Fiche technique n°7 : Principe et utilisation de spectromètre de masse

La spectrométrie de masse nous donne des renseignements sur :

- La masse moléculaire d’un composé qui se calcule grâce à la valeur de la masse par

rapport à la charge, et elle fournit alors l’identification de métabolites.

- La structure qui peut être observée grâce aux pics de fragmentation.

- La mesure de la quantité, une analyse quantitative peut être faite à partir de l’intensité

des pics.

Le spectromètre de masse est dans la plupart des cas associé à une technique de séparation des composés d’un mélange, qui dans ce laboratoire est la chromatographie liquide.

Le spectromètre de masse qui a pour rôle la séparation des composés et l’identification des molécules. Pour cela le spectromètre de masse produit à partir de nos échantillons des ions qu’il va séparer en fonction de leur rapport masse sur charge (m/z) et de leur affluence. Ici, dans le laboratoire, on utilise le spectromètre de masse 4000 Q TRAP® (AB Sciex) pour quantifier les acylcarnitines, l’HCY et le MMA qui nous intéresse dans cette étude. (Figure 48)

Un spectromètre de masse en tandem (MS/MS) a un collecteur d’ions et un deuxième analyseur de plus comparé à un spectromètre normal. La technique en MS/MS a la particularité de fragmenter les molécules d’intérêts dans la chambre de collision ou quadripôle Q2, pour une meilleure identification. Le spectromètre est donc composé d’un système d’introduction de la substance d’intérêt, d’une source d’ionisation, de deux triple quadripôles, d’une cellule de

collision et d’un détecteur associé à un système de traitement des données. Le spectromètre

4000Q Trap est un spectromètre hybride avec en supplément une trappe qui permet une fragmentation supplémentaire. La trappe ionique favorise une spécificité et une sensibilité encore plus élevée pour des molécules de masse moléculaire faible mais pour les dosages de cette étude, elle n’est pas utilisée.

• Le premier élément du spectromètre de masse est la source dans laquelle l’échantillon est

directement introduit. Elle permet d’ioniser positivement ou négativement les substances à analyser (aussi appelé ionisateur). Il existe différents types d’ionisation en fonction des molécules à analyser. Pour nos dosages le mode d’ionisation est l’électrospray ou

électronébulisation. C’est une étape qui permet de volatiliser l’échantillon en passant

d’une solution liquide à l’état gazeux. Pour cela on applique un fort champ électrique sur l’échantillon liquide qui traverse un capillaire. A la sortie de ce dernier de fines gouttelettes hautement chargées sont générées, elles vont rétrécir, par l’évaporation du solvant, jusqu’à ce que les forces coulombiennes approchent le niveau des forces de cohésion ce qui va provoquer une explosion. Les ions sont ainsi formés et vont aller, à l’aide de deux cônes (le « skimmer » et le « curtain plate ») et d’un potentiel électrique,

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vers l’analyseur au niveau du quadripôle Q0. C’est une « ionisation douce ». En effet c’est une faible fragmentation de l’ion moléculaire et on obtient des ions qui sont stables et qui ont une durée de vie suffisamment longue pour traverser l’analyseur et le détecteur pour pouvoir être mesurées. Il y a émission d’azote ultra-pur pour empêcher les substances non ionisés et les impuretés de pénétrer à l’intérieur de la source, c’est le

« curtain gas ».(cf. photographie de cette fiche technique)

Figure 48. L’équipement et le principe de spectromètre de masse.

• Ensuite, le triple quadripôle est composé de deux analyseurs séparés par une cellule de

collision où les molécules organiques se cassent en plusieurs fragments de masse

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une molécule donnée formant un spectre de masse qui est la « carte d’identité » de la molécule. Dans cette technique l’analyseur est composé de trois quadripôles (Q) placés en série. Les quadripôles sont composés de quatre barres métalliques parallèles dans lesquelles on applique un potentiel continu (U) et un potentiel alternatif radiofréquence (V). Les barres sont successivement chargées négativement puis positivement. Un ion négatif est attiré par une barre avec un potentiel positif. Pour la séparation des ions en fonction de leur rapport m/z on fait varier les valeurs de la tension continue et alternative (le rapport U/V reste toujours constant). Ainsi les barres changent de charges et de ce fait

l’ion rectifie sa direction et va aller sur une barre de signe positif (cf. annexe 8). Ainsi, les

ions ont un trajet oscillant dans le quadripôle et arrivent au détecteur seulement si, grâce à leur rapport m/z, ils ont une trajectoire stable. Le reste est éliminé. L’ion parent est isolé de la molécule d’intérêt dans le premier quadripôle (Q1). La fragmentation de l’ion parent en ions fils, des fragments spécifiques de la molécule d’intérêt, se fait dans la chambre de collision Q2. Et pour finir, en Q3 se fait l’analyse des ions produits.

• Enfin le détecteur du courant ionique mesure le nombre d’électrons (forme un courant

électrique) et amplifie le signal pour obtenir une sensibilité suffisamment bonne. Le signal est enregistré et on peut observer un spectre de masse grâce à un système informatique qui est couplé au détecteur.

Le spectre de masse est sous la forme d’un chromatogramme. L’axe des ordonnées représente l’abondance des ions. L’axe des abscisses représente les différents rapports masse/charge. On y observe un groupe de pics moléculaires (aussi appelé cluster moléculaire), on en observe du fait de l’existence d’isotopes.

Le spectromètre de masse sélectionne un ion caractéristique d’un composé, ce qui permet de quantifier ce composé non séparé d’un autre.

Le spectromètre de masse peut être utilisé en plusieurs modes différents, Multiple Reaction Monitoring, Precursor Ion Scan, Neutral loss, Product Ion Scan, Full Scan ou encore Single Ion Monitoring.

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