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Résumé de l’Article 2
Les figures et tables citées dans le résumé correspondent à celles de l’article 2.
Pour cette étude, nous avons ré-examiné les données de transcriptomique obtenues par RNA-sequencing publiées dans l’article 1, afin de mettre en évidence de nouveaux gènes impliqués dans la différenciation de la gonade femelle. Après l’application de critères stringents, prenant en compte le nombre de « reads » observés par contigs chez les femelles (10 reads minimum) ainsi que le « Fold change » observé entre femelles et mâles (>5), une liste de 44 gènes présentant une expression fortement dimorphique en faveur de l’ovaire fœtal a été obtenue (S1 Table).
Parmi eux, le gène DMXL2 a retenu notre attention (fold change F/M=6). Ce gène présente un pic d’expression dans l’ovaire de chèvre en différenciation, notamment avant l’entrée en méiose des cellules germinales, mais aussi au tout début de la formation des premiers follicules (S1 Figure).
Quand mes travaux ont commencé, très peu de choses étaient connues sur les rôles ou les fonctions biologiques de DMXL2. La protéine possède des domaines WD40 intervenant dans les interactions entre protéines, faisant d’elle une « protéine plateforme ». Elle a été mise en évidence grâce à des expériences de co-immunoprécipation dans le cerveau de rat où elle intervient dans l’exocytose des vésicules synaptiques via des interactions avec les enzymes régulant l’activité de la petite protéine G Rab3 (Nagano et al., 2002). Ce qui a surtout soulevé notre intérêt, c’est que DMXL2 était décrit comme un régulateur de la voie Notch, chez la drosophile (Yan et al., 2009), mais aussi dans des lignées cellulaires de mammifères (Sethi et al., 2010). Or, la voie de signalisation Notch est impliquée dans la formation des follicules primordiaux chez la souris (Trombly et al., 2009 ; Xu et Gridley, 2013 ; Chen et al., 2014 ; Vanorny et al., 2014). Un lien entre DMXL2 et la voie Notch n’avaient jamais été décrits dans les gonades de mammifères. Ainsi afin de déterminer son rôle dans l’ovaire, nous avons entrepris une étude fonctionnelle dans le modèle murin, en analysant le phénotype de souris invalidées pour Dmxl2 (KO).
L’invalidation de Dmxl2 s’est révélée être létale quelques heures après la naissance. Les souriceaux KO étaient plus faibles que les animaux contrôles de la portée et présentaient un estomac vide suggérant une incapacité à se nourrir. A partir de ce phénotype, mes travaux se sont orientés en deux axes : (i) analyser de façon globale l’expression de Dmxl2, de façon à comprendre les causes de la létalité et (ii) rechercher l’existence d’un phénotype gonadique, malgré un arrêt du développement à J0, jour de la naissance.
Page | 131 Concernant le premier axe, l’étude de l’expression tissulaire de Dmxl2 a mis en évidence une expression forte au niveau des muqueuses olfactives et ceci dès la vie fœtale (Figure 2). Le système olfactif étant impliqué dans la régulation de la prise alimentaire (Risser et Slotnick, 1987), nous avons testé sa fonctionnalité (Figure 3). Les résultats obtenus montrent que la muqueuse olfactive chez les souriceaux KO est fonctionnelle, mais que la transmission de l’information odorante depuis les muqueuses vers les bulbes olfactifs est altérée. DMXL2 joue donc un rôle dans l’olfaction, même si ce déficit ne peut à lui seul expliquer la létalité qui survient moins de 12 heures après la naissance. En effet, un déficit olfactif engendre la mort des souriceaux dans les 12 à 24h. Un défaut d’ordre plus général (trouble de l’homéostasie) est suspecté.
Concernant le rôle de Dmxl2 dans les gonades murines, nous avons analysé son expression au cours du développement normal, mettant en évidence quelques différences avec les observations réalisées chez la chèvre. Ainsi, avant l’entrée en méiose des cellules germinales chez la femelle, son expression est identique entre les gonades des deux sexes. Un dimorphisme en faveur de l’ovaire n’est observé qu’après 16.5 jpc et est maintenu jusqu’après la naissance. Néanmoins à partir de la puberté Dmxl2 voit son expression augmenter dans le testicule murin, ce qui n’a pas été observés dans l’espèce caprine (Figure 4 et S1 Figure). La localisation de sa protéine, montre que DMXL2 est exprimé à la fois dans les cellules germinales et dans les cellules de soutien des gonades mâles et femelles. L’augmentation de son expression en période périnatale chez la femelle laisse suspecter un rôle au cours de la folliculogenèse, période au cours de laquelle les communications entre cellules germinales et cellules de soutien sont essentielles.
Du fait de la létalité à J0, l’effet de l’invalidation de Dmxl2 n’a pu être étudié qu’à ce stade. Bien qu’aucune anomalie morphologique n’ait été observée dans les testicules ou ovaires Dmxl2 KO, l’analyse moléculaire réalisée met en évidence que plusieurs gènes présentent une dérégulation de leur expression dans l’ovaire mutant (Figure 5). Ces gènes sont impliqués dans la régulation de processus tels que la réponse au stress, la régulation de l’apoptose ou le transport transmembranaire. Les gènes effecteurs de la voie Notch ne sont pas touchés par l’absence de DMXL2, ce qui tend à montrer que cette voie n’est pas perturbée. Quelques gènes codant pour d’autres protéines WD40 sont néanmoins surexprimés dans les ovaires KO, ce qui pourrait compenser l’absence de DMXL2. De plus, le gène Aph1b qui code pour une sous unité de la -sécrétase régulant la voie Notch est surexprimé dans les gonades KO des deux sexes. Cette surexpression, pourrait permettre d’augmenter la stabilisation de cette protéine et le maintien de la signalisation Notch, au moins à ce stade. Afin de pouvoir observer la mise en place de la folliculogenèse dans les ovaires Dmxl2 KO, leur développement a été poursuivi quelques jours supplémentaires, grâce à des greffes sur des souris immuno-déficientes. Ainsi, nous avons pu
Page | 132 observer une altération de la croissance et de la survie folliculaire dans les ovaires Dmxl2 KO, par rapport aux ovaires contrôles greffés au même stade.
Les résultats obtenus font de DMXL2 un nouveau facteur à prendre en compte dans la fertilité femelle. Ces résultats, ainsi que l’étude du rôle de Dmxl2 au sein du testicule seront analysés plus profondément grâce à la réalisation de l’invalidation conditionnelle de Dmxl2 dans les cellules de soutien et/ou les cellules germinales (travaux en cours au laboratoire).