Variabilité interindividuelle de la radiosensibilité des CAH après irradiation en RX (bas TEL) :

L’utilisation des cellules primaires en biologie et plus particulièrement en radiobiologie pose la question de la variabilité interindividuelle en raison de plusieurs facteurs comme l’âge, le sexe ou encore le fond génétique du donneur. Au moment de sélectionner les donneurs, nous avons fait en sorte de choisir des profils comparables (même âge, même sexe, même origine ethnique). Nous avons ensuite souhaité évaluer la radiosensibilité des deux donneurs de CAH après irradiation en RX (bas TEL), plus faciles d’accès.

Dans un premier temps, nous avons évalué le PE et le temps de doublement de ces deux donneurs de CAH en culture physioxique 2D (Figure 41). Au bout de 12 jours de culture, le nombre de clones de plus de 50 cellules formés était, respectivement, de 26,6% ± 2,0% et 47,2% ± 2,0% pour le 1er et le 2ème donneur de CAH (Tableau 10). Le PE est donc siginificativement supérieur pour le 2ème donneur de CAH en culture physioxie (Figure 41.A). Par ailleurs, le temps de doublement a été évalué à ~ 70h et ~ 29h pour le 1er et le 2ème donneur de CAH, respectivement, en culture physioxique 2D (Figure 41.B). Les deux donneurs, bien que de physiologies comparables, ont montré des temps de doublement cellulaire différents qui peuvent expliquer la différence observée dans la valeur de PE (Figure 41.A). Après analyse de la distribution du cycle cellulaire en cytométrie en flux (marquage à IP et à l’EdU), il semblerait que cette divergence ne soit pas due à une vitesse de prolifération différente (phase du cycle G1, S, G2 et M) mais plutôt à une phase G0 plus longue dans le cas

du premier donneur.

Figure 41: Etude de la prolifération des CAH (D1, D2) en culture 2D physioxique

A : Analyse du nombre de colonies de plus de 50 cellules (PE %). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± erreur sur la

moyenne de trois (CAH D1) à quatre (CAH D2) expériences (test t non apparié, **** p< 0,0001). B : Temps de doublement des CAH (D1 et D2) en physioxie.

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Dans un second temps, nous avons souhaité savoir si cette différence de prolifération impactait la survie des deux donneurs de CAH suite à une irradiation en RX (bas TEL) en culture 2D physioxique. La Figure 42 présente le résultat de ces courbes de survie et le Tableau 10 résume les caractéristiques de ces courbes.

Figure 42: Courbes de survie des CAH (D1, D2) post-irradiation (bas TEL) en culture 2D physioxique

Les CAH (1er en trait plein et 2ème donneur en trait discontinu) ont été irradiés avec les doses indiquées de RX (bas TEL) en physioxie. Les courbes représentent les fractions survivantes de cellules obtenues selon le modèle linéaire quadratique. Les résultats sont représentés en moyenne ± erreur type sur la moyenne de trois à quatre expériences.

En culture physioxique 2D, les coefficients de corrélation R2 pour les deux donneurs nous ont semblé faibles (0,743 pour D1 et 0,723 pour D2) en comparaison à la lignée SW1353 (0,900, Tableau 9). Le composant α est supérieur pour le 1er donneur (0,729 ± 0,426 Gy-1) par rapport au 2ème donneur (0,542 ± 0,023 Gy-1). Les valeurs D10, D37 et FS2 sont de 2,3 Gy, 1,1 Gy et 14% pour le 1

er

donneur et 4,1 Gy, 1,8 Gy et 33,3 % pour le 2ème donneur (Tableau 10). De ce fait, le 2ème donneur de CAH est relativement plus radiorésistant que le 1er donneur en culture physioxique 2D.

CAH N PE (%) α (Gy-1) β (Gy-2) R2 D10 (Gy) D37 (Gy) FS2 (%)

Donneur 1 3 26,6 ± 2,0 0,729 ± 0,426 0,126 ± 0,115 0,743 2,3 1,1 14,0 Donneur 2 4 47,2 ± 2,0 0,542 ± 0,118 0,004 ± 0,023 0,723 4,1 1,8 33,3

Tableau 10: Caractéristiques des courbes de survie des CAH (D1, D2) post-irradiation (bas TEL) en culture 2D physioxique

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Dans le but d’analyser plus en détails cet effet différentiel entre donneurs de CAH en culture physioxique 2D, nous avons repris les mêmes plaques de culture utilisées pour la clonogénicité et évalué la distribution de taille de colonies comme décrit un peu plus haut. Le résultat de cette analyse après une irradiation avec une dose unique de 2 Gy (RX) est représenté en Figure 43. Dans le groupe contrôle, le pourcentage de colonies formées de plus de 100 cellules était, respectivement, d’environ 37% et 60% pour le 1er et le 2ème donneur. Une dose unique de 2 Gy (RX) a réduit cette proportion à environ 2% et 23% pour le 1er et le 2ème donneur, respectivement. De ce fait, les clones formés par le 2ème donneur sont significativement plus grands que ceux formés par le 1er donneur, ce qui peut être relié au temps de doublement deux fois plus grand pour le D2 (Figure 41.B) et qui explique les valeurs de PE observées plus haut (Figure 41.A). Cet avantage prolifératif semble être maintenu après une dose unique de 2 Gy (RX) ce qui explique la relative radiorésistance observée au niveau des courbes de survie (Figure 42).

Figure 43: Analyse de la distribution de taille de colonies des CAH (D1, D2) post-irradiation (bas TEL, 2 Gy) en culture 2D physioxique

Les cellules irradiées en physioxie sont remises en culture à faible densité, pendant 12 jours et sont ensuite fixées et colorées au crystal violet. Le nombre de cellules par colonie est déterminé et ce pour au moins 350 colonies par condition. Les résultats correspondant à 3 à 4 expériences sont regroupés et représentés comme le pourcentage de colonies composées d’au moins n cellules.

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3) Discussion :

La faible tension d’oxygène est souvent liée à la radiorésistance via des mécanismes de réparation des lésions de l’ADN. Elle est également associée à une plus faible production de ROS. Ces derniers sont impliqués dans l’accélération du processus de sénescence réplicative. La plus forte production de ROS associée à la normoxie (20% d’O2) pourrait être responsable d’une plus forte induction de sénescence réplicative en comparaison à la physioxie. Ceci peut expliquer la taille supérieure des clones en physioxie en comparaison à la physioxie et ce pour les deux types cellulaires (voir PE). Cependant, cet effet est plus marqué avec les CAH (D1), en comparaison à la lignée immortalisée SW1353, probablement car les chondrocytes normaux sont plus sensibles à la sénescence réplicative (Musumeci et al., 2015). Par ailleurs, nous avons démontré que la physioxie à 2% d’O2 confère une relative radiorésistance aux cellules comparée à la normoxie (distribution de

taille de colonies), bien que cette différence soit moins marquée en comptant uniquement les clones supérieurs à 50 cellules (courbes de survie). Ces résultats remettent en cause la limite de 50 cellules que la plupart des laboratoires utilisent afin de déterminer les courbes de survie. De plus, ils posent la question de la pertinence de l’utilisation d’incubateurs à air dans la plupart des laboratoires de radiobiologie.

Concernant les deux donneurs de CAH, le temps de doublement supérieur du D2 en comparaison au D1 pourrait être expliqué par la zone du cartilage articulaire dont sont issues ces cellules. De plus, le temps de doublement ne peut pas expliquer seul la relative radiosensibilité du D1 comparé au D2. En effet, nous avons vu dans l’introduction (voir page 48) que la tension d’oxygène pouvait varier d’1% à 10% dans les différentes zones du cartilage articulaire mature. Il est ainsi possible que les chondrocytes du D1 proviennent d’une zone du cartilage à plus forte tension d’oxygène et donc que ces cellules soient moins habituées à une physioxie à 2%. De même, les chondrocytes du D2 provient peut être d’une zone moins riche en oxygène et possèdent donc des mécanismes de réparation des CDBs plus performants. Malgré le choix de donneurs d’âges, de sexes et d’origine ethnique comparable, cette observation montre certainement l’importance de la zone du cartilage dont sont issus les CAH.

Enfin, en culture physioxique 2D, nous noterons que la lignée de CHS SW1353 reste plus radio-résistante aux RX que les deux donneurs de CAH avec une D10 à 6,2 Gy (2,3 Gy pour le D1 et 4,1 Gy pour le D2).

Les résultats obtenus ont permis de valider la culture physioxique en flasque 2D comme contrôle interne du modèle 3D de cartilage humain. Etant donné le temps de doublement plus rapide du 2ème donneur, nous avons décidé de continuer les expériences 3D avec ce donneur (voir chapitre II).

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