Fraction de cellules survivantes après une irradiation à 2 Gy

EBR Efficacité biologique relative d’un RI par rapport aux RX D10 (ou D37) RX

D10 ou (D37) ions accélérés

PE Nombre de clones formés dans l’échantillon contrôle (%)

Tableau 6: Paramètres déterminés à partir des courbes de survie

A noter également que la série 1000 cellules/puits sert uniquement si le PE n’est pas suffisant pour la condition 100 cellules/puits.

En utilisant les mêmes plaques 6 puits résultant des expériences de clonogénicité, nous avons également évalué la distribution de taille de colonies après irradiation (Saintigny et al., 2002). Pour ce faire, toutes les colonies (pas uniquement celles > 50 cellules) sont comptabilisées. Cependant, les clones de plus de 100 cellules (désignés comme > 100 cellules) ont été comptabilisés dans une seule classe d’évènements, dû à des limitations humaines. Les résultats sont ensuite organisés en classes basées sur le nombre de cellules composant une colonie (formée de n cellules). Dans ce manuscrit, nous avons exprimé cette distribution de deux manières :

 Pourcentage cumulé (ordonnées) de colonies formées au moins de n cellules (abscisse)

 Pourcentage (ordonnée) de colonies formées de n cellules (abscisse), n étant compris entre 1-20 cellules, 20-100 cellules ou plus de 100 cellules

Un minimum de 300 colonies/RI sur l’ensemble des expériences a été compté (jusqu’à 1000 colonies pour le contrôle) afin d’assurer une statistique robuste.

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4) Analyse du cycle cellulaire (IP et EdU) :

La répartition des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire a été déterminée en 2D par cytométrie en flux. Pour ce faire, deux marquages fluorescents : l’iodure de propidium (IP) et/ou l’EdU, ont été utilisés.

L’IP est un agent intercalant qui se fixe de manière stœchiométrique aux acides nucléiques (ADN et ARN) sans spécificité de séquence. Sa longueur d’onde d’émission (maximum) est de 617 nm. En fonction de leur marquage à l’IP (donc de la quantité d’ADN que contient la cellule), les cellules sont classées en 3 populations : phase G0/G1 (2N), phase S (entre 2N et 4N) et phase G2/M (4N).

L’EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine, #C10424, Invitrogen) est un analogue de la thymidine qui permet une mesure directe de la prolifération cellulaire. Il est incorporé à l’ADN pendant la phase active de la synthèse d’ADN (phase S). La détection de l’EdU est basé sur une réaction d’addition dite « click réaction » : un azide (contentant le fluorochrome Alexa Fluor® 647) réagit avec un alcyne (porté par l’EdU) en présence de cuivre (Cu I) pour former un noyau triazole stable (Figure 25). Ce réactif est une bonne alternative au BrdU (5- bromo-2’-deoxyuridine) car il ne nécessite pas d’étape de dénaturation de l’ADN (à l’acide chlorhydrique, à la chaleur ou digestion à l’ADNase) indispensable à la détection du BrdU par un anticorps spécifique.

Figure 25: Réaction d'addition (click-it) entre EdU et un azide-fluorochrome

Suite à l’irradiation (RX ou ions lourds), les flasques sont rapportées en salle de culture. Les cellules sont ensuite détachées par traitement à l’accutase et suspendues à nouveau dans du milieu de croissance B. L’ensemble des flasques irradiées à la même dose sont mélangées (pool) pour former une suspension cellulaire qui sera ensemencée à nouveau dans de nouvelles flasques plus grande. Si l’irradiation est réalisée en flasque de 12,5 cm2, la remise en culture se fait en flasque de 25 cm2. Cette étape de ré-ensemencement a

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permis d’étudier la reprise du cycle cellulaire après irradiation à confluence (CAH) ou sub-confluence (SW1353). Les flasques sont remises en culture physioxique pour le début de la cinétique et retirées de l’incubateur entre 6h et 96h post-traitement. Dans le cas particulier du marquage à l’EdU (solution stock à 10 mM), le réactif est ajouté au milieu de culture avant le point de cinétique afin qu’il soit incorporé pendant la synthèse d’ADN. La concentration nécessaire d’EdU ainsi que le temps de contact avec les cellules a fait l’objet d’une mise au point : 2h de contact d’EdU à 100 µM (final) ont été nécessaires afin que le marquage soit optimal pour les CAH et SW1353. Les cellules sont ensuite détachées, centrifugées à 800 tpm (tour par minute) pendant 5 min. Le culot cellulaire est lavé une fois au PBS puis fixé à l’éthanol 75° et conservé à 4°C en attendant l’analyse par cytométrie en flux. Le protocole donné par le fournisseur comprenait à l’origine une fixation au PFA (ParaFormAldéhyde) mais ce réactif empêchant un bon marquage à l’IP, nous l’avons remplacé par de l’éthanol 75°.

Après collecte de l’ensemble des échantillons d’une cinétique, l’analyse de déroule comme suit :

Figure 26: Protocole de marquage à l'EdU et/ou à l'IP pour analyse du cycle cellulaire

* le mix de réaction click-iT préparé extemporanément contient du PBS, CuSO4, Alexa Fluor 647 azide et un tampon (#C10424, Invitrogen). ** le mix contient 500 µl de DNA Prep Stain et 50 µl de DNA Prep LPR (Beckman Coulter).

Suite à la réaction « click-iT » et au marquage à l’IP, les échantillons (minimum 1x104 cellules/échantillon) sont analysés à l’aide d’un cytomètre en flux GALLIOS (Figure 27) (Beckman Coulter, Passadena, USA). La lumière d’excitation est produite par une diode bleue de 22 mW (λ=488 nm) pour l’IP et une diode rouge de 25mW (λ=638 nm) pour l’Alexa Fluor 647. Des billes FlowCheck Pro (Beckman Coulter) sont utilisées pour vérifier l’alignement optique et la fluidique de l’appareil. Des billes FlowSet Pro (Beckman Coulter) sont utilisées pour vérifier la sensibilité de l’appareil. Le cytomètre est ainsi calibré et validé avant chaque analyse. Chaque cellule est caractérisée par 2 paramètres de diffraction, nommés, Forward Scatter (FS) et Side Scattter (SS). Pour les analyses immunologiques, la fluorescence de l’IP est collectée sur le canal FL3 à travers un

Échantillon fixé dans l’alcool 70° (4°C) Lavage du culot cellulaire par du PBS BSA (1%) Centrifugation 5 min à 2750 g 15 min Perméabilisation à la saponine Centrifugation 5 min à 2750 g Centrifugation 5 min à 2750 g 30 min Réaction « click-iT)* (noir, temp ambiante) Lavage à la saponine Arrêt de la réaction Centrifugation 5 min à 2750 g 15 min Marquage à l’IP** (noir, temp ambiante)

Marquage simpleà l’IP

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filtre bandpass 620 nm. La fluorescence de l’Alexa Fluor 647 (EdU) est collectée sur le canal FL6 à travers un filtre bandpass 660 nm.

Figure 27: Cytomètre en flux GALLIOS (BIOTICLA, Caen)

Les résultats collectés sont ensuite analysés grâce au logiciel FlowJo (Ashland, USA). Les doublets sont exclus de l’analyse en utilisant un histogramme aire versus maximum du contenu en ADN (voir « gate cycle » dans la Figure 28.A). Les singulets sont analysés sur un histogramme mono-paramétrique en prenant en compte le marquage IP (FL3-A) ce qui permet d’obtenir les différentes fractions du cycle cellulaire (Figure 28.B). Dans les échantillons marqués à l’EdU, il est également possible d’analyser plus en détail la phase S. Le profil du cycle ressemble à un fer à cheval (Figure 28.C), le signal EdU apparaissant en ordonnée (FL6-H) et le signal IP en abscisse (FL3-A). Il est possible de procéder à une analyse manuelle des différentes phases du cycle, ce qui s’est révélé très utile pour les CAH vu la faible proportion de cellules en phase S.

Figure 28: Analyse du cycle cellulaire par FlowJo. Exemple des SW1353 (6h après ré-ensemencement) A) Sélection de la population à analyser en éliminer les débris et les doublons. B) Analyse du cycle grâce au signal IP

seul (FL3-A). C) Analyse EdU (FL6-H) versus IP (FL3-A).

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5) Mesure de l’indice de prolifération cellulaire :

La prolifération cellulaire post-irradiation a également été estimée à l’aide du marqueur de prolifération Ki-67. Cet antigène est exprimé durant toutes les phases du cycle cellulaire à l’exception de la phase G0 (Scholzen

and Gerdes, 2000). La détermination de l’index a été réalisée en 2D par immunocytochimie. Pour ce qui est des modèles 3D, plusieurs techniques ont été testées pour mettre au point un protocole d’immunohistochimie- p.

5.1)

Immunocytochimie (2D) :

Suite à l’irradiation, les cellules sont remises en culture physioxique pour 12-16h. Elles sont ensuite détachées, comptées et remises en culture physioxique dans des flasques spéciales (NuncTM slide flasks) afin d’atteindre 50-60% de confluence 48h plus tard. Le protocole d’immunocytochimie comprend une étape de fixation au paraformaldéhyde (solution 4% dans du PBS) pendant 15 min suivie d’un blocage au PBS Tween- 20 0,5% (PBT) BSA 1% (Bovine Serum Albumin) pendant 30 min (sous agitation). Les cellules sont ensuite incubées à 4°C toute la nuit en présence de l’anticorps anti-Ki-67 (dilué au 1/200ème

dans du PBT BSA 0,1%, #9260, Millipore) directement couplé à la peroxydase. Le lendemain, après une étape de lavage au PBT, le signal est révélé à la diaminobenzidine (DAB #10452862, Invitrogen) par une incubation de 10 min à température ambiante suivie d’un lavage à l’eau du robinet et un montage dans un milieu hydrophile (glycérol 50%). Chaque lame est comptée au microscope optique par le même expérimentateur (minimum de 500 cellules/lame). Les photos représentatives de la Figure 29 ont été prises à l’aide d’un scanner Nikon Coolscope (Tokyo, Japon). Seuls les noyaux positifs francs sont comptés pour le calcul de l’index de prolifération.

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Figure 29: Marquage anti-Ki67 dans les SW1353 (A) et les CAH (B)

La flèche en trait plein indique une cellule positive et la flèche en trait discontinu une cellule négative.