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PARTIE 3 : MATERIELS ET METHODES

IV. Quantification des niveaux protéiques par Western Blot

IV.1. Extraction et dosage des protéines

Une coupe transversale de muscle localisée dans une région similaire pour tous les

échantillons de chaque étude (10 à 20 mg) est découpée au scalpel, diluée au 1/10 dans du

tampon d’extraction (composition dans le tableau 3.IV.1) et broyée par agitation avec des

billes en céramique (2 min à 30 Hz dans le broyeur Rescht MM300). Les broyats tissulaires

sont ensuite incubés toute à la nuit à 4°C, puis centrifugés à 12 000 g pendant 20 min à 4°C.

Le surnageant est ensuite divisé en plusieurs aliquots et congelés à -80°C. La quantité totale

de protéines extraites est évaluée avant congélation sur une partie du surnageant, par dosage

au BCA réalisé sur automate (Analyser Multiparametric Hitachi 912).

Tableau 3.IV.1. Composition du tampon d’extraction utilisé en Western Blot.

Réactifs Concentration

Tris HCL 50 mM

NaCl 100 mM

EGTA 2 mM

EDTA 2 mM

DTT 1 mM

Sodium Fluorure 50 mM

Acide Okadaïc 120 nM

Benzamidine 3 mM

Glycérophosphate 50 mM

PMSF 1 mM

Anti-protéases: Cocktail Set III, EDTA

free (Calbiochem) 5 µL.mL

-1

Anti-phosphatases: Cocktail Set II

(Calbiochem) 5 µL.mL

-1

Eau ultrapure qsp

Le pH du tampon d’extraction est ajusté à 7,4.

EGTA : Acide éthylène glycol-bi(β-aminoéthyl ether)-N,N,N’,N’-tétraacétique ;

EDTA : Acide éthylènediamintétraacétique ;

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IV.2. Séparation des protéines par électrophorèse

Les gels de séparation et de concentration sont fabriqués manuellement (1 mm

d’épaisseur) et la concentration en acrylamide du gel de séparation est adaptée à la masse

molaire des protéines étudiées (tableau 3.IV.3). La polymérisation des gels est conditionnée

par l’ajout de Temed (N,N,N’,N’-tétraméthyléthylénédiamine) et de persulfate d’ammonium.

La composition des gels est présentée dans le tableau 3.IV.2.

La quantité de protéines déposée est spécifique de la protéine évaluée (tableau 3.IV.3) et

est identique pour tous les échantillons étudiés pour une protéine d’intérêt. Le volume à

déposer au cours de l’électrophorèse est calculé à partir de la concentration protéique de

chaque échantillon. La quantité de protéines prélevées est diluée dans 10 µL de tampon de

charge (tampon de Laemmli) contenant 5% de β-Mercapto-Ethanol. Les protéines sont ensuite

dénaturées 8 min à 95°C dans un bain sec. Après une centrifugation de quelques secondes, la

totalité du volume est déposée dans les puits du gel d’électrophorèse. Chaque gel contient un

marqueur de poids moléculaire (Euromedex, #06P-0111), des échantillons des différents

groupes expérimentaux positionnés alternativement, et un témoin interne, en général composé

d’un pool de différents échantillons, identique dans l’ensemble des gels pour une protéine

d’intérêt.

L’électrophorèse est réalisée à 4°C dans des cuves Mini Protean II ou IV (Biorad,

France) contenant du tampon de migration TGS (Tris-Glycine-SDS [Sodium Dodécyl

Sulfate]) 1x (Euromedex). Les conditions de migration pour chaque protéine sont présentées

dans le tableau 3.IV.3.

Tableau 3.IV.2. Composition des gels d’électrophorèse

Concentration Séparation Concentration Séparation

Glycérol / / 30% 30% Acrylamide 4% 8 à 15% 4% 8% Bisacrylamide 0,10% 1/40 du % d'acrylamide 0,08% 0,16% Tris-HCl 125 mM (pH = 6,8) 375 mM (pH = 8,8) 70 mM (pH = 6,8) 0,2 M (pH = 8,8) Glycine / / / 0,1 M EDTA / / 4 mM / SDS 0,1% 0,1% 0,4% 0,4% Temed (Ext) 0,1% 0,05% 0,1% 0,05%

Persulfate d'amonium (Ext) 0,05% 0,05% 0,1% 0,1%

Eau ultrapure qsp qsp qsp qsp

Réactifs

Western Blot Electrophorèse des MHC

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Tableau 3.IV.3. Conditions de Western Blot utilisées pour le dépôt, la migration, le transfert et la saturation pour l’ensemble des protéines

étudiées.

Poids % gels Quantité Migration Transfert

Moléculaire Sep./Con. Protéine Tps / Volt. Tps / Volt. Tampon Tps

mTOR 290 kDa 8% / 4% 50µg 3h / 90V 4h / 90V T-lait 5% 2h

Akt1 60 kDa 8% / 4% 25µg 2h15 / 150V* 1h / 100V* T-lait 5% 1h

Akt

thr308

60 kDa 8% / 4% 25µg 2h15 / 150V* 1h / 100V* T-lait 5% 1h

Akt

ser473

60 kDa 8% / 4% 75µg 3h / 90V 3h / 90V T-lait 5% 2h

P70

S6K

70 kDa 12% / 4% 50µg 2h30 / 120V 3h / 90V T-lait 5% 2h

rpS6 32 kDa 10% / 4% 50µg 2h30 / 90V 4h / 90V T-lait 5% 1h30

4E-BP1 15-20 kDa 12% / 4% 50µg 2h30 / 120V 3h / 90V T-lait 5% 2h

eEF2 95 kDa 8% / 4% 25µg 2h15 / 150V* 1h / 100V* T-lait 5% 1h

AMPKα 62 kDa 10% / 4% 50µg 3h / 90V 3h / 90V T-lait 5% 2h

REDD1 25 kDa 12% / 4% 50µg 3h / 90V 3h / 90V T-lait 5% 2h

BNIP3 30 kDa 15% / 4% 50µg 2h / 200V* 1h / 100V* T-lait 5% 2h

MyoD 45 kDa 12% / 4% 50µg 2h30 / 120V 3h / 90V P-lait 5% 2h

Myogénine 36 kDa 15% / 4% 50µg 2h20 / 200V* 1h / 100V* T-lait 5% 2h

p38 43 kDa 10% / 4% 75µg 2h30 / 90V 3h / 90V T-lait 5% 2h

Foxo-1

Thr24

78-82 kDa 8% / 4% 75µg 3h30 / 90V 3h / 90V T-lait 5% 2h

Foxo-3a

Thr32

95 kDa 8% / 4% 75µg 3h30 / 90V 3h / 90V T-lait 5% 2h

Myostatine 28 kDa 8% / 4% 75µg 3h / 90V 3h / 90V T-BSA 5% 2h

Protéine Saturation

T : TBS-Tween (0,1%) ; P : PBS-Tween (0,1%). BSA: Bovine Serum Albumin ;* :utilisation des systèmes Mini protean IV (Biorad). Les autres

conditions de migration et de transfert ne présentant pas d’astérisques sont réalisées avec les systèmes Mini Protean II (Biorad). Le pourcentage

des gels de séparation et de concentration correspond à celui d’acrymalide. Pour la composition exacte des gels, voir le tableau 3.IV.2.

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IV.3. Electrotransfert des protéines sur la membrane

L’étape de transfert est réalisée dans des cuves Mini Protean II ou IV (Biorad). Chaque

sandwich est constitué de deux feuilles de papier Whatman, de deux éponges abrasives, d’un

gel et d’une membrane en nitrocellulose. Au moment du montage du sandwich, une attention

particulière est portée sur l’élimination des bulles d’air comprises entre le gel et la membrane.

Les plaques en plastique contenant le sandwich sont ensuite insérées dans une cuve contenant

un bloc réfrigéré et du tampon de transfert composé de TG (Tris-Glycine) 1x (Euromedex) et

de 20% de méthanol. Cette opération se déroule à 4°C et de la glace est ajoutée autour de la

cuve pour les transferts se prolongeant plus de trois heures.

La qualité du transfert est évaluée en colorant le gel au bleu de Coomassie (évaluation

de la quantité de protéines non-transférées) et en colorant la membrane au rouge Ponceau

(contrôle de l’efficacité du transfert, de l’absence de bulle d’air durant cette étape et de

l’homogénéité du transfert). La membrane est ensuite décolorée à l’eau avant l’étape de

saturation. Les conditions de transfert sont présentées dans le tableau 3.IV.3.

IV.4. Immunorévélation des protéines d’intérêt et

quantification

Plusieurs étapes sont nécessaires avant de pouvoir révéler et quantifier les protéines

d’intérêt. Les conditions de chacune de ces étapes sont détaillées dans le tableau 3.IV.4.

L’étape de saturation consiste à saturer les sites non spécifiques de la membrane.

Pour cela, la membrane est incubée à température ambiante dans une solution de

rinçage généralement à base de TBS (Tris-Buffer-Sulfate)-Tween (tween20, 0,1%),

dans laquelle est ajoutée 5% de lait (Lait déshydraté du commerce, de marque

Régilait). Un lavage de 5 min dans une solution de rinçage est ensuite effectué.

L’étape d’incubation dans l’anticorps primaire. La protéine cible joue le rôle de

l’antigène sur lequel va pouvoir se fixer l’anticorps primaire. L’incubation se réalise à

4°C pendant une nuit. Suite à cette étape, trois lavages de 10 min sont réalisés dans du

tampon de rinçage.

L’étape de réaction avec l’anticorps secondaire. Ce type d’anticorps, couplé à une

enzyme HorseRadish Peroxydase (HRP), est capable de se fixer sur le complexe

protéine/anticorps primaire. Cette étape est réalisée à température ambiante pendant

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2h. Suite à cette étape, trois lavages de 10 min sont réalisés dans du tampon de

rinçage.

L’étape de détection des protéines. L’activité de la HRP est détectée par

chimiluminescence. Brièvement, en présence de son substrat et d’eau oxygénée,

l’HRP va oxyder le luminol et libérer de l’énergie sous la forme d’un signal lumineux.

Cette réaction est initiée par l’application de 1 mL d’un mélange des réactifs du kit

ECL (Amersham Biosciences) sur la membrane. La membrane est ensuite enveloppée

d’un film protecteur transparent et recouverte en chambre noire d’un film

photographique (Hyperfilm ECL, Amersham Biosences). Après quelques minutes de

contact, le film est immergé dans une solution de révélation (Kodak, 5071071) jusqu’à

l’apparition de bandes sombres correspondant aux protéines, avant d’être rincé dans

une solution stop (Tetenal) puis placé dans une solution de fixation (Kodak 1464593).

Le film devenu translucide est alors rincé à l’eau et séché.

L’étape de quantification. Les films obtenus sont numérisés à l’aide d’un scanner

(GS800 Biorad), avant que les bandes des protéines d’intérêt ne soient quantifiées par

densitométrie à l’aide du logiciel Quantity One (Biorad). La valeur obtenue tient

compte de la densité et de la surface de la bande. Le signal correspondant au bruit de

fond est soustrait de la valeur brute de chaque échantillon. Enfin, cette valeur est

rapportée pour chaque échantillon à celle du témoin interne afin de s’affranchir des

variations inter-expérimentations.

IV.5. Décrochage des anticorps et nouvelle révélation

Cette étape n’est réalisée que pour l’analyse des formes phosphorylées et totales d’une

même protéine sur un seul Western Blot.

A la suite de la révélation d’une protéine phosphorylée, une boîte en plastique contenant

la membrane est positionnée dans un bain marie, sans contact direct avec l’eau, pendant 30

min à 56°C. Durant cette étape, la membrane est incubée dans une solution contenant 2% de

SDS, 62,5 mM de Tris-HCl (pH = 6,8) et 10 mM de β-Mercapto-Ethanol. L’objectif de cette

opération est de déshybrider l’anticorps primaire de sa protéine d’intérêt.

Après trois lavages de 15 min dans le tampon de rinçage, les sites non spécifiques de la

membrane sont saturés avant l’incubation dans l’anticorps primaire dirigé contre la forme

totale de la protéine cible. La suite de la procédure est identique à celle précédemment décrite.

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Tableau 3.IV.4. Conditions de Western Blot utilisées pour les étapes d’incubation dans l’anticorps primaire et de réaction avec l’anticorps

secondaire.

Nom Référence Dilution Spécificité Référence Dilution

mTOR Cell Sig 2972 1/500 D anti R SC 2313 1/10000 x

mTORSer2448 Cell Sig 2971 1/500 D anti R SC 2313 1/10000 x

Akt1 Cell Sig 2938 1/1000 D anti R SC 2313 1/10000 x x

AktThr308 Cell Sig 4056 1/500 D anti R SC 2313 1/10000 x x

AktSer473 Cell Sig 9271 1/500 D anti R SC 2313 1/10000 x

p70S6K Cell Sig 2708 1/1000 D anti R SC 2313 1/10000 x x

p70S6K Thr389 Cell Sig 9234S 1/1000 D anti R SC 2313 1/10000 x x

rpS 6 Cell Sig 2217 1/1000 D anti R SC 2313 1/10000 x x

rpS 6Ser240/244 Cell Sig 4838S 1/1000 D anti R SC 2313 1/10000 x x

4E-BP1 Cell Sig 9452 1/1000 D anti R SC 2313 1/10000 x x

4E-BP1Thr70 Cell Sig 9455 1/1000 D anti R SC 2313 1/10000 x x

eEF2 Cell Sig 2232 1/2000 D anti R SC 2313 1/10000 x x

eEF2Thr56 Cell Sig 2331 1/1000 D anti R SC 2313 1/10000 x x

AMPKα Cell Sig 2532 1/500 D anti R SC 2313 1/10000 x x

AMPKαThr172 Cell Sig 2535 1/500 D anti R SC 2313 1/10000 x x

REDD1 Proteintech 10638-1-AP 1/750 Rabbit true blot Bioscience 18-8816-33 1/8000 x x

BNIP3 Abcam 109362 1/1000 D anti R SC 2313 1/10000 x

MyoD BD Pharmingen 554130 1/1000 G anti M SC 2005 1/10000 x

myogénine SC 12732 1/250 M ouse true blot Bioscience 18-8817-33 1/2000 x

p38 Cell Sig 9212 1/500 D anti R SC 2313 1/10000 x

p38Thr180/Tyr182 Cell Sig 9215 1/500 D anti R SC 2313 1/10000 x

Foxo-1Thr24 x Foxo-3aThr32 x myostatine SC 34781 1/200 D anti G SC 2020 1/10000 x Expérimentation «régénération musculaire en hypoxie» Anticorps primaire Anticorps secondaire Expérimentation

«hypertrophie de surcharge en hypoxie»

1/10000

Cell Sig 9464 1/500 D anti R SC 2313

L’anticorps primaire est toujours dilué dans du TBS-Tween (0,1%) BSA (5%) et l’incubation se fait pendant la nuit à 4°C. L’anticorps

secondaire est dilué dans du TBS-Tween (0,1%) lait (5%) et l’incubation est de deux heures à température ambiante. Pour l’étude de MyoD, les

solutions à base de TBS-Tween (0,1%) sont remplacées par du PBS-Tween (0,1%). D : donkey ; R : rabbit ; G : goat ; M : mouse ; Cell Sig : Cell

Signaling ; SC : Santa Cruz.

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