Evaluation biochimique du phénotype musculaire

VI.1. Electrophorèse des MHC

Cette analyse a pour objectif d’évaluer la distribution des différentes isoformes de MHC

présentes dans le muscle. Le protocole de cette technique de référence est bien décrit dans la

140

VI.1.A. Extraction

Une tranche complète de muscle (10 à 20 mg pour le plantaris et environ 5 mg pour le

soléaire) est découpée au scalpel et diluée dans 7 volumes de tampon d’extraction spécifique

(solution d’eau ultrapure avec 0,3 M de NaCl, 0,1 M de NaH

2

PO

4

, 0,05 M de Na

2

HPO

4

, 0,01

M de Na

4

P

2

O

7

, 1 mM de MgCl

2

-6H

2

O, 10 mM d’EDTA, 1,4 mM de β-Mercapto-Ethanol, pH

= 6,5). Le muscle est ensuite dilacéré et incubé 24 h à 4°C. L’extrait est ensuite centrifugé à

13 500 g pendant 15 min à 4°C, puis le surnageant prélevé est dilué au demi dans du glycérol

afin de faciliter la séparation des différentes isoformes de MHC. Les extraits sont ensuite

conservés à -20°C jusqu’à leur utilisation.

VI.1.B. Séparation des isoformes de MHC

Du tampon de charge contenant 5% de β-Mercapto-Ethanol est utilisé pour diluer les

extraits protéiques avant leur dépôt. Les dilutions utilisées varient en fonction du muscle

(plantaris ou soléaire), des durées d’application de la surcharge fonctionnelle et des temps de

récupération post-lésionnels (tableau 3.VI.1). Les échantillons dilués sont ensuite chauffés au

bain sec pendant 8 min à 95°C.

10 µL d’extrait dilué sont ensuite déposés dans les puits du gel d’électrophorèse. Un

échantillon témoin contenant l’ensemble des isoformes de MHC est déposé sur chaque gel

d’électrophorèse afin d’évaluer la qualité de la séparation des bandes de MHC. La

composition des gels de concentration et de séparation est différente de celle des gels utilisés

en Western Blot, en particulier du fait de la présence de glycérol (tableau 3.IV.2). Les gels de

0,75 mm d’épaisseur sont ensuite positionnés dans des cuves Mini-Protean II (Biorad). Le

tampon de migration intérieur est du TGS 1x (Biorad) et le tampon de migration extérieur est

du TGS 0,5x (Biorad). 84 µL de β-Mercapto-Ethanol sont également ajoutés dans le tampon

de migration intérieur pour favoriser la destruction des ponts disulfures des protéines. La

migration est réalisée à 72 V pendant 31 h à 4°C.

141

Tableau 3.VI.1. Dilution des échantillons pour électrophorèse des isoformes de MHC.

Muscle Groupe Dilution

Contrôle 1/400

Overload J5 1/100

Overload J12 1/200

Overload J56 1/250

Intact 1/300

Régénéré J3 1/20

Régénéré J7 1/150

Régénéré J14 1/150

Régénéré J28 1/300

Plantaris

Soléaire

VI.1.C. Coloration des protéines au nitrate d’argent

La technique de coloration au nitrate d’argent est constituée des étapes suivantes :

 L’étape de Fixation. Les gels sont incubés dans une solution de fixation (45% de

méthanol, 10% d’acide acétique et 0,5 mL.L

-1

de formaldéhyde 37%) pendant une

durée comprise entre 3 et 72h.

 L’étape de prétraitement. Après trois lavages successifs de 20 min dans une solution

d’éthanol à 50%, les gels déshydratés et devenus blanchâtres sont agités pendant 45

sec dans une solution de thiosulfate de sodium à 0,2 g.L

^-1

.

 L’étape de coloration. Après trois rinçages de 20 sec à l’eau ultrapure, les gels sont

placés pendant 30 min dans une solution de coloration composée de 2 g.L

^-1

de nitrate

d’argent et de 0,75 mL.L

-1

de formaldéhyde 37%.

 L’étape de développement. Après trois rinçages de 20 sec à l’eau ultrapure, les gels

sont mis en contact avec une solution de développement contenant 60 g.L

^-1

de

carbonate de sodium, 0,5 mL.L

^-1

de formaldéhyde 37% et 4 mg.L

^-1

de thiosulfate de

sodium. Les bandes des différentes isoformes de MHC apparaissent alors

progressivement en quelques minutes. Avant que les bandes ne deviennent saturées, la

solution de développement est éliminée et la réaction est arrêtée dans la solution de

fixation (sans formaldéhyde), laquelle sert également à conserver les gels.

142

VI.1.D. Quantification

Les gels sont ensuite numérisés par un scanner (GS800 Biorad) et les différentes

isoformes sont quantifiées de manière relative par densitométrie à l’aide du logiciel Quantity

One (Biorad). La somme des pourcentages des différentes isoformes est donc égale à 100. La

distribution des isoformes de MHC pour l’échantillon témoin est comparée entre les différents

gels pour vérifier la bonne reproductibilité de la technique.

VI.2. Analyses des activités enzymatiques

L’activité d’une enzyme est déterminée à partir de la quantité de substrat que l’enzyme

est capable de transformer par unité de temps dans des conditions expérimentales bien

définies (pH, température, concentration du substrat, dilution de l’échantillon). L’analyse des

activités enzymatiques est réalisée par spectrophotométrie. Cette technique consiste à suivre

la cinétique d’évolution d’un produit ou d’un réactif grâce à son spectre d’absorption

spécifique, localisé dans le domaine du visible.

VI.2.A. Extraction des enzymes

Une coupe transversale de muscle (10 à 20 mg pour le plantaris et 5 à 8 mg pour le

soléaire) est découpée au scalpel et diluée dans 19 volumes de tampon d’extraction spécifique

(solution d’eau ultrapure avec 5 mM d’HEPES [Acide

N-(2-hydroxyéthyl)piperazine-N’-2-éthanesulfonique], 1 mM d’EGTA, 0,1% de Triton, et 1 mM de DTT ajouté

extemporanément ; pH = 8,7), avant d’être broyée par agitation avec des billes jetables (2 min

à 30 Hz dans le broyeur Rescht MM300). Les broyats tissulaires sont ensuite incubés à 4°C

pendant une heure avant d’être congelés à -80°C. Cette extraction enzymatique permet

d’évaluer l’activité de la CS, la COX et la LDH.

VI.2.B. Mesure de l’activité de la citrate synthase

L’activité de la citrate synthase est évaluée à partir de la mesure de l’apparition de l’ion

mercaptide (C6O4S

^2-

), qui absorbe à une longueur d’onde 412 nm. Cette mesure est réalisée à

143

Acétyl-CoA + Oxaloacétate + H

2

O CS Citrate + Co-enzymeA + H

+

Co-enzymeA-SH + DTNB Co-enzymeA-S + C

₆

O

₄

S

2-

+ H

+

Pour chaque série de mesures, une cuve contenant 1 mL de tampon d’extraction est

présente dans le dernier emplacement du spectrophotomètre afin de contrôler la stabilité de la

mesure au cours de l’expérimentation.

Une première mesure de 3 min à 30°C est réalisée dans des cuves de 1,5 mL contenant

940 µL de tampon de mesure (810 µL d’eau ultrapure, 100 µL de DTNB Ellman’s

[5.5’-dithiobis-(2-Nitrobenzoic acide)] à 10 mM dans du Tris-HCl à 1 M, et 30 µL d’actélyl-CoA à

10 mM) et 10 µL d’échantillon dilué (1/5 pour le plantaris et 1/4 pour le soléaire). Cette

mesure sans réactif permet d’obtenir l’état initial de la réaction (pente 1).

La réaction est ensuite initiée par l’ajout de 50 µL d’oxaloacétate à 10 mM et

l’apparition de l’ion mercaptide est évaluée pendant 3 min. L’évolution de l’absorbance

permet de déterminer la pente 2.

L’activité de la CS est déterminée en unités internationales par gramme de poids frais

(UI.g

^-1

) à partir de la loi de Beer-Lambert:

CS (UI) = [pente 2 – pente 1) x 10

⁶

] / (∑ x A x B x C)

∑ = coefficient d’extinction molaire de l’ion mercaptide = 13 600 L.mol

^-1

.cm

^-1

A = dilution de l’extrait dosé

B = Dilution de l’extrait lors du dosage = 1/100

C = concentration massique de l’échantillon = 50 mg.mL

-1

VI.2.C. Mesure de l’activité de la cytochrome c oxydase

Cette analyse enzymatique n’a été réalisée que dans l’expérimentation « Hypertrophie

de surcharge en hypoxie ». L’activité de la cytochrome c oxydase (COX) est évaluée à partir

de la mesure de la disparition du cytochrome c réduit, qui absorbe à une longueur d’onde de

550 nm et qui possède un coefficient d’extinction molaire égal à 18 500 L.mol

^-1

.cm

^-1

. Les

144

Cyt c réduit + O

₂

^COX Cyt c oxydé + H

₂

O

La première étape consiste à mesurer l’absorbance de 1 mL de solution de cyt c (50 µM

de cyt c de cheval, 25 mM de K

2

HPO

4

, pH = 7,4) réduit à 90%. On obtient alors l’état initial

de la réaction (pente 1). Ce niveau de réduction est atteint lorsque l’ajout progressif de

dithionite de sodium permet d’obtenir une absorbance correspondant à 90% de celle de la

solution de cyt c totalement réduit. Une cuve de référence contenant 1 mL de solution de cyt c

totalement oxydé (50 µM de cyt c de cheval, 25 mM de K

2

HPO

4

, 10 mg de ferricyanure de

potassium, pH = 7,4) est également placée dans le spectrophotomètre.

La seconde mesure est réalisée après l’ajout de 40 µL d’échantillon dilué au 1/5. La

variation de l’absorbance permet de calculer la pente 2.

L’activité de cette enzyme est déterminée en IU.g

-1

à partir de la loi de Beer Lambert

décrite dans l’analyse de l’activité de la CS.

VI.2.D. Mesure de l’activité de la lactate déshydrogénase

Cette analyse enzymatique n’a été réalisée que dans l’expérimentation « Régénération

musculaire en hypoxie ». L’activité de la LDH est évaluée à partir de la variation de

l’absorbance induite par la disparition de son co-enzyme, le NADH,H

+

. Ce dernier absorbe à

une longueur d’onde de 340 nm et son coefficient d’extinction molaire est égal à 6 220 L.mol

-1

.cm

^-1

. L’activité de cette enzyme est évaluée à partir de la réaction suivante :

Pyruvate + NADH,H

+

Lactate + NAD

LDH

Les mesures sont réalisées à 30°C durant 3 min à 340nm dans des cuves de 4 mL.

La première mesure évalue l’absorbance d’un mélange de 3 mL de tampon phosphate

(34,1 mM de K

2

HPO

4

, 7,35 mM de KH

2

PO

4

, 0,63 mM de pyruvate de sodium, pH 7,5) et de

50 µL de tampon de substrat (14,1 mM de NADHNa

2

et 118,9 mM de NaHCO

3

). Cette étape

correspond à l’état initial de la réaction (pente 1). La cuve de référence contient 3,05 mL de

tampon phosphate.

145

La seconde mesure permet de déterminer la variation de l’absorbance après l’ajout de

20 µL d’échantillon dilué au 1/10 dans le tampon phosphate. La pente 2 est déterminée à

partir de l’évolution de l’absorbance entre le début et la fin de la réaction.

L’activité de cette enzyme est déterminée en IU.g

-1

à partir de la loi de Beer Lambert

décrite dans l’analyse de l’activité de la CS.

VI.2.E. Quantification des isoformes de la LDH

La LDH est présente sous différentes isoformes. Il est possible de déterminer l’activité

spécifique de chaque isoforme à partir de l’activité de la LDH totale et de leur pourcentage de

répartition déterminé par électrophorèse. La séparation des 5 tétramères de la LDH est

effectuée par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1% (kit Titan gel LDH isoenzymes,

Helena Biosciences). Le réactif de coloration contient des substrats (NAD et lactate) en excès,

ce qui facilite la formation de pyruvate. Ce réactif est également composé de phénazine

méthosulfate qui initie la réaction en cascade d’après le couplage enzymatique suivant :

Lactate + NAD Pyruvate + NADH,H

+

NADH,H

+

+ sels de tétrazolium

Phénazine méthosulfate

LDH

NAD + Formazan

Ce couplage enzymatique conduit à la formation de formazan, un produit observable à

la lumière visible, dont la formation est proportionnelle à celle du pyruvate formé et donc à

l’activité de la LDH présente au niveau de chaque tétramère séparé.

1 µL d’extrait pur est déposé au centre du gel, avant que celui-ci ne soit disposé en pont

entre les deux compartiments de la cuve de migration (Titan gel LDH, Helena Biosciences)

contenant chacun 40 mL de tampon d’électrophorèse fourni dans le kit. Une migration de 30

min à 100 V est alors effectuée.

1 mL de réactif de coloration fourni dans le kit est ensuite étalé sur le gel avant que

celui-ci ne soit placé dans une étuve à 45°C pendant 25 min. Le gel développé est alors rincé

dans une solution d’acide acétique à 10% puis séché.

146

Le gel est numérisé par un scanner (GS800 Biorad) et la quantification relative de

chaque tétramère est déterminée par densitométrie à l’aide du logiciel Quantity One (Biorad).

Les pourcentages respectifs des sous-unités H et M sont calculés selon les formules suivantes

(De Sousa, et al. 2000) :

% M = M

4

+ ¾ M

3

H + ½ M

2

H

2

+ ¼ MH

3

% H = ¼ M

3

H + ½ M

2

H

2

+ ¾ MH

3

+ H

4

Une image descriptive de la séparation des différents tétramères de la LDH est

présentée dans la figure 3.VI.1. L’activité spécifique de la H-LDH et de la M-LDH est alors

déduite à partir de l’activité totale de la LDH et des pourcentages calculés des deux

sous-unités M et H.

M

₄

M

₂

H

₂

M

₃

H

H

₄

MH

₃

+

-Figure 3.VI.1. Localisation des différents tétramètres de la LDH sur le gel d’agarose.

Dans le document Contrôle de la masse et du phénotype musculaires en hypoxie : leçons tirées de modèles de croissance du muscle squelettique chez le rongeur (Page 152-159)