux de l'imagerie par projection de franges (Figure 27).

L'étude réalisée par la suite in vivo chez les rats Hairless, a permis la réalisation des mêmes lésions dans les conditions de la peau normales (tensions mécaniques). L'évolution des profondeurs est proportionnelle aux fluences utilisées. Selon les travaux de Lee [53], l'utilisation d'une fluence de 1,56 J/cm² permet l'ablation d'une couche épidermique d'une épaisseur d'environ 13 µm.

L'ensemble de ces travaux souligne l'importance de contrôler la profondeur de tissu ablaté par contrôle de la fluence. Contrairement aux travaux réalisés jusqu'alors où le contrôle des lésions laser est réalisé par un examen clinique et histologique [53, 78], cette technique d'imagerie permet un contrôle non invasif des profondeurs de tissus atteints. L'histologie, considérée comme un standard de mesure des dimensions des structures, peut être faussée sous l'effet du comportement tissulaire (contraction sous l'effet de fixateurs utilisés).

L'inflammation au niveau des tissus peut causer une augmentation de la taille et du volume des berges des lésions et par conséquent fausser les mesures. Afin de remédier à ce problème, il est important de réaliser les empreintes des lésions le plus rapidement possible sachant que l'inflammation commence à s'installer dans les vingt premières minutes [11].

Le manque de précision des résultats obtenus au niveau des lésions de faible profondeur (faible fluence 10 J/cm²) montre une limite de la technique, d'imagerie 3D qui dépend des caractéristiques techniques.

En conclusion, l'ensemble des résultats obtenus au cours de ces études nous a permis de valider la technique d'analyse par projection de franges comme technique d'évaluation et de mesure de la profondeur des lésions cutanées induites. De la même manière, ces

Chapitre III

résultats montrent l'erreur introduite par la technique d'histologie dans la détermination des profondeurs de lésions.

Ainsi cette technique non invasive présente des avantages lui permettant une utilisation adaptée aux études ultérieures. Cette technique est rapide, utilisable in vivo, serait utile pour des évaluations itératives lors des études de cicatrisation. De plus, elle s'affranchit d'artefacts dus aux traitements histologiques. Néanmoins elle présente des limites pour la détermination des profondeurs très faibles. Cette difficulté est vraisemblablement due aux limites de résolution du capteur optique.

La courbe du rapport entre l'énergie choisie et la profondeur atteinte nous a permis de choisir une densité d'énergie qui permettra de réaliser une désépidermisation, sans dommage significatif du derme. Ainsi la fluence de 20J/cm² sera utilisée dans les études qui suivent.

C

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I. INTRODUCTION

Il est évident que l'utilisation de la technique d'empreintes cutanées et d'imagerie 3D permet la meilleure reproduction des lésions induites, et par conséquent une meilleure mesure de leurs caractéristiques. Cette utilisation nous permettra une bonne évaluation des résultats obtenus lors des études de validation de l'induction de lésions cutanée par technique laser.

Les essais réalisés jusqu'alors au moyen d'un laser mono-spot (sans balayage) ont permis la détermination de paramètres optimaux d'utilisation. L'usage de ces paramètres a permis l'obtention d'une désépidermisation (une évaporation de l'épiderme) sans endommager le derme. Les paramètres d'utilisation ainsi définis, il est nécessaire de vérifier la reproductibilité de l'induction de ces lésions et par conséquent de valider cette technique sur un modèle animal.

Toutefois, si on veut utiliser un laser mono-spot dans une étude clinique, il faudra effectuer un balayage. Afin d'obtenir une plaie qui est plus grande que le diamètre du faisceau.

La deuxième partie de ce chapitre concerne l'utilisation d'un laser Er:YAG à balayage sur le même modèle animale, une étape clé à réaliser avant de transférer la technique chez l'homme.

Chapitre IV

Dans le document Développement d'un modèle de cicatrisation épidermique après une désépidermisation laser (Page 71-82)