Variabilité des cultures

Un des problèmes majeurs de la culture des endophytes est que les métabolites produits varient au fur et à mesure des repiquages et des différentes cultures, tant au point de vue de leur quantité que de leur qualité (Simon, Meunier, and Rivière 1970).

Cette baisse de rendement peut être inversée en ajoutant au milieu de culture un extrait de la plante hôte. Ainsi placé dans un environnement « physiologique » convenable pour lui, l’endophyte peut réactiver les voies de biosynthèses mises en sommeil auparavant. Il est aussi possible, comme présenté ci-dessus, d’ajouter certaines substances favorisant la production des métabolites d’intérêt.

Le milieu de culture a de toute évidence un impact très fort sur la production de métabolites. Par exemple, une plus grande quantité d’extrait sera obtenue sur un milieu solide par rapport à un milieu liquide. De même, en fonction de la composition du milieu, la quantité et la nature des métabolites produits seront différents. Pour chaque production souhaitée, il s’agit donc de trouver le milieu le mieux adapté pour le micro-organisme à cultiver (Vandermolen et al. 2013).

Parmi les problèmes récurrents rencontrés lors de la production de métabolites par les organismes endophytes, il existe aussi une variabilité entre les réplicas d’une même souche et placés dans les mêmes conditions de culture. Ceci est dans doute relié au fait que la concentration en nutriments du milieu de culture peut légèrement différer d’une culture à l’autre. Il s’agit donc d’être extrêmement précautionneux au moment de couler les boîtes de Pétri, ou de commander à un fournisseur industriel un même lot standardisé de gélose. D’autres facteurs peuvent influer les cultures d’endophytes, tels que les échanges gazeux, qui ne seront pas les mêmes si l’étuve est mal ventilée par exemple, ou suivant la position de la boîte de Pétri dans l’étuve. Le nombre de boîtes de Pétri dans l’étuve doit donc toujours être le même d’un lot de culture à l’autre.

88 Nous pouvons illustrer ce problème à l’aide de la figure 35 ci-dessous, grâce aux réplicas des 8 souches que nous avons cultivées. Sur chacune de ces six boîtes de Pétri a été cultivée la même souche d’endophyte. Le milieu, la date de la culture et toutes les conditions expérimentales sont identiques. Cependant il apparait clairement que toutes les cultures ne sont pas au même stade de maturité, certaines ayant sporulé et colonisé toute la surface de la gélose tandis que d’autres non. Cette observation est valable pour tous les réplicas des cultures (voir annexe III).

Figure 35: Variabilité des réplicas d'une même souche.

Cela est aussi vérifié après extraction de ces boîtes : la figure 36 montre les différences colorimétriques des extraits obtenus.

89 Nous avons souhaité quantifier cette variation grâce à des expériences d’HPLC complétées par une analyse en composantes principales (ACP).

Nous voyons sur le chromatogramme suivant (voir figure 37) les six réplicas de la souche 74. Chaque pic est associé à sa masse majoritaire. Comme nous pouvons le constater, à première vue, les profils sont homogènes qualitativement, mais hétérogènes au niveau quantitatif.

Figure 37: Profils HPLC-QTOF des 6 réplicas de la souche 74.

Lorsque l’on regarde les profils obtenus sur l’ensemble des réplicas de toutes les souches, à savoir sur les 6 réplicas des 8 souches, la constatation est la même (voir figure 38).

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Figure 38: Profils HPLC-ESI-QTOF de l'ensemble des réplicas des 8 souches. Chaque pic est associé à sa masse majoritaire.

Enfin, les profils chromatographiques LCMS (masses et temps de rétention) obtenus sur l’ensemble des réplicas de toutes les souches ont été comparés statistiquement à l’aide du logiciel SIMCA P14.0 (Umetrics Sweden). L’ACP résume l’espace de variance d’un jeu de données. Les données sont disposées en fonction de leurs ressemblances : deux points côte à côte seront identiques.

On observe sur cette ACP quatre massifs intéressants (voir figure 39) :

- sur les deux premiers, 1 et 1’, nous pouvons constater que les souches (souches 74, 83, 85, 181, 184) ne sont pas groupées, mais alignées. Couplée à l’observation de la superposition des chromatogrammes LCMS, nous pouvons en conclure que cela est dû à l’hétérogénéité quantitative des souches.

- Le massif numéro 2, centré au milieu de l’ACP, témoigne de la reproductibilité de la méthode analytique : ces profils, en rouge, sont ceux du pool de l’ensemble des échantillons (QC). Le fait qu’ils soient tous groupés montre bien que l’ACP atteste qu’ils sont tous identiques, donc que les profils LC-MS le sont aussi. Leur position centrale indique simplement que ces échantillons ont des affinités avec tous les échantillons de l’ACP, ce qui est logique.

- Enfin, le massif 3 indique que certains réplicas de certaines souches sont malgré tout semblables. la technique culturale des endophytes mérite donc d’être améliorée, mais reste intéressante pour quelques souches.

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Figure 39: Résultats de l'ACP pour la comparaison des profils LCMS des souches.

Par ailleurs, il est nécessaire de cultiver les souches en grande quantité afin d’obtenir une quantité exploitable d’extrait, rendant l’exploration de la chimie des endophytes laborieuse : le rendement de culture est faible, malgré le fait que les extraits soient très riches en différents métabolites.

La recherche de nouvelles méthodes de culture, reproductibles et efficaces, est nécessaire.

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III.

Conclusion

Les endophytes sont une voie d’avenir pour la recherche de nouvelles molécules biologiques.

Mais ce chapitre montre bien que la culture des endophytes et la préparation des extraits peut présenter des écueils dans la mesure où elle montre des problèmes de reproductibilité.

Nous avons dépassé ce problème en rassemblant les réplicas d’une même souche pour l’analyse des données.

Par la suite, il faudrait utiliser des milieux différents, comme des milieux au riz par exemple, qui sont connus pour entraîner une meilleure reproductibilité des réplicas (Kjer et al. 2010).

La recherche d’inhibiteurs de la SOD à travers les tests colorimétriques devra s’effectuer à une concentration assez faible, puisque la coloration de certains échantillons est très importante et l’absorbance doit demeurer inférieure à une unité d’absorbance.

Ces étapes préliminaires passées, nous allons présenter les résultats issus des analyses des échantillons en chromatographie liquide ultra-haute résolution, couplée à de la spectrométrie de masse haute résolution.

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