œstrogènes
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OGE
Page | 88 intéressante, il a été noté que les femelles hétérozygotes étaient plus prolifiques que les femelles sauvages (Soller et Kempenich, 1964), et que cet effet était retrouvé chez quelques mâles XY homozygotes mutants fertiles (Ricordeau et al., 1969). Au début des années 1990, suite à la découverte et à la caractérisation du TDF, deux équipes montrent que l’inversion sexuelle chez la chèvre n’est pas due à une translocation de SRY ou d’un quelconque autre matériel du chr Y (Just et
al., 1994 ; Pailhoux et al., 1994). Le développement de la biologie moléculaire a finalement permis de caractériser la mutation (Vaiman et al., 1996 ; Vaiman et al., 1999 ; Schibler et al., 2000 ;
Pailhoux et al., 2001), qui a été renommée PIS pour Polled Intersex Syndrome. A la fin des années 1990, la mutation PIS est identifiée sur le bras long du chr. 1 caprin (1q43) grâce à l’utilisation de marqueurs microsatellites (Vaiman et al., 1996). Le locus est conservé chez l’Homme où des mutations hétérozygotes sont impliquées dans le syndrome BPES (Chap4_II) (Vaiman et al., 1999 ;
Schibler et al., 2000). Grâce à des comparaisons de séquences entre animaux PIS+/+ et PIS-/-, la mutation est caractérisée en 2001. Elle correspond à la délétion d’une région non codante de 11.7 kb (Pailhoux et al., 2001) qui induit le silence transcriptionnel de FOXL2 dans les gonades XX mutantes.
B2. Chronologie de l’inversion sexuelle chez les chèvres XX PIS-/-
Dans l’espèce caprine, la gestation dure 150 jours. La différenciation des crêtes génitales démarre à partir de 25 jpc, et les cellules germinales primordiales les colonisent entre 25 et 30 jpc (Figure 24).
Chez le mâle, la différenciation des cellules de Sertoli a lieu vers 34 jpc. Les cordons séminifères sont visibles dès 36 jpc. Les cellules de Leydig apparaissent entre les cordons séminifères et produisent de la testostérone à partir de 40 jpc. La masculinisation des organes génitaux externes à lieu quelques jours plus tard, puis l’AMH produite par les cellules de Sertoli induit la régression des canaux de Müller à partir de 46 jpc. La différenciation des canaux de Wolff est plus tardive ; les vésicules séminales et la prostate sont visibles à partir de 56 jpc, les épididymes et les canaux déférents à partir de 70 jpc (Pailhoux et al., 2002).
Chez la femelle, l’ovaire possède une organisation en cortex/médulla dès 36 jpc. A ce stade, les cellules germinales sont concentrées au niveau du cortex ovarien et prolifèrent activement. La médulla est marquée par la présence de cellules stéroïdogènes positives pour CYP19 et responsables d’une production d’œstrogènes pendant la vie fœtale, avant même l’entrée en méiose des cellules germinales XX (Pailhoux et al., 2002 ; Pannetier et al., 2006b). Les cellules germinales entrent en méiose à partir de 55 jpc, et les premiers follicules sont observables à 80 jpc (Pailhoux
Figure 25 : Le locus PIS.
Le locus Polled Intersex Syndrome (PIS) est localisé sur le bras long du chromosome 1 caprin (Chi 1q42). La région PIS (en rouge) ne contient pas de séquence codante, mais est elle régule l’expression de 4 gènes situés à distance : 3 ARN non-codants longs (lncRNA, « long non-coding RNA ») et FOXL2. Dans des conditions physiologiques, l’expression des 4 gènes est spécifique de l’ovaire. Lorsque la région PIS est délétée, l’expression des 4 gènes du locus est abolie dans les gonades XX.Ovaire Testicule
+++
PIS
+/+ Gonade XX-
PIS
-/- FOXL2 facteur de transcription PFOXic lncRNA PISRT1 lncRNA PISRT2 lncRNAPIS
Chi 1q42
Telomere → ← Centromere-
+++
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-
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-
30 kb 300 kbPage | 89 La différenciation de la gonade XX PIS-/- en testiculea été étudiée par notre laboratoire au niveau morphologique (histologie) et moléculaire (RT-PCR semi-quantitative) (Pailhoux et al., 2002). A 36 jpc, les gonades XX PIS-/- ne présentent pas de différence morphologique avec des ovaires XX contrôles, cependant au niveau moléculaire, l’expression de CYP19 est effondrée. Les premiers signes de masculinisation apparaissent à 40 jpc au niveau histologique avec la réduction du cortex ovarien, la formation des cordons séminifères et celle de la tunique albuginée, et au niveau moléculaire avec la surexpression de SOX9 et d’AMH. La masculinisation de la gonade XX PIS-/- accuse ainsi un retard d’environ 4 jours par rapport à un testicule XY contrôle. Par la suite, le développement de la gonade XX PIS-/- suit la même chronologie qu’un testicule témoin. Le nombre de cellules germinales diminue entre 56 et 70 jpc, puis elles disparaissent progressivement jusqu’à la naissance.
Il est à noter que la masculinisation du sexe externe des animaux XX PIS-/- est variable, « partielle » dans 50% des cas (Pailhoux et al., 2002). Les animaux présentant des ambiguïtés de l’appareil génital externe sont hermaphrodites au niveau gonadique : le tissu testiculaire est retrouvé au centre et constitue la plus grande partie de la gonade, et un peu de tissu ovarien est retrouvé au niveau cortical. Chez ces animaux, le degré de masculinisation des gonades influence le degré de masculinisation des organes génitaux.
B3. La mutation PIS
La mutation PIS a été caractérisée par notre laboratoire en 2001. Il s’agit d’une délétion d’une région de 11.7 kb appelée région PIS. Cette région est nécessaire à la régulation d’au moins 4 gènes situés à distance (Figure 25), dont l’expression est sexuellement dimorphique en faveur de l’ovaire au début de la différenciation gonadique (34-36 jpc). La mutation induit l’extinction de ces quatre gènes dans les gonades XX PIS-/-, alors qu’ils sont surexprimés dans les bourgeons de cornes dès l’hétérozygotie (Pailhoux et al., 2001). Parmi ces gènes, FOXL2 (Forkhead box L2) situé à environ 300 kb de la région PIS, code pour un facteur de transcription. Les autres, PISRT1 (PIS
regulated transcript 1), PISRT2 (PIS regulated transcript 2) et PFOXic (Promoter FOXL2 inverse complementary), sont des ARN non-codants longs. Les quatre gènes étant éteints dans les gonades
XX PIS-/-.
Plusieurs études menées par le laboratoire ont cherché à déterminer le rôle de chacun de ces gènes dans l’inversion sexuelle chez la chèvre. Les résultats obtenus (i) suggèrent que les ARN non-codants longs sont impliqués dans la régulation de FOXL2, et (ii) démontrent que c’est le silence transcriptionnel de FOXL2 qui est à l’origine de l’inversion sexuelle caprine.
Page | 90 B3-1. Rôle régulateur des ARN non-codants longs
- PFOXic
Le gène PFOXic a été mis en évidence alors que le laboratoire étudiait la régulation proximale de l’expression de FOXL2. Des expériences menées in vitro montrent que FOXL2 est transcrit à partir d’un promoteur bidirectionnel, conduisant à l’expression de FOXL2 dans un sens (5’-3’) et à celle de PFOXic dans l’autre sens (3’-5’) (Pannetier et al., 2005). La caractérisation de ce gène à montré qu’il était constitué de 5 exons, aboutissant à la transcription d’un ARN de 1.8 kb. Bien qu’une phase codante ait été détectée grâce à des logiciels de prédiction, la protéine putative ne présente aucune similitude avec une protéine connue et n’est pas conservée chez d’autres espèces comme l’Homme, alors qu’une activité transcriptionnelle est observée dans cette même région. Pour ces raisons, PFOXic est considéré comme un ARN non-codant long (ARNnc long).
L’étude des niveaux d’expression de ces deux gènes suggère que le promoteur bidirectionnel agit comme un « déversoir transcriptionnel », capable d’orienter la transcription vers PFOXic lorsque FOXL2 atteint un certain seuil. Une abondante littérature décrit l’existence de tels promoteurs bidirectionnels, permettant la transcription d’un gène codant d’un côté, et la transcription d’un ARN non-codant long de l’autre. Cette stratégie de régulation permettrait de créer localement un réservoir d’ARN polymérase II ou bien de générer une barrière physique contre la propagation de chromatine répressive. Ceci permet de conserver le promoteur dans une configuration active, afin de limiter les variations d’expression du gène codant d’intérêt (Wei et al., 2011). Ainsi, l’expression de PFOXic permettrait de contrôler un niveau optimal d’expression de
FOXL2 dans ses cellules cibles.
- les PISRT
PISRT1 est situé à 30 kb de la région PIS. PISRT1 est mono-exonique et sa transcription
donne naissance à un ARN non-codant long de 1.5 kb. Afin de tester son potentiel d’action en trans et son implication dans l’inversion sexuelle, la transgénèse additive de PISRT1 a été réalisée chez des animaux XX PIS-/- (Boulanger et al., 2008). La surexpression de PISRT1 ne change pas le phénotype d’inversion sexuelle, les gènes du locus PIS restent éteints, et la surexpression de SOX9 et d’AMH n’est pas décalée. Ainsi PISRT1 n’apparaît pas jouer de rôle en trans, mais pourrait plutôt jouer un rôle au niveau local dans l’ouverture chromatinienne du locus PIS.
Plus récemment, le laboratoire a pu mettre en évidence l’existence d’une activité transcriptionnelle sur une région d’environ 100 kb en amont de PISRT1. Ce très long transcrit non codant, appelé PISRT2 est exprimé à partir du même promoteur que PISRT1, qui s’avère être bidirectionnel (Pannetier et al. 2012 et données non publiées). Deux hypothèses sont possibles, soit (i) PISRT1 et PISRT2 sont impliqués dans l’ouverture et le maintien de la structure chromatinienne, soit (ii) leur expression signe l’importance de la région du promoteur