Page | 119 dire pour rendre la chromatine plus accessible aux différents traitements, j’ai ajouté une étape de lyse tissulaire et de préparation de noyaux. De cette façon, en éliminant les débris cellulaires et fibreux, j’ai réussi à concentrer ma préparation en contenus nucléaires favorisant ainsi l’étape de fragmentation.
- une étape de fixation supplémentaire : dans le protocole classique, la chromatine est fixée avec du formaldéhyde 1%. Ce fixateur permet de fixer ensemble des molécules dans un rayon de 2 Å, c’est-à-dire des molécules interagissant directement l’une avec l’autre. Au fur et à mesure de mes différents essais, je me suis rendue compte que j’avais des résultats cohérents en utilisant un anticorps dirigé contre des variants d’histones (type anti-H3K9acétylé), mais que l’utilisation d’anticorps dirigés contre des facteurs de transcription (anti-RNA Pol II ou anti-FOXL2) donnait toujours un résultat négatif, c’est-à-dire sans enrichissement. Les facteurs de transcription ont des interactions avec l’ADN qui sont plus labiles que celles des histones, puisque ces dernières sont imbriquées dans l’ADN. Certains protocoles développés pour l’étude des modifications d’histones omettent même l’étape de fixation. Ces observations m’ont amenée à ajouter une étape de fixation supplémentaire en utilisant le DTBP (Dimethyl dithiobispropionimidate), un fixateur ayant un rayon de fixation plus grand (11.9 Å) et permettant de capter des interactions plus labiles voire indirectes.
Pour valider mon protocole, j’ai utilisé différents types de contrôles :
- un point d’IP en utilisant un anticorps anti-H3K9ac comme contrôle positif de l’expérience. L’acétylation de la lysine 9 de l’histone H3 est une marque enrichie au niveau des régions promotrices du génome, qui signe une chromatine permissive à la transcription.
- un point d’IP en utilisant un anticorps anti-ARN Pol II-Ser5P (ARN polymérase II phosphorylée sur la sérine 5) comme autre contrôle positif. L’ARN-Pol II-Ser5P est un facteur de transcription préférentiellement retrouvé en 5’ des loci transcrits (Phatnani et al., 2006). L’utilisation de cet anticorps me permettait donc d’étudier les promoteurs actifs.
- un point d’IP en utilisant un anticorps anti-IgG de poulet comme contrôle négatif afin de donner le niveau de bruit de fond de l’expérience.
En parallèle des points d’IP contrôles, deux points d’IP d’intérêt ont été réalisés grâce à deux anticorps dirigés contre la partie C-term de FOXL2. L’efficacité en ChIP du premier (Cocquet
et al., 2002) avait déjà été démontrée dans la littérature (Benayoun et al., 2008 ; Georges et al., 2014 ; Pannetier et al., 2006) mais il nous en restait très peu au laboratoire . Le second a été obtenu plus récemment. Il s’agit d’un anticorps polyclonal dirigé contre la même séquence peptidique que le premier anticorps (Boulanger et al., 2014).
Figure 40 : Un exemple de résultats de ChIP réalisé à partir d’ovaires caprins.
A gauche, le dépôt sur gel montre la fragmentation de la chromatine, la plupart des fragments ayant une taille comprise entre 100 et 1000 pb. A droite, le graphique montre les résultats obtenus sur cette expérience ; il est représentatif des autres essais. 50 µg de chromatine ont été mis en présence de l’anticorps H3K9ac, RNA Pol II, FOXL2 (celui développé par le laboratoire), ou anti-IgG de poulet (bruit de fond). Pour chaque type d’IP, différentes séquences sont testées (pFOXL2, TESCO, HPRT1). Le pourcentage d’IP est obtenu en soustrayant le bruit de fond obtenu avec l’anticorps anti-IgG de poulet au signal obtenu avec l’anticorps d’intérêt (H3K9ac, RNA Pol II, FOXL2) et le résultats est rapporté à l’INPUT (l’INPUT correspond à la chromatine de départ). Les résultats montrent que l’IP fonctionne avec l’anticorps anti-H3K9ac, puisqu’un enrichissement de la marque est obtenu au niveau du promoteur de FOXL2 qui est actif, mais pas au niveau de la région TESCO puisque SOX9 n’est pas exprimé, ou dans le corps du gène HPRT1. En revanche pour les facteurs de transcription, l’IP ne fonctionne pas, et quelle que soit la séquence testée, les taux d’IP sont similaires. Notamment avec l’anticorps anti-FOXL2, quelle que soit la nature de la séquence (contrôle positif ou négatif), le taux d’IP est le même.1500 1000
500 % IP
Ovaire caprin – 50 µg chromatine/IP
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
H3K9ac RNA Pol II FOXL2
pFOXL2 TESCO HPRT1
Page | 120 Différentes séquences étaient par ailleurs testées sur les résultats du ChIP en plus des points d’IP contrôles :
- une séquence dans le promoteur caprin de FOXL2 comme contrôle positif. Les amorces ont été dessinées de part et d’autre de deux sites FLRE qui ont été démontrées comme activant l’expression de FOXL2 in vitro (Benayoun et al., 2008).
- une séquence dans la région équivalente à l’élément TESCO murin chez les bovidés qui possède un site FOX consensus et un élément de réponse aux récepteurs aux œstrogènes.
- une séquence à l’intérieur du gène ACTIN B, HPRT1 ou GAPDH comme contrôle négatif. Ces séquences ne sont normalement pas ciblées par FOXL2.
- plusieurs séquences du promoteur de DMRT1 désignées en fonction de la présence de sites FLRE ou FOX consensus dans les zones contraintes, en fonction des résultats obtenus sur les séquences contrôles.
B1-2. Identification des causes possibles de l’échec de l’expérience
Malgré les différentes mises au point du protocole, les résultats obtenus ont toujours été similaires (Figure 40) : de faibles taux d’IP et des taux d’IP identiques quelle que soit la séquence testée. Aujourd’hui, à la lumière des résultats obtenus, trois causes sont possiblement à l’origine de l’échec de la technique :
- des conditions délétères de sonication. Au cours de la sonication, des ultra-sons viennent bombarder les molécules et les fragmentent. Ce processus libère une quantité de chaleur importante susceptible de dénaturer les protéines et leurs interactions, voire leur reconnaissance par l’anticorps. La sonication a été réalisée sur le sonicateur Covaris S220, dans une chambre d’eau maintenue à 4°C, les différents paramètres (durée, intensité de sonication... etc.) ayant été réglés afin d’obtenir une taille de fragments optimale (100-1000 pb). J’ai donc testé différents cycles de sonication (intensité forte sur temps court ou intensité douce sur temps plus longs) afin d’évaluer le risque de surchauffe et de dénaturation de l’échantillon, mais je n’ai pas observé d’amélioration des taux d’IP pour des cycles plus « doux ». La chambre de réfrigération semble donc être efficace, mais ceci n’exclue pas que les paramètres utilisés soient tout de même délétères.
- une mauvaise conservation des ovaires avant leur congélation. Je récupérais les ovaires à l’abattoir et les conservais dans du sérum physiologique jusqu’au laboratoire, où je les disséquais pour ne garder que les morceaux de cortex qui étaient ensuite congelés. Il est possible d’imaginer que le temps écoulé entre les ponctions réalisées sur les ovaires de l’animal après sa mort, la dissection réalisée par mes soins et la congélation des morceaux de cortex soit à l’origine de détériorations dans les interactions protéines-ADN. L’idéal aurait été de pouvoir fixer
Figure 41 : Etude de la sous-expression de FOXL2 dans des cellules de la granulosa
caprines mises en culture.
Des cellules de la granulosa caprines ont été infectées avec des lentivirus contenant des siRNA dirigés contre FOXL2 (siRNA) ou bien un siRNA ne reconnaissant aucune séquence mammalienne (CTRL), à deux concentrations différentes : 5 ou 10 molécules lentivirales par cellule de la granulosa. Les cellules infectées sont sélectionnées à la puromycine car les lentivirus apportent un gène de résistance à cet antibiotique. Après 72 heures de sélection, les cellules sont fixées, les ARN extraits pour faire des ADNc. Les résultats montrent peu de variation de l’expression de FOXL2 entre les conditions CTRL et siRNA et une surexpression de SOX9 importante dès la condition contrôle. La surexpression de SOX9 signe une dédifférenciation des cellules de la granulosa due aux conditions de culture et qui masque l’effet de l’infection sur FOXL2 et les autres gènes étudiés. Les niveaux d’expression des gènes d’intérêt sont rapportés à ceux de trois gènes de références : ACTB, YWHAZ et H2AFZ.R
ela
ti
ve
expr
essi
on
Page | 121 convenablement la chromatine dès la récupération des ovaires, en abatant des chèvres uniquement pour cette expérience.
- une mauvaise fixation de la chromatine, une fixation trop faible ou trop forte pouvant entrainer soit une altération des interactions protéines-ADN, soit un défaut de reconnaissance de la protéine d’intérêt par l’anticorps.
Pour conclure, chaque étape de cette technique est cruciale et peut-être décisive à son succès. Alors que je termine ma thèse, je n’ai pas réussi à déterminer précisément quelle(s) étape(s) posai(en)t problème(s). Si j’avais du temps, je réessaierais le protocole en partant de tissu frais, d’un tissu plus précoce où la fixation serait moins difficile, ou bien de cellules de la granulosa caprines.
B2. Effet de la sur- ou sous-expression de FOXL2 sur l’expression de DMRT1 B2-1. Effet de la sous-expression de FOXL2
Nous avons voulu sous-exprimer FOXL2 dans des cultures primaires de cellules de la granulosa caprines pour voir si cela entrainait la surexpression de DMRT1. Pour cela comme pour le ChIP, nous avons récupéré des ovaires de chèvres qui entraient dans un protocole de ponction ovarienne. Pour la culture des cellules de la granulosa, nous avons utilisé un protocole mis au point chez la brebis (Fabre et al., 2003). Ainsi, les petits follicules à antrum (Ø < 3 mm) ont été isolés et disséqués sous loupe binoculaire afin de mettre en culture les cellules de la granulosa. Le lendemain, elles ont été infectées avec un mélange en quantités équivalentes de deux lentivirus contenant un ARN interférent (siRNA) dirigé contre FOXL2 (SIGMA, SHCLNV-NM_012020/TRCN0000086503/505) ou un lentivirus contrôle, contenant un siRNA ne reconnaissant aucun gène mammalien (SIGMA, SHC002V). Les cellules infectées ont pu être sélectionnées grâce à l’ajout d’un antibiotique, et ont été récoltées et fixées 72h après sélection. Outre l’observation que les siRNA ne soient finalement pas efficaces, les résultats obtenus montrent que les cellules de la granulosa se dédifférencient dès les conditions contrôles (Figure 41) : elles surexpriment le gène SOX9 par rapport à des expressions de FOXL2 et CYP19 faibles.
Ainsi, dans des conditions où SOX9 est surexprimé même dans les conditions contrôles, l’étude de l’évolution de l’expression de DMRT1 en regard de celle FOXL2 était impossible. Il apparait donc que les conditions de cultures nécessitaient plus de mises au point afin de maintenir l’expression des gènes de la voie femelle.