Réseaux moléculaires : identification potentielle de nouvelles furocoumarines

Le GNPS (https://gnps.ucsd.edu) est une infrastructure en ligne permettant de partager et traiter les données de MSE simplement en téléchargeant la liste de pics de MS-DIAL.

Le logiciel crée ensuite des réseaux mettant en relation les pics alignés dans MS-DIAL entre eux. Les réseaux permettent la visualisation des différences et des relations existant entre les ions vus dans les spectres de masse. On obtient alors des clusters d’ions permettant la déréplication des métabolites d’intérêt présents dans les échantillons.

Chaque point représente une masse et chaque lien entre les points est fonction de la différence de masse des deux points ainsi que des données de fragmentation MSE. Deux points dans un même cluster sont liés entre eux par leurs données de fragmentation et les molécules associées à ces points auront donc des structures très proches.

Malgré toutes les avancées possibles grâce au GNPS, la visualisation des réseaux moléculaires n’est pas parfaite. Il faut donc faire intervenir un dernier logiciel, Cytoscape.

Cytoscape est une plateforme permettant de visualiser des réseaux moléculaires du GNPS de façon très sophistiquée, en leur attribuant des données comme la différence de masse entre deux ions. Un exemple est donné ci-dessous (voir figure 59) :

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Figure 59: Exemple de fonctionnement de Cytoscape. Les ions et leurs masses sont associés à un point (en vert) et le réseau les relie entre eux en fonction de leurs différences de masses et d'autres paramètres tels que le profil de fragmentation. Ici, les

deux ions de 499.325 Da et 517.336 Da ont une différence de masse de 18.011, ce qui correspond à la masse d’une molécule d’eau. L’ion de 517.336 Da possède dont un groupement H2O supplémentaire par rapport à l’ion de 499.325 Da. D’autres

paramètres interviennent dans la mise en relation de deux ions.

Pour la création de ce réseau, nous avons utilisé la liste de pics de MS-DIAL obtenue lors de la première série d’analyses en UPLC-QTOF-MSE.

Cytoscape prend seulement en compte dans son réseau moléculaire les ions montrant une ressemblance avec d’autres ions. Ainsi, sur la liste de 724 molécules traitées par le GNPS puis Cytoscape, seules 227 ont été inclues dans le réseau.

Il est possible grâce à ces réseaux moléculaires d’extrapoler la présence de molécules : deux molécules d’une même famille chimique seront dans le même cluster de points. On peut ainsi prédire la présence dans un extrait de molécules n’ayant jamais été caractérisées sans que soient nécessaires une extraction suivie d’une purification, étapes lourdes et coûteuses.

La figure 60 montre les réseaux obtenus après traitement par le GNPS puis Cytoscape des données de MS-DIAL, obtenues avec le QTOF.

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Figure 60: Réseaux moléculaires obtenus après traitement des données du QTOF par Cytoscape. Chaque point représente une masse et chaque lien entre les points est fonction de la différence de masse des deux points ainsi que des données de

fragmentation MSE.

Les masses des deux molécules identifiées par MS-FINDER ont été recherchées dans ces réseaux, mais n’ont pas été trouvées. Les paramètres entrés dans le GNPS sont donc à améliorer. Cela fera l’objet d’un travail ultérieur.

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IV.

Conclusion et perspectives

Dans ce chapitre, nous avons détaillé les différentes étapes du travail de déréplication des furocoumarines dans les extraits d’endophytes. Les molécules de cette famille possèdent un potentiel d’inhibition sur la SOD et, en outre, sont photoactivables, ce qui rend les rend très intéressantes d’un point de vue médical et curatif.

Une première analyse en LC-HRMS a été réalisée. Les profils chromatographiques obtenus ont été alignés entre eux grâce à deux logiciels : MZmine et MS-DIAL. La liste de pics assortie de leurs masses et profils de fragmentation a ensuite été comparée à une base de données de furocoumarines issue du Dictionary of Natural Products. Plusieurs molécules ont été identifiées par MZmine comme étant des furocoumarines.

Cette identification préalable a été vérifiée à l’aide du profil de fragmentation MSE par MS-DIAL et MS-FINDER : en effet, MZmine ne s’appuyant que sur la masse exacte des molécules pour ses identifications, il ne peut différencier les isomères ayant une même formule brute. La liste de pics produite par MS-DIAL n’est pas la même que celle de MZmine, ce qui est explicable par la différence d’algorithmes entre les deux logiciels, mais aussi par la différence entre les bases de données utilisées. Nous avons pu identifier deux molécules : la 5-Methyl-4H-furo[2,3-b][1]benzopyran-4-one et la déhydropachyrrhizone.

Une seconde série d’analyses a été faite par un OrbiTrap équipé d’un détecteur à barrettes de diodes et faisant de la fragmentation « data-dépendante » MS/MS. Nous avons à nouveau aligné et identifié les m/z grâce à MZmine. Puis nous avons recherché, dans les masses identifiées par MZmine comme étant des furocoumarines, si certaines présentaient le spectre caractéristique de cette classe de molécules, à l’aide de Xcalibur.

Nous avons ainsi pu identifier quatre autres furocoumarines : l’Ochrocarpine A, la Moellendorffiline, l’Anisolactone et l’Anhydrorutarétine, sans pouvoir confirmer ces résultats par les données de fragmentation : ces molécules n’étant pas majoritaires dans les pics chromatographiques, elles n’ont pas été fragmentées.

Ce travail a donc a priori permis l’identification de six furocoumarines. La complémentarité des deux appareils pour la recherche de composés est ici bien illustrée.

Enfin, étant donné le peu d’échantillons analysés, il est prématuré d’en tirer des conclusions quant aux espèces d’endophytes dans lesquelles les furocoumarines sont plus susceptibles d’être rencontrées.

Il s’agit là d’une identification de première intention, qui constitue cependant une première, dans le sens où aucune de ces molécules n’a jamais été décrite dans des champignons endophytes. Afin d’avoir la certitude qu’elles sont présentes dans les extraits, il faudrait procéder à leurs extractions, leurs purifications et leurs analyses en RMN. Enfin, la co-injection d’un standard parachèverait l’identification.

119 Nous soulignons aussi le côté limitant, bien que complémentaire, du grand nombre de logiciels et de bases de données utilisés. Aucun ne regroupe l’ensemble des fonctionnalités nécessaires à la déréplication et l’identification de composés d’intérêt.

En parallèle de ce travail, un fractionnement de certains extraits d’endophytes est en cours. La souche 85 a été cultivée en grande quantité - 2 m2 de culture ont été ensemencés- puis extraite par le Dr. Mohamed Haddad. Les deux grammes d’extraits brut obtenus ont été fractionnés par MPLC et des peptides d’intérêt sont en cours d’identification.

En l’absence d’un test fiable permettant d’attester de l’activité des furocoumarines sur la SOD, il est impossible de procéder au fractionnement bio-guidé des extraits. Il est aussi impossible sans ces résultats biologiques de mettre en place un réseau de neurones qui pourrait identifier les molécules candidates à l’inhibition de la SOD.

Nous avons tenté, dans le chapitre suivant, de mettre au point un test permettant de connaître l’activité de la SOD dans les extraits étudiés.

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