Western Blot : Immuno-détection sur membrane

Cette méthode permet de détecter et quantifier l’expression des protéines et comporte trois

étapes : la séparation des protéines sur gel (SDS-PAGE : « Sodium Dodecyl Sulfate

Polyacrymide Gel Electrophoresis), le transfert des protéines sur un support solide et la

détection immunologique couplée à une révélation (Figure 24). La technique de déshybridation de membrane vise à dissocier les anticorps primaires accrochés sur les protéines et permet d’utiliser un nouvel anticorps sur la même matrice. (Les techniques en détail se trouve dans les fiches techniques.)

Figure 24. Le principe de western blot. Le substrat chimiluminescence qui a été utilisé est ECL.

(Amersham Pharmacia Biotech).

(a). Préparations et dosage des échantillons

Les tissus ont été broyés finement dans l’azote liquide sur lit de carboglace afin d’éviter la dégradation des protéines tissulaires. Les tissus ainsi broyés et pesés ont été lavés deux fois dans 10 volumes de PBS 1x pour éliminer l’excès de sang. L'extraction des protéines totales du tissu broyé a été réalisée par une lyse des tissus à l’aide du tampon RIPA (1 % Triton X-100, 1 % de sodium deoxycholate, 0.1% de sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.2M de sodium orthovanadate,

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0.5mM de dithiothreitol, 200mM de béta-glycerol phosphate et 20mM d’inhibiteur de protéase (Roche, Boulogne-Billancourt, France)) à raison de 100 µL / 10 mg de tissu. La lyse est complétée par un broyage mécanique à l’aide d’une seringue de 1 mL associée à une aiguille de 0.45 mm de diamètre permettant une homogénéisation (20 Allers/retours) tout en maintenant les échantillons dans la glace. La concentration en protéines est ensuite mesurée en utilisant la méthode de dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) via le kit BCA Protein Assay® Reagent (Uptima) selon les recommandations du fabriquant. C’est une méthode colorimétrique utilisant l'acide bicinchoninique (BCA). En milieu alcalin, les protéines réduisent proportionnellement les

ions cuivriques (Cu2+) en ions cuivreux (Cu+). Le BCA est un réactif chromogène réagissant

avec les ions cuivreux pour former un complexe violet avec un pic d'absorbance à 562 nm. La concentration en protéines est déterminée à l’aide d’une gamme étalon préparée à partir d'une solution de BSA (Bovine serum albumin).

Un total de 20-30 μg de protéines seront analysés pour chaque échantillon et chaque type de protéine étudiée. Les quantités de protéines déposées sur SDS-PAGE sont équivalentes, et les volumes sont ajustés avec le tampon RIPA. Les échantillons sont ensuite mélangés avec un volume identique de tampon 2 x Laemmli (SIGMA, S3401-1VL, Tris-HCl 125 mM, SDS 4%, glycérol 20%, 2-mercaptoéthanol 10% (v/v), bleu de bromophénol 0.004%, pH 6,8) et dénaturé par chauffage pendant 5 min à 100°C.

(b).Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

L’électrophorèse est une méthode de séparation des protéines au travers d’un gel de polyacrylamide de 6 à 15%. Deux types de gels sont préparés préalablement dont un gel de séparation et un gel de concentration dit aussi « stacking » qui doit être coulé sur le gel de séparation. L'électrophorèse se fait en conditions dénaturantes, grâce à la présence de SDS (SIGMA, L4509) qui va dérouler la structure tridimensionnelle des protéines tout en apportant des charges négatives à l’ensemble des peptides, permettant ainsi la séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaire uniquement. L’électrophorèse est réalisée dans un système de migration verticale (Mini Protean III, BioRad®, USA).

Le marqueur de poids moléculaire (Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad, 161-0374) et les échantillons sont déposés dans les puits du gel de concentration. Les protéines migrent à voltage constant de 80 V pendant 15 min puis de 110 V pendant environ 90 min, dans le tampon de migration 1x (Tampon 10X : pH 9.2 ; Tris 480 mM ; Glycine 390 mM ; SDS 0.375 % ; eau ultra

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(c). Transfert

Les protéines séparées sont transférées soit sur une membrane nitrocellulose ou PVDF

(Polyvinylidene difluoride, Bio-Rad ®). PVDF doit être perméabilisée au méthanol au moins 1

minutes. Le transfert se fait à l’aide d’un système de transfert (Tank transfert systems, 1170-3930 Bio-Rad®, USA), dans une solution de transfert 1x (Tampon 10X : pH 9,2 ; Tris 480 mM ; Glycine 390 mM ; SDS 0,375% ; eau ultra pure qsp 1L) pendant 45 min à 350 mA. Bien qu’il existe un autre système de transfert dit semi-sec, c’est l’électro-transfert liquide qui est utilisé par référence dans la thèse car il chauffe moins et il est plus homogène. Un montage type « sandwich », formé d’une éponge, 3 papiers filtres, la membrane, le gel, 3 papiers filtres (les bulles d’air doivent être éliminées) et une éponge avec l’aide d’une cassette est placé dans la cuve de transfert, selon schéma ci-après. (Figure 25)

Figure 25. Le principe de transfert sur un support membranaire.

Un bac de glace est placé dans la cuve et la cuve est entourée avec de la glace pilée pour protéger de la dégradation des protéines. A la fin de cette étape, on réalise une coloration au rouge Ponceau S (solution aqueuse de Rouge Ponceau S à 0.2 % (p/v), acide acétique 0.1 % (v/v), filtrée à 0.2 μm, 4°C) qui peut s’avérer être utile pour vérifier l’intégrité du transfert, tout en permettant de bien couper les membranes si besoin.

(d). Immunoblot

La membrane est placée dans la solution de blocage (Tris Buffered Saline Tween :

TBST-Lait/BSA 5 %) pendant 1 heure sous agitation lente à température ambiante, pour saturer tous les sites de la membrane non occupés par des protéines, puis incubée pendant une nuit à 4°C sous agitation lente avec un anticorps primaire spécifique de la protéine d’intérêt. Suite à 4 lavages de 10 min avec du TBST 1x (Tampon TBS 10X : pH 7.4 ; NaCl 1.5 M ; Tris 200 mM ;

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eau ultra pure qsp 1L + Tween20 0.1%), la membrane est incubée pendant 1 h sous agitation lente avec un anticorps secondaire, reconnaissant la partie constante (Fc) de l'anticorps primaire)

à T° ambiante. Généralement, les anticorps sont dilués dans la solution de blocage avec certaine

dilution. Puis 4 lavages avec du TBST 1x, la révélation est réalisée par chimiluminescence (ECL, Amersham Pharmacia Biotech). La peroxydase, en présence de son substrat, le luminol, émet de la lumière détectée par l’appareil Fusion FX7 (ThermoFisher).

(e). Déshybridation de membrane Western-Blot

Cette technique est le plus souvent utilisée pour révéler les protéines de référence (β-actine, GAPDH, etc) quand les poids moléculaires sont proches des protéines d’intérêt. Les membranes ayant déjà été incubées avec des anticorps primaires et secondaires ont été repris pour les ré-incuber avec un autre anticorps. Deux techniques de déshybridation peuvent être utilisées. La première est réalisée avec un tampon de déshybridation 1x (TrisHCl 62,5 mM, 2-mercaptoéthanol 100 mM, SDS 2 %) en chauffant à 50°C dans un bain-marie sous hotte aspirante. La deuxième technique est préférentiellement utilisée car elle est plus efficace et plus douce que la première, limitant la dégradation des protéines sur la membrane. Enfin, le Western Blot est repris à partir de la phase Immunoblot.

(f). Analyse densitométrique

La chimiluminescence des bandes présentes sur les membranes est quantifiée par le logiciel imageJ (Wayne Rasband, National Institutes of Health). Une zone est délimitée autour de la bande et le programme mesure la densitométrie par contraste entre la protéine et le bruit de fond.