9.2) Dépôt, migration et transfert des gels :
1) Effet oxygène sur la survie des CAH et de la lignée SW1353 après une irradiation en RX (bas TEL) :
Le cartilage articulaire est un tissu avasculaire composé de chondrocytes différenciés qui synthétisent une matrice extracellulaire (MEC). L’absence naturelle de vaisseaux sanguins dans le cartilage induit localement une faible tension en O2 (physioxie à environ 2%). Classiquement, en radiobiologie, les irradiations se font en
normoxie (20% d’O2). Cependant, en vue de l’utilisation d’un modèle 3D physioxique pour des études
d’hadronbiologie, nous avons souhaité sélectionner un référentiel 2D pertinent. Pour ce faire, nous avons sélectionné des RX, plus simples d’accès, afin de comparer l’impact de la tension d’oxygène sur la prolifération et la sensibilité des CAH et de la lignée SW1353 aux RIs (bas TEL dans ce cas), en culture 2D. Dans un premier temps, nous avons évalué le PE (plating efficiency) et le temps de doublement de ces deux types cellulaires en culture 2D normoxique et physioxique (Figure 38). Au bout de 12 jours de culture, le nombre de clones de plus de 50 cellules formés par les CAH était de 14,7% ± 1,7% et 26,6% ± 2,0% en normoxie et physioxie, respectivement. Concernant la lignée SW1353, le PE était de 25,5% ± 1,7% et 33,2% ± 2,0% en normoxie et physioxie, respectivement (Tableau 9). Le PE est donc siginificativement supérieur en physioxie en comparaison à la normoxie, et ce pour les deux types cellulaires (Figure 38.A). Par ailleurs, le temps de doublement a été évalué à ~ 70h et ~ 22h pour les chondrocytes normaux et la lignée SW1353, respectivement, et ce, pour les deux conditions de culture (Figure 38.B). Le temps de doublement ne semble pas être influencé par la tension d’oxygène et ne peut donc expliquer les meilleurs capacités de prolifération conférées par la faible tension d’oxygène aux chondrocytes normaux et chondrocytes de CHS.
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Figure 38: Etude de la prolifération dans les CAH (D1) et la lignée SW1353 en culture 2D normoxique et physioxique
A : Analyse du nombre de colonies de plus de 50 cellules (PE %) en normoxie et physioxie. Les valeurs sont exprimées
en moyenne ± erreur sur la moyenne de trois (CAH) à six (SW1353) expériences indépendantes (test t non apparié, ** p< 0,01, *** p< 0,001). B : Temps de doublement des CAH (D1) et SW1353 en normoxie et physioxie.
Dans un second temps, nous avons évalué la survie cellulaire des CAH et de la lignée SW1353 en culture 2D physioxique et normoxique. La Figure 39 présente le résultat de ces courbes de survie et le Tableau 9 résume les caractéristiques de ces courbes.
Figure 39: Courbes de survie des CAH (D1) et de la lignée SW1353 post-irradiation (bas TEL) en culture 2D normoxique et physioxique
Les CAH (1er donneur) et les SW1353 ont été irradiés avec les doses indiquées de RX (bas TEL) en normoxie (bleu) ou en physioxie (noir). Les courbes représentent les fractions survivantes de cellules obtenues selon le modèle linéaire quadratique. Les résultats sont représentés en moyenne ± erreur type sur la moyenne de trois à six expériences indépendantes. Test t (non apparié) à chaque dose d’irradiation entre la physioxie et la normoxie, * p<0,05.
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Les coefficients de corrélation R2 nous ont semblé satisfaisants pour la lignée SW1353 (0,930 en normoxie et 0,900 en physioxie). Cependant, ces coefficients sont plus faibles pour les CAH (0,487 en normoxie et 0,743 en physioxie). Ceci peut être expliqué par le nombre inférieur d’expériences réalisées avec le 1er donneur de CAH (n=3) en raison des temps de culture très longs que nécessitent ces cellules primaires. Le composant α est supérieur après une irradiation en normoxie (2,354 ± 0,898 Gy-1 pour les CAH et 0,230 ± 0,034 Gy-1 pour la lignée SW1353) comparé à l’irradiation en physioxie (0,729 ± 0,426 Gy-1
pour les CAH et 0,145 ± 0,036 Gy-1 pour la lignée SW1353). Pour ce qui est des CAH, les valeurs D10, D37 et FS2 sont respectivement de 1,1
Gy, 0,4 Gy et 2,2 % en normoxie, et 2,3 Gy, 1,1 Gy et 14,0 % en physioxie. En ce qui concerne la lignée SW1353, ces mêmes valeurs sont, respectivement, de 5,5 Gy, 3,0 Gy et 54,9% en normoxie, et 6,2 Gy, 3,6 Gy et 64,6 % en physioxie. De ce fait, la physioxie confère une relative radiorésistance aux cellules de chondrocytes normaux et de CHS en culture 2D. De plus, la lignée SW1353 est plus radio-résistante que le 1er donneur de CAH quelles que soient les conditions de culture.
Tension d’O2 N PE (%) α (Gy-1) β (Gy-2) R2 D10 (Gy) D37 (Gy) FS2 (%)
CAH (D1) Normoxie 3 14,7 ± 1,7 2,354 ± 0,898 -0,219 ± 0,244 0,487 1,1 0,4 2,2 Physioxie 3 26,6 ± 2,0 0,729 ± 0,426 0,126 ± 0,115 0,743 2,3 1,1 14,0 SW1353 Normoxie 6 25,5 ± 1,7 0,230 ± 0,034 0,035 ± 0,004 0,930 5,5 3,0 54,9 Physioxie 6 33,2 ± 2,0 0,145 ± 0,036 0,037 ± 0,005 0,900 6,2 3,6 64,6
Tableau 9: Caractéristiques des courbes de survie des CAH (D1) et de la lignée SW1353 post-irradiation (bas TEL) en culture 2D normoxique et physioxique
La définition des paramètres est détaillée dans la section « matériels et méthodes » en page 73.
Dans le but d’analyser plus en détails cet effet différentiel de la tension d’oxygène sur la survie cellulaire des chondrocytes normaux et de CHS en culture 2D, nous avons repris les mêmes plaques de culture utilisées pour la clonogénicité et avons compté l’ensemble des colonies formées d’une cellule à plus de 100 cellules. Nous avons ensuite fixé des classes de colonies en fonction de leur taille n : n = 1-20 cellules ou 20-100 cellules ou encore supérieur à 100 cellules. Le résultat de cette analyse de distribution de taille de colonies après une irradiation avec une dose unique de 2 Gy (RX) est représenté en Figure 40.A pour les CAH et Figure 40.B pour la lignée de CHS SW1353.
Dans le cas des CAH, la proportion de colonies composées de plus de 100 cellules était, respectivement, d’environ 13% et 37% dans le groupe contrôle normoxie et physioxie. Une dose unique de 2 Gy (RX) a réduit cette proportion à environ 2% pour les deux groupes normoxie et physioxie. Pour ce qui est de la lignée SW1353, le pourcentage de colonies composées de plus de 100 cellules a été évalué à environ 28% et 35%
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dans le groupe contrôle normoxie et physioxie, respectivement. Une dose unique de 2 Gy (RX) a réduit cette proportion à environ 21% et 28% pour le groupe normoxie et physioxie, respectivement. Le nombre de clones comptés et de répétitions d’expériences, nous permettent d’affirmer que les clones formés en physioxie sont significativement plus grands qu’en normoxie et ce pour les deux types cellulaires (Figure 40.A et Figure 40.B). Ceci explique les valeurs supérieures de PE en condition physioxique observées plus haut (Figure 38.A). Cependant, Cet avantage prolifératif semble perdu après une dose unique de 2 Gy (RX) dans le cas des CAH (1er donneur) mais maintenu dans le cas de la lignée de CHS.
Figure 40: Analyse de la distribution de taille de colonies des CAH et de la lignée SW1353 post-irradiation (bas TEL, 2 Gy) en culture 2D physioxique et normoxique
Les cellules (A : CAH, B : SW1353) irradiées en normoxie (bleu) ou physioxie (noir) sont remises en culture à faible densité, pendant 12 jours et sont ensuite fixées et colorées au crystal violet. Le nombre de cellules par colonie est déterminé et ce pour au moins 350 colonies par condition. Les résultats correspondant à 3 à 6 expériences indépendantes regroupées et représentés comme le pourcentage de colonies composées d’au moins n cellules.
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