Mise au point du test au pyrogallol

Dans le cadre de ces travaux de thèse, nous avons tenté de mettre ce test au point sur des plaques de 96 puits.

La difficulté réside dans le fait que le volume réactionnel est très faible (250 µL). Il ne permet donc pas de travailler avec de grandes quantités d’échantillon ou de réactif, ce qui peut être un avantage dans la mesure où nous n’avons pas de très grands volumes d’extraits. Cependant, la variation d’absorbance entre des conditions dans lesquelles la SOD est inhibée ou non est très faible et donc statistiquement proche du bruit de fond.

De nombreuses conditions ont été testées, en se basant sur la publication de Li X (Li 2012).

II.4.2.1 Concentration en pyrogallol

La concentration en pyrogallol doit aussi être déterminée de façon à ce que l’absorbance à 320 nm de la solution d’extrait et de pyrogallol auto-oxydé ne dépasse pas - ou peu - une unité d’absorbance. Les échantillons testés étant très fortement colorés, leur absorbance dépasse souvent 1 UA à 320 nm, même à faible concentration. Le but étant de les

138 tester à la concentration la plus forte possible pour détecter un éventuel inhibiteur en très faible quantité, il faut donc minimiser au maximum l’absorbance du pyrogallol et donc sa concentration.

Pour cela, nous avons effectué une gamme de concentration du pyrogallol, allant de 0.01 mM à 1 mM de concentration finale. Les absorbances à 320 nm varient alors de 0.05 à 2 UA.

La concentration optimale en pyrogallol a ainsi été fixée à 0.1 mM dans la solution finale, l’absorbance du témoin ne dépassant alors pas 0.5.

II.4.2.2 Concentration en SOD

Nous avons décidé arbitrairement de fixer la concentration en SOD à une valeur telle qu’elle n’inhibe pas totalement l’auto-oxydation du pyrogallol (elle doit inhiber d’environ 30% l’activité du pyrogallol). Cela nous permet en premier lieu de vérifier la présence d’antioxydants dans les échantillons à tester : en présence de substances antioxydantes, il est possible d’observer une inhibition de l’auto-oxydation du pyrogallol supérieure à celle de l’inhibition en présence de SOD seule. En second lieu la faible concentration de SOD nous permet d’objectiver des inhibiteurs de la SOD présents en très faible quantité dans les échantillons : la solution n’étant pas saturée en SOD, une faible variation de l’activité de la SOD se répercute de façon très sensible sur l’absorbance de la solution.

La gamme de concentrations de l’enzyme a été effectuée de 0.1 U/mL finale à 10 U/mL finale. Ă une concentration de 0.1 U/mL, la SOD inhibe 0% de l’auto-oxydation du pyrogallol, tandis qu’à 4 U/mL elle inhibe déjà 100 % de l’auto-oxydation du pyrogallol. Cette expérience nous a permis de trouver la concentration de l’enzyme entraînant une inhibition de 30 % de l’auto-oxydation du pyrogallol (concentration du pyrogallol fixée à 0.1 mM, et la concentration finale de SOD a donc été fixée à 1 U/mL dans la solution finale.

Il est à noter qu’il faut être particulièrement prudent quant au matériel utilisé. En effet, la SOD peut s’adsorber sur certains plastiques. Il est donc préférable d’utiliser des contenants en verre.

II.4.2.3 Concentration des extraits

L’influence de la concentration en extrait est très importante, les extraits étant très colorés à la longueur d’onde suivie, c’est-à-dire à 320 nm. Il s’agit donc de régler la concentration de l’extrait de façon à ce que l’absorbance de la solution à 320 nm, après 10 minutes de réaction, ne dépasse pas 1 unité d’absorbance. Nous avons fixé la concentration des extraits comme étant la plus forte possible mais ne dépassant pas une absorbance de un. Les échantillons ayant des absorbances très variables, et l’harmonisation des concentrations testées étant nécessaire à des fins d’interprétation des données, il a finalement été décidé d’utiliser une concentration finale de 40 µg/mL lors de la première série de tests (screening rapide de 86 souches). Les concentrations d’échantillons ont ensuite été modifiées.

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Figure 80: Variations d'absorption du pyrogallol en présence d'un extrait d’endophyte à 40 µg/mL, avec et sans SOD, pendant 14 min.

Pour tester l’action d’un échantillon sur l’activité de la SOD, cet échantillon est rajouté dans le mélange réactionnel contenant la SOD : si l’absorbance à 320 nm varie par rapport à l’absorbance à 320 nm du témoin, cet échantillon a une action vis-à-vis de la SOD :

- L’échantillon aura une activité anti-SOD si le pic à 320 nm retrouve sa hauteur initiale sans SOD. En effet, cela signifie que l’auto-oxydation du pyrogallol s’est déroulée en entier, et donc que les anions superoxyde n’ont pas été dismutés par la SOD. La SOD a donc été inhibée.

- En revanche, l’échantillon aura une activité pro-SOD si le pic d’auto-oxydation du pyrogallol est plus bas que le témoin avec SOD. Cela signe une plus faible auto-oxydation du pyragallol et donc une consommation par la SOD d’une plus grande quantité d’anions superoxyde. La SOD a donc été activée.

II.4.2.4 Autres facteurs pris en compte dans la mise au point du test

Les réactivités du pyrogallol et de la SOD sont facteurs de nombreux paramètres, tel que le pH. Nous avons donc testé plusieurs conditions de pH de la solution de Tris et l’avons fixé à 8.2. Autrement, la cinétique de la réaction d’auto-oxydation du pyrogallol est trop rapide et le maximum d’absorption est atteint avant 10 minutes. Or, nous souhaitons que la

140 réaction puisse être mesurée sur 10 minutes, afin d’avoir un nombre suffisant de points sur la droite de régression.

De la même façon, la plaque de 96 puits est laissée à une température de 37°C dans le spectromètre UV-visible durant le temps de l’analyse.

Le temps d’incubation a été fixé à 5 minutes à température ambiante. En effet, si un inhibiteur spécifique existe dans l’extrait, il se liera rapidement à la SOD.

Nous avons aussi vérifié que l’acétate d’éthyle et le méthanol n’entraient pas en interaction avec le pyrogallol ou la SOD. Les concentrations des solvants étaient les mêmes que celles utilisées pour tester les échantillons, à savoir 1 µL/250 µL, mais nous avons aussi testé des concentrations plus fortes, à savoir 10 µL/250 µL. Il n’y a pas d’interaction avec le test à ces concentrations.