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PARTIE 3 : MATERIELS ET METHODES

I. Conditionnement animal

Deux conditionnements distincts d’animaux sont réalisés au cours de ce travail

expérimental. Le premier consiste à exposer à une hypoxie sévère des animaux dont le muscle

plantaris a été préalablement soumis à une surcharge fonctionnelle. Au cours de la seconde

expérimentation, le muscle soléaire est dégénéré et le processus de régénération est étudié

alors que les animaux sont exposés à l’hypoxie.

Les animaux sont des rats Wistar Han femelles de 170-190 g provenant de chez Charles

River (France). Nous avons choisi des femelles car leur prise alimentaire est moins affectée

par l’hypoxie que celle des mâles. Par ailleurs, les femelles sont plus résistantes aux effets

adverses de l’hypoxie aiguë que les mâles (Wood and Stabenau 1998). Ces animaux sont

élevés dans des conditions standards d’animalerie : température ambiante de 22 ± 2°C, cycle

lumière-obscurité de 12h/12h, accès libre à la nourriture (sauf nécessité d’appariement en

restriction) et à l’eau. Toutes les expérimentations sont conduites en accord avec la

Convention Européenne pour la Protection des Animaux Vertébrés et autres Sujets

Scientifiques (Council of Europe n° 129, Strasbourg, 1985) et après acceptation par le comité

d’éthique local (n° 2008/31.0).

I.1. Les modèles de croissance musculaire

I.1.A. L’hypertrophie de surcharge

Après 7 jours d’acclimatation dans l’animalerie périphérique du laboratoire, les

animaux sont répartis de façon aléatoire dans deux groupes expérimentaux : un groupe

composé d’animaux subissant une ablation musculaire bilatérale des agonistes pour soumettre

les deux muscles plantaris à une surcharge fonctionnelle (groupe Ov pour « overload ») et un

groupe constitué d’animaux contrôles non-opérés (groupe Ct). Le matin, les rats du groupe

Ov sont anesthésiés avec du pentobarbital sodique (50 mg.kg

-1

en intra-péritonéal) dilué au

demi dans du chlorure de sodium et la surcharge fonctionnelle du plantaris est accomplie par

l’ablation bilatérale de ses muscles agonistes, comme décrit précédemment (Bigard, et al.

2001). Après le rasage de la partie postérieure des pattes arrière et un lavage à la bétadine

rouge puis jaune de ces zones, une incision médiane de 3-4 cm est effectuée en partant du

tendon achilléen. L’aponévrose est ensuite incisée de la même façon. Après avoir bien séparé

le plantaris du soléaire et du gastrocnémien, ces deux derniers sont éliminés en faisant très

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attention à ne pas léser le plantaris. Le gastrocnémien étant bi-articulaire, seule la majeure

partie distale de ce muscle a été éliminée. Une attention importante est portée pour éviter de

détériorer le nerf du plantaris et les vaisseaux sanguins principaux. L’aponévrose et la peau

sont ensuite suturées plan par plan avant un nettoyage à la bétadine jaune. Les animaux sont

ensuite remis individuellement dans leur cage et surveillés avec attention jusqu’à leur réveil.

I.1.B. La régénération musculaire

Après une semaine dans l’animalerie périphérique du laboratoire et une période de 7

jours de pré-acclimatation en hypoxie ou normoxie (voir la partie « protocoles

expérimentaux »), les animaux sont anesthésiés comme précédemment et opérés le matin.

Après rasage de la partie latérale de la patte arrière gauche et un lavage à la bétadine rouge

puis jaune, la peau et l’aponévrose sont incisées séparément sur la partie antéro-latérale de la

patte. 200 µL de notexine (Latoxan, France) dilués dans une solution de NaCl à 0,9% (10

µg.mL

-1

) sont injectés lentement en deux injections (une vers chaque extrémité du muscle)

dans le soléaire gauche, après s’être assuré de l’avoir correctement isolé des autres muscles.

L’aiguille de la seringue est ensuite délicatement enlevée afin d’éviter que le myotoxique ne

s’échappe du muscle. La qualité des injections est contrôlée à partir du niveau de gonflement

du soléaire. L’aponévrose et la peau sont ensuite suturées séparément avant un lavage à la

bétadine jaune, puis les animaux remis en cage individuelle sont surveillés attentivement

jusqu’à leur réveil. Pour chaque animal, on obtient un muscle régénéré gauche (muscle Reg)

et un muscle intact droit qui sert de témoin (muscle Int).

I.2. L’exposition hypoxique

Les animaux répartis dans les groupes conditionnés en hypoxie (animaux H) sont

exposés à une hypoxie hypobare représentative d’une altitude simulée de 5500m (PB = 505

hPa ; PIO

2

= 105 hPa) (Figure 3.I.1). La température et l’hygrométrie à l’intérieur de la

chambre hypobare sont régulées et similaires à celles de l’animalerie. Tous les jours, la

chambre est ramenée en normobarie et ouverte durant environ 15 minutes pour permettre la

pesée des animaux et de la nourriture, l’approvisionnement en eau et en nourriture et le

changement de litière.

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Figure 3.I.1. La chambre hypobare.

I.3. Les protocoles expérimentaux

I.3.A. Hypertrophie de surcharge en hypoxie

Avant l’opération chirurgicale, les rats sont répartis en deux groupes expérimentaux :

- le groupe Ov (n = 62), constitué d’animaux dont le plantaris est soumis à une

surcharge fonctionnelle

- le groupe Ct (n = 54), composé de rates non opérées

Chacun de ces deux groupes est alors divisé en trois sous-groupes :

- d’animaux exposés en hypoxie (H). Les sous-groupes Ov-H (n = 21) et Ct-H (n =

18) sont alors constitués.

- d’animaux maintenus en normoxie et nourris ad libitum (N). Les sous-groupes

Ov-N (n = 20) et Ct-Ov-N (n = 18) sont alors constitués.

- d’animaux élevés en normoxie et soumis à une restriction alimentaire. Ces

animaux pair fed (PF) ingèrent la même quantité de nourriture journalière que la

quantité moyenne délivrée à leur groupe hypoxique correspondant (groupe Ov ou

Ct). C’est ainsi qu’on définit les sous-groupes Ov-PF (n = 21) et Ct-PF (n = 18).

L’exposition hypoxique et la restriction alimentaire sont intégrées dans la procédure

expérimentale trois jours après l’opération chirurgicale. Cette durée a été choisie afin de

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laisser une durée suffisante de récupération avant l’exposition au stress hypoxique et à la

restriction calorique. Les animaux sont sacrifiés 5, 12 et 56 jours après l’opération d’ablation

des muscles agonistes (n = 6 par groupe Ct et n=7-8 par groupe Ov). Les durées d’exposition

à l’hypoxie sont donc de 2, 9 et 53 jours. Ce protocole expérimental est résumé dans la figure

3.I.2.

J3 J5 J12 J56

Opération chirurgicale pour les groupes Ov

J0

Récupération post-opératoire

Prélèvement du plantaris (J5, J12 et J56) Prélèvement sanguin (J12 et J56)

Expositition en hypoxie ou en normoxie

Ov-H (n = 21) Ov-N (n = 20) Ov-PF (n = 21) Groupes Ov (n = 62) Ct-H (n = 18) Ct-N (n = 18) Ct-PF (n = 18) Groupes Ct (n = 54)

Figure 3.I.2. Protocole et groupes de l’expérimentation « Hypertrophie de surcharge en

hypoxie ».

I.3.B. Régénération musculaire en hypoxie

Afin de limiter le nombre de groupes expérimentaux, nous avons fait le choix

d’éliminer dans cette étude les groupes PF. L’intérêt principal de l’utilisation d’animaux PF

est de pouvoir en théorie dissocier les effets propres de l’hypoxie de ceux associés à

l’hypophagie d’altitude. En réalité, la réduction de la prise alimentaire et la perte de masse

corporelle sont maximales durant les 48-72 premières heures d’exposition hypoxique

(Daneshrad, et al. 2000). Les animaux H retrouvent ensuite progressivement une prise

alimentaire correcte mais néanmoins 20-25% inférieure à celle d’animaux N, tandis que la

courbe de la cinétique de la masse corporelle d’animaux H tend à évoluer de manière parallèle

à celle d’animaux N. Une pré-manipulation dans nos conditions expérimentales nous a permis

de vérifier que la prise alimentaire et le gain de masse corporelle devient tout à fait acceptable

après une semaine d’exposition hypoxique.

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Avant la période de pré-acclimatation, les rats sont divisés en deux groupes

expérimentaux :

- le groupe H (n = 40)

- le groupe N (n = 38)

Les animaux H sont ensuite maintenus dans la chambre hypobare durant 7 jours à

5500m alors que les animaux N sont laissés dans l’animalerie du laboratoire. Le matin du 8

ème

jour (J0), tous les animaux sont opérés. Seul le soléaire gauche des animaux est soumis à une

injection de notexine. Le soir de l’opération chirurgicale, les animaux sont remis dans leur

environnement respectif. Quatre sous-groupes de muscles sont alors définis :

- les muscles intacts exposés en H (groupe Int-H, n = 40)

- les muscles régénérés exposés en H (groupe Reg-H, n = 40)

- les muscles intacts exposés en N (groupe Int-N, n = 38)

- les muscles régénérés exposés en N (groupe Reg-H, n = 38)

Les animaux sont sacrifiés 3, 7, 14 et 28 jours après l’injection du myotoxique (n = 9-10

par groupe). La procédure expérimentale est résumée dans la figure 3.I.3.

J0 J7 J14 J28

Opération chirurgicale du soléaire gauche

J-7

Pré-acclimatation en hypoxie ou en normoxie Prélèvement du soléaire Prélèvement sanguin

Expositition en hypoxie ou en normoxie

Reg-H (n = 40) Reg-N (n = 38) Muscles Reg (n = 78)

J3

Int-H (n = 40) Int-N (n = 38) Muscles Int (n = 78)

Figure 3.I.3. Protocole et groupes de l’expérimentation «Régénération musculaire en

hypoxie ».

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I.3.C. Synthèse des méthodes expérimentales utilisées

Au cours de ces deux protocoles expérimentaux, de nombreuses analyses ont été

réalisées et sont résumées dans le tableau 3.I.1. Les méthodes utilisées, de nature

morphologique, exploitant des prélèvements sanguins, utilisant des outils de biochimie des

protéines, de mesures d’activités enzymatiques et de biologie moléculaire seront détaillées

dans la suite du manuscrit.

Tableau 3.I.1. Méthodes expérimentales mises en œuvre dans chaque étude.

Hypertrophie de surcharge en

hypoxie

Régénération musculaire en

hypoxie

x

x

x x

Masse musculaire

x x

Analyse histologique

x x

x x

Voie Akt-mTOR

x x

Facteurs atrophiants

x x

MRF (myogénine, MyoD)

x

p38 MAPK

x

Facteurs atrophiants

x x

MRF (myogénine)

x

TGF-β1

x

Phénotype musculaire

x x

Electrophorèse des MHC

x x

CS

x x

COX

x

LDH

x

Prélèvement sanguin

Expérimentation

Morphologie musculaire Western Blot RT-qPCR Activité enzymatique

Conditionnement

Analyses

Surcharge fonctionnelle

Régénération musculaire

Exposition hypoxique

MRF : facteurs de régulation myogénique ; TGF-β1 : Transforming Growth factor –β1 ; CS,

citrate synthase, COX, cytochrome c oxydase ; LDH : lactate déshydrogénase.

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