B.1. La voie mTOR

La protéine mTOR est une sérine/thréonine kinase, fortement conservée de la levure au

mammifère, chez lequel elle existe sous deux formes distinctes de complexes

multi-protéiques : les complexes 1 et 2 de mTOR (mTORC1 et mTORC2, respectivement). Le

complexe mTORC1, sensible à la rapamycine, est constitué de mTOR, Raptor (Regulatory

associated protein of mTOR), Gβ1 ou mLST8 (G-protein β-subinit-like), PRAS40

(Proline-Rich Akt-Substrate 40 kDa), et Deptor (DEP-domain-containing mTOR-interacting protein).

Le complexe mTORC2, insensible à la rapamycine, est composé de mTOR, Rictor

(Rapamycin-insentitive companion of mTOR), SIN1 (stress-activated-protein-kinase

interacting 1) et mLST8 et Deptor [Pour revue, voir (Laplante and Sabatini 2009)]

(Figure 1.II.1)

Même si mTORC2 intervient dans certains évènements régulateurs de la synthèse

protéique (Guertin, et al. 2006), son implication est moins déterminante que celle de

mTORC1. Dans la suite de l’exposé, nous nous centrerons essentiellement sur mTORC1 que

nous nommerons par défaut mTOR ; quand nécessaire, nous spécifierons le nom du

complexe.

19

mTOR

Raptor Deptor

mLST8 PRAS40

mTOR

Rictor Deptor

mLST8

SIN1

mTORC1 mTORC2

Figure 1.II.1. Structure des complexes mTORC1 et mTORC2

II.1.B.1.a. La régulation de l’activité de mTOR

II.1.B.1.a.i. Les régulateurs positifs de mTOR

 La voie IGF-I

L’insuline et IGF-1 (Insulin-like Growth Factor I) sont les principaux régulateurs

positifs de mTOR. Ces facteurs sont capables d’activer PI3K (Phospho-Inositide 3-Kinase),

ce qui déclenche de multiples évènements moléculaires impliqués dans la prolifération et la

différenciation, la croissance et la survie cellulaires ainsi que la protéosynthèse [pour revue,

voir (Frost and Lang 2007)]. La sérine/thréonine kinase Akt (ou PKB pour Protein Kinase B),

cible principale de PI3K, est capable d’inhiber par phosphorylation le facteur GSK-3

(Glycogen Synthase Kinase 3), ce qui favorise la synthèse protéique grâce à l’activation du

facteur d’initiation de la traduction eIF2B (eukaryotic Initiation Factor 2B) (Welsh, et al.

1998) (Figure. 1.II.3). Akt participe activement à l’activation de mTOR, en agissant sur le

complexe TSC (Tuberous Sceloris Complex) (Inoki, et al. 2003b). TSC, un hétérodimère

composé de TSC1 et TSC2, fait parti de la famille des protéines GAP (Guanosine

triphosphate (GTP)ase Activating Protein) et inhibe l’activité de la petite protéine G Rheb

(Ras homolog enriched in brain). La phosphorylation de TSC2 sur ses résidus Ser

⁹³⁹

et Thr

¹⁴⁶²

par Akt réprime son activité GAP et facilite l’accumulation de Rheb sous sa forme active

(Rheb-GTP) (Huang and Manning 2009), ce qui en définitive conduit à l’activation de mTOR

(Figure. 1.II.3). Par ailleurs, la surexpression de TSC1 dans le muscle squelettique favorise la

stabilisation de TSC2, ce qui entraîne l’inhibition de mTOR et une réduction significative de

20

la masse musculaire (Wan, et al. 2006). Akt pourrait d’autre part intervenir dans la régulation

de l’activité de mTOR, indépendamment du système TSC/Rheb. Cette kinase pourrait

phosphoryler directement un répresseur moléculaire de l’activité de mTOR, PRAS40, et agir

conjointement avec la protéine séquestratrice de PRAS40, 14-3-3, pour conduire à une

activation plus complète de mTOR (Vander Haar, et al. 2007). Enfin, l’insuline et IGF-I

peuvent également stimuler mTOR par une voie de transduction qui intervient de manière

indépendante d’Akt : la voie Ras/MEK (MAPK/ERK kinase)/ERK1/2 (Extracellular

signal-Regulated Kinase 1/2) (Haddad and Adams 2004). Cette voie pourrait agir positivement sur

l’activité de mTOR en réprimant l’effet inhibiteur de TSC2 sur mTOR, via la phosphorylation

de son résidu Ser

⁶⁶⁴

(Miyazaki, et al. 2011).

 Le rôle des acides aminés

L’activité de mTOR est aussi contrôlée par la disponibilité en acides aminés (Kimball

and Jefferson 2006) (Figure. 1.II.3). En particulier, l’administration d’acides aminés à chaîne

ramifiée tels que la leucine est suffisante pour activer la voie mTOR et améliorer la synthèse

protéique. Les mécanismes moléculaires qui régissent cette régulation de mTOR ne sont pas

encore clairement identifiés : il est possible que mTOR soit activée par les acides aminés par

un mécanisme dépendant du complexe TSC1/TSC2 (Gao, et al. 2002), mais d’autres données

réfutent cette hypothèse (Smith, et al. 2005). Il est également proposé que Rheb puisse jouer

un rôle majeur dans le contrôle de mTOR dans ces conditions nutritionnelles (Inoki, et al.

2003a), mais là encore ce mécanisme reste à confirmer (Kim, et al. 2002). Enfin, en réponse à

un apport en acides aminés, Vps34 (Vacuolar protein sorting 34), une protéine de la famille

de la classe III des PI3K, pourrait activer mTOR par une voie de signalisation indépendante

de la voie Akt/TSC/Rheb (Byfield, et al. 2005 ; Nobukuni, et al. 2005). Par ce mécanisme,

mTOR serait incorporée dans la membrane lysosomale suite à son interaction avec une petite

protéine-G de la famille des Rag et une protéine de la membrane lysosomale Ragulator, avant

d’être activée par Rheb (Sancak, et al. 2010). Les années à venir devraient nous apporter des

précisions quant à la régulation de la synthèse protéique via les acides aminés.

 La transduction des contraintes mécaniques

La voie mTOR serait également contrôlée par les contraintes mécaniques,

indépendamment de PI3K, et en l’absence de facteurs de croissance et d’acides aminés

21

1.II.3). En effet, le traitement de myotubes avec la cytochalasine D, un agent qui

dépolymérise les micro-filaments d’actine, serait suffisant pour bloquer la voie mTOR médiée

par le stress mécanique (étirement) (Hornberger, et al. 2005). Il semble donc que la traduction

des signaux mécaniques en signaux chimiques, conduisant à l’activation de la voie mTOR,

passe par le cytosquelette. Certaines structures du costamère, également appelé contact focal

(complexe protéique subsarcolemmal servant de point d’ancrage entre les filaments d’actine

du cytosquelette et les protéines de la matrice extracellulaire (MEC)) joueraient un rôle de

mécano-senseurs : il s’agit notamment de FAK, la β-intégrine et ILK (Integrin-Linked

Kinase) [pour revue, voir (Philp, et al. 2011)]. Il existerait d’autres cibles intracellulaires des

signaux mécaniques (étirement), incluant PLD1 (Phospholipase D1) et le second messager

lipidique PA (Phosphatidic Acid) (Hornberger, et al. 2006). A ce titre, PLD1 pourrait activer

mTOR en générant PA à partir de l’hydrolyse de la phosphatidylcholine. PA se fixerait alors

de manière spécifique sur le domaine FRB de mTOR, le site de fixation du complexe

rapamycine/FKBP12 (FK-binding protein 12). Par ailleurs, PLD1 serait une cible de Rheb,

située en amont de mTOR (Sun, et al. 2008) (Figure. 1.II.3).

II.1.B.1.a.ii. Les régulateurs négatifs de mTOR

Les facteurs de croissance et les acides aminés ne sont pas les seuls facteurs

biochimiques intervenant dans le contrôle de la voie mTOR et de la synthèse protéique. En

effet, le régulateur central du statut énergétique, l’AMPK (AMP-activated protein Kinase),

dont le niveau d’activation dépend des variations intracellulaires du rapport entre l’AMP et

l’ATP (Hardie 2003), est capable d’altérer la voie mTOR [pour revue, voir (Hardie 2008 ;

Shaw 2009)]. Comme ceci est présenté dans la figure 1.II.2, certaines situations de stress

métaboliques vont interférer avec la synthèse d’ATP, tandis que d’autres situations vont

entraîner une augmentation de la consommation d’ATP, ce qui en conséquence va conduire à

une élévation du rapport ADP/ATP, puis du rapport AMP/ATP. En réponse à ces

déséquilibres énergétiques, l’AMPK, activée par phosphorylation, permet de restaurer

l’homéostasie énergétique en activant les processus cataboliques et en réprimant les processus

anaboliques, tels que la synthèse protéique. L’AMPK est une kinase hétéro-trimérique

composée d’une sous-unité catalytique α (isoformes α1 et α2) et de deux sous-unités non

catalytiques β (isoformes β1 et β2) et γ (isoformes γ1, γ2 et γ3) (Kemp, et al. 2003). En

22

différents mécanismes moléculaires. L’AMPK a la capacité de phosphoryler TSC2 sur ces

résidus Thr

¹²²⁷

et Ser

¹³⁸⁷

, menant au bout du compte à une inhibition de mTOR (Inoki, et al.

2003b). L’AMPK entraîne également une inhibition de l’activité de mTOR, en phosphorylant

le résidu Ser

²⁴⁴⁶

de mTOR (Cheng, et al. 2004), ou en phosphorylant raptor, une sous-unité de

mTORC1, sur ses résidus Ser

⁷²²

et Ser

⁷⁹²

(Gwinn, et al. 2008). Enfin, l’AMPK intervient dans

l’inhibition de l’élongation de la traduction en agissant indirectement sur eEF2 (eukaryotic

Elongation Factor 2), via eEF2K (eukaryotic Elongation Factor 2 Kinase) (Horman, et al.

2002). Il semble donc que l’effet répresseur de l’AMPK sur mTOR soit conditionné par

plusieurs mécanismes moléculaires, agissant soit en synergie, soit selon la spécificité

cellulaire. Quoi qu’il en soit, l’AMPK apparaît comme un répresseur important de la voie

mTOR dans le muscle squelettique, puisque l’activation de l’AMPK par l’agent

pharmacologique AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribonucleoside)

provoque une inhibition de cette voie de transduction, ce qui conduit à une altération de la

protéosynthèse (Bolster, et al. 2002 ; Williamson, et al. 2006).

ADP AMP AMPK ATP

Adénylate kinase

Catabolisme

Anabolisme

Augmentation de la consommation d’ATP (croissance et division cellulaires, synthèse protéique…)

Stress métabolique(hypoxie, restriction calorique…)

ATP

Figure 1.II.2. Régulation du métabolisme par l’AMPK. [figure réalisée à partir du schéma

présenté par (Hardie 2007)].

Un autre mécanisme de régulation négative de mTOR a été récemment mis en évidence.

Initialement, deux facteurs ont été identifiés, REDD1 (REgulated in Development and DNA

damage responses 1) et REDD2 (aussi appelés RTP801/DDIT4 et RTP801L/DDIT4L,

respectivement), pour leur rôle dans la répression de mTOR chez la drosophile (Reiling and

23

Hafen 2004). Dans les années qui ont suivi, il a été démontré in vitro et in vivo dans divers

types cellulaires, dont les cellules musculaires, que ces deux facteurs sont sécrétés en réponse

à un stress cellulaire intense (exposition à l’hypoxie, intoxication à l’alcool, traitement au

dexaméthasone, exercice physique), et contribuent à altérer l’activité de mTOR en agissant en

aval d’Akt sur le facteur TSC2 (Brugarolas, et al. 2004 ; Corradetti, et al. 2005 ; DeYoung, et

al. 2008 ; Murakami, et al. 2011). Il semble par ailleurs que l’expression de REDD1 soit

ubiquitaire (Miyazaki and Esser 2009b) alors que REDD2 serait enrichi dans les cellules

musculaires, au moins chez la souris et chez l’homme (Miyazaki and Esser 2009b)

(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/).

En résumé, l’activation de mTOR est dépendante de plusieurs voies de signalisation, la

voie IGF-I/insuline, la voie médiée par des mécano-senseurs et celle dépendante de l’apport

en acides aminés. D’autres facteurs comme REDD1/2 et l’AMPK sont actuellement

clairement identifiés comme responsables de l’inhibition de l’activité de mTOR. Le dogme

selon lequel l’activité de mTOR est préférentiellement déterminée par la voie IGF-I/PI3K/Akt

est actuellement remis en question. Il semble plutôt que l’ensemble de ces voies agit en

synergie pour permettre une régulation fine du niveau d’activation de mTOR en adéquation

avec le statut métabolique du muscle (situation anabolisante ou catabolisante). L’ensemble de

ces mécanismes moléculaires sont synthétisés dans la figure 1.II.3.

24

PI3K

Akt

TSC1/TSC2

Rheb

mTOR

Synthèse

protéique

Étirement/stress

mécanique

(FAK, β-intégrine, ILK)

Facteurs de croissance

(Insuline, IGF-I)

Acides aminés

Hypoxie,

dexamethasone, alcool,

exercice en endurance

Stress énergétique

AMPK

REDD1/REDD2

PLD1

PA

Vsp34

Régulateurs positifs de mTOR Régulateurs négatifs de mTOR

ERK1/2

GSK-3

eIF2B

Figure 1.II.3. Schéma général présentant les facteurs intervenant dans la régulation de la voie

mTOR.

PLD1 : phospholipase D1

PA : phosphatidic acid

Vps34 : vacuolar protein sorting 34

FAK: Focal Adhesion Kinase

ILK: Integrin-Linked Kinase.

Les flèches en trait plein symbolisent les mécanismes d’action moléculaires bien établis alors

que les flèches en pointillés illustrent les mécanismes moléculaires qui doivent être

approfondis [figure adaptée à partir des schémas de (Miyazaki and Esser 2009a ; Philp, et al.

25

II.1.B.1.b. Les cibles de mTOR et leur implication dans la capacité et

l’efficacité traductionnelles

La traduction d’un ARNm en protéine fait intervenir quatre étapes principales :

l’initiation, l’élongation, la terminaison et le recyclage [pour revue, voir (Kapp and Lorsch

2004)]. Par souci de concision, nous concentrerons notre analyse sur le rôle joué par mTOR

dans les deux premières étapes de la traduction (ce qui permet d’évaluer en partie l’efficacité

traductionnelle) et dans la biogenèse ribosomale, qui est un déterminant essentiel de la

capacité traductionnelle [pour revues, voir (Shah, et al. 2000; Wullschleger, et al. 2006 ;

Yang, et al. 2008 )].

Au cours de la phase initiale de l’initiation de la traduction, il est nécessaire de recruter

le complexe de pré-initiation de la traduction 43S. Ce complexe est constitué d’une sous-unité

ribosomale 40S, du facteur d’initiation eIF3 (eukaryotic Initiation Factor 3) et d’un complexe

ternaire contenant lui-même un ARN de transfert porteur d’une méthionine (ARNt

^Met

), un

facteur d’initiation de la traduction eIF2 (eukaryotic Initiation Factor 2), et un GTP (Figure

1.II.4). Le recrutement de ce complexe sur l’extrémité 5’ P de l’ARNm composé d’une coiffe

de méthyl-guanosine est conditionné par un ensemble de facteurs d’initiation de la traduction

formant le complexe eIF4F (eukaryotic Initiation Factor 4F). Ce complexe est formé à partir

d’une protéine de fixation à la coiffe eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E), d’une protéine

de structure eIF4G (eukaryotic Initiation Factor 4G) et d’une hélicase dépendante de l’ATP

eIF4A (eukaryotic Initiation Factor 4A). Lorsque eIF4F est correctement agencé sur la coiffe

de l’ARNm, le complexe 43S est recruté et se lie à la partie 5’ à proximité de la coiffe, avant

d’évoluer le long de la séquence 5’ UTR (untranslated region) de l’ARNm jusqu’à atteindre le

codon d’initiation de la traduction AUG. mTOR est capable de contrôler cette étape

d’initiation de la traduction en régulant le niveau de phosphorylation de la protéine 4E-BP1

(eIF-4E Binding Protein 1), un répresseur d’eIF4E (Figure 1.II.4). Une fois phosphorylée par

mTOR, 4E-BP1 se dissocie d’eIF4E, et pourrait être ubiquitinée avant d’être dégradée par le

protéasome (Walsh and Mohr 2004; Elia, et al. 2008). eIF4E devient alors fonctionnel pour

interagir avec la protéine eIF4G, ce qui conduit au bon déroulement de l’étape d’initiation de

la traduction.

26

60S

43S

coiffe

eIF4E

eIF4-G

eIF4A

AUG

40S

ARNt

Met

eIF2

GDP ^GTP

eIF3

INITITATION DE LA

TRADUCTION

P

mTOR

Figure 1.II.4. Schéma général présentant le rôle joué par mTOR dans le contrôle de l’étape

d’initiation de la traduction.

Outre son rôle dans l’inhibition de 4E-BP1, une des cibles principales de mTOR est

P70

^S6K

. Cette kinase est phosphorylée sur son site Thr

³⁸⁹

par mTOR mais son activation

complète est également dépendante d’autres sites de phosphorylation contrôlés par PDK1

(Phosphoinositide-Dependent protein Kinase 1) (Pullen, et al. 1998), PKC (Protein Kinase C)

(Holz and Blenis 2005) ou encore ERK1/2 (Deldicque, et al. 2008). Une fois activée, P70

^S6K

entraîne l’activation de la protéine ribosomale rpS6 (ribosomale protein S6), faisant partie

intégrante du complexe ribosomal 40S, ce qui a pour conséquence d’augmenter la traduction

d’un certain nombre d’ARNm contenant une séquence 5’ TOP (tract of oligopyrimidine).

Cette famille d’ARNm, représentative d’une proportion importante des ARNm cellulaires

(15-20% de la totalité), code majoritairement pour des composants de l’appareil traductionnel,

en particulier des protéines ribosomales et des facteurs d’élongation de la traduction.

Néanmoins, l’action de P70

S6K

sur les ARNm 5’ TOP a été récemment remise en question

(Pende, et al. 2004). En outre, P70

^S6K

conditionne en partie le bon déroulement de

l’élongation de la traduction en favorisant l’activation du facteur eEF2. P70

S6K

inhibe tout

d’abord le facteur eEF2K (une kinase d’eEF2 décrite au départ comme étant dépendante du

complexe Ca

²⁺

/calmoduline), ce qui lève ensuite l’effet répresseur de cette dernière sur eEF2.

Au final, P70

^S6K

favorise l’activité d’eEF2 en régulant négativement et indirectement sa

27

Pour améliorer la capacité traductionnelle de la cellule, il ne suffit pas d’augmenter le

contenu en protéines ribosomales, il est nécessaire d’élever la quantité en ARNr (ARN

ribosomal), qui constituent le cœur du ribosome. Il a été démontré il y a quelques années que

la rapamycine pouvait inhiber la biogenèse ribosomale en réprimant la transcription de gènes

ribosomaux (dont les produits sont des ARNr et dont la transcription est régie par une ARN

polymérase I), et en affectant négativement la transcription de gènes codant pour des

protéines ribosomales (étape de transcription régie par une ARN polymérase II) (Martin and

Hall 2005). Sans rentrer dans les détails [pour revues voir (Martin and Hall 2005 ;

Wullschleger, et al. 2006 )], mTOR joue un rôle important dans la régulation de la RNA

polymérase I en agissant sur le facteur de transcription RRN3/TIF1A et dans le contrôle de la

transcription de gènes ribosomaux via le facteur de transcription FHL1 (Four and a Half LIM

domains protein 1).

mTOR intervient dans l’efficacité traductionnelle en régulant l’initiation de la

traduction via la répression du facteur 4E-BP1 et l’élongation de la traduction via l’activation

d’eEF2 par P70

S6K

. En outre, mTOR est un acteur clé de la biogenèse ribosomale, puisque

cette protéine facilite à la fois la synthèse de protéines ribosomales (activation de la

transcription de gènes codant pour des protéines ribosomales et augmentation de la traduction

d’ARNm 5’ TOP) et la transcription des gènes ribosomaux. L’ensemble des cibles de mTOR

et son rôle biologique dans le contrôle de la synthèse protéique sont résumés dans la figure

1.II.5.

28

mTORC1

P70

S6K

rpS6

eEF2K

eEF2

4E-BP1

eIF4B

Transcription

eIF4E

Initiation de la

traduction

Elongation de la

traduction

Biogenèse

ribosomale

Protéines

ribosomales ^ARNr

Synthèse protéique

Gènes codant pour

des protéines

ribosomales

gènes

ribosomaux

Figure 1.II.5. Schéma général présentant les cibles de mTOR et leur rôle dans la régulation

des étapes traductionnelles (efficacité traductionnelle) et de la biogenèse ribosomale (capacité

traductionnelle).

29

II.1.B.2. Autres mécanismes cellulaires et moléculaires régulateurs de

Dans le document Contrôle de la masse et du phénotype musculaires en hypoxie : leçons tirées de modèles de croissance du muscle squelettique chez le rongeur (Page 31-42)