Recherche d’adduits de la SOD par LC-MS

Une nouvelle technique de détection d’inhibiteurs de la SOD est en cours d’élaboration dans l’équipe « Chimie des Substances Naturelles : Isolement-Structure- Synthèse et Chimiothérapie Anti-parasitaire » de l’université Paris Sud, par l’équipe du Dr Alexandre Maciuk.

Elle est basée sur le principe suivant : l’extrait contenant un potentiel inhibiteur est mis en contact avec la SOD. Si un inhibiteur est présent, il se fixera sur la SOD. L’extrait est étudié par une méthode de LC-MS permettant de mettre en évidence ces complexes enzyme- inhibiteur. De plus, cette méthode a la particularité de déterminer la force de la liaison, et donc la nature de l’inhibition (spécifique ou non spécifique), grâce à l’étude de la dissociation du complexe par collision différentielle à intensité croissante.

Cette méthode a été utilisée avec succès dans le screening de molécules antipaludiques se liant à l’hème (voir figure 92) et inhibant de ce fait la formation de cristaux d’hémozoïne. Pour rappel, l’hémozoïne est l’assemblage d’hème en cristal. Ce mécanisme permet de détoxifier l’hème, produit de dégradation de l’hémoglobine, toxique pour le parasite.

159 La stabilité du dimère de l'hème est étudiée avant et après ajout de la drogue (ici l'artémisinine) par la mesure de l'énergie nécessaire à la dissociation du complexe. On voit sur la figure 92 qu'après l'ajout d'artémisinine, l'énergie nécessaire à la dissociatin du dimère diminue de 195 à 150 V. Il s’agit donc bien d’un inhibiteur de la formation d’hémozoïne.

Figure 92: La stabilité du dimère d'hème est étudiée avant et après ajout de la drogue (ici l'artémisinine) par la mesure de l'énergie nécessaire à la dissociation du complexe (Muñoz-Durango et al. 2012).

Ces deux méthodes devraient permettre de déterminer de façon efficace, rapide et sensible la présence ou l’absence d’inhibiteurs de la SOD. Cette information nous permettra de compléter l’étude métabolomique des extraits d’endophytes avec la mise en place d’un réseau de travail moléculaire.

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161 Le but de ce travail de thèse était de rechercher de nouvelles molécules inhibitrices de la SOD dans des extraits de substances naturelles. Cette enzyme majeure du stress oxydant étant impliquée dans de nombreux mécanismes de défense des cellules cancéreuses contre l’apoptose représente une voie thérapeutique d’avenir.

Peu d’inhibiteurs de la SOD sont connus à ce jour.

Afin de maximiser nos chances de trouver des structures originales de composés inhibiteurs de la SOD, nous avons choisi de travailler avec les substances naturelles et plus particulièrement avec les champignons endophytes. Ces micro-organismes produisent la majorité des métabolites d’intérêt des plantes qui les hébergent, en particulier des substances de défense. Ils possèdent donc un éventail très riche de molécules d’intérêt pharmaceutique, peu caractérisées à ce jour. Cette étude vise à apporter des connaissances pharmacochimiques supplémentaires sur ces organismes.

Ce travail de thèse a d’abord porté sur l’isolement, la culture, l’identification, l’extraction et la caractérisation des souches de champignons endophytes provenant de plantes péruviennes.

Le but de cette analyse était de caractériser spectralement (spectres UV-visibles, CCM) et par spectrométrie de masse ces extraits.

Les analyses statistiques effectuées sur les résultats obtenus en HPLC ont confirmé les problèmes de variabilités qualitative et quantitative pouvant être rencontrés au cours de la culture des endophytes et décrites dans la littérature.

Afin de palier à ce problème, les extraits provenant des réplicas d’une même souche ont été rassemblés pour l’analyse ultérieure des données pharmacochimiques.

Cependant, ces variabilités étant majoritairement dues aux conditions de cultures, il serait intéressant de les optimiser et rationnaliser, par exemple par un meilleur contrôle des conditions de culture (nature des milieux, maitrise des conditions d’oxygénation, etc.)

La seconde partie expérimentale a porté sur la recherche de furocoumarines dans les extraits obtenus.

En effet, cette famille de molécules est intéressante car elle contient potentiellement des inhibiteurs de la SOD pouvant agir à deux niveaux : par un effet direct sur l’enzyme ou en tant que molécules photoactivables.

Nous avons donc tenté de dérépliquer ces composés dans les extraits d’endophytes au cours de deux stratégies de spectrométrie de masse.

La première stratégie a été réalisée en LC-HRMS à l’aide d’un QTOF. Les données de masse (masse exactes et fragmentation MSE) ont été traitées par divers logiciels (MZmine, MS-DIAL, MS-FINDER). Ce traitement a abouti à l’identification de deux furocoumarines, la 5-Methyl-4H-furo[2,3-b][1]benzopyran-4-one et la déhydropachyrrhizone.

162 Une seconde série d’analyses a été réalisée à l’aide d’un OrbiTrap équipé d’un détecteur à barrette de diodes et faisant de la fragmentation « data-dépendante » (MS/MS). Les données de masse et les spectres UV ont été analysés par MZmine et Xcalibur.

Nous avons ainsi pu identifier quatre autres furocoumarines : l’Ochrocarpine A, la Moellendorffiline, l’Anisolactone et l’Anhydrorutarétine

Tous les résultats présentés ont été obtenus après analyse des échantillons en mode d’ionisation négatif. Nous avons choisi ce mode, plus sélectif que le mode positif, afin de diminuer la trop grande quantité de molécules détectée dans les extraits bruts.

Ce travail a donc a priori permis l’identification de six furocoumarines. La complémentarité des deux appareils pour la recherche de composés est ici bien illustrée. Il s’agit là d’une identification de première intention, qui devra être confirmée par l’étude des extraits en mode d’ionisation positif, la co-injection de standards ou encore la purification et l’analyse par RMN.

Les deux stratégies de recherche de furocoumarines, à l’aide d’un QTOF et d’un OrbiTrap s’avèrent complémentaires.

La souche 85 a, en parallèle de ce travail, été re-cultivée à grande échelle et extraite. Elle est en cours de fractionnement.

Afin de compléter cette approche métabolomique et identifier les molécules inhibitrices de la SOD, il est nécessaire de mettre au point un test permettant d’évaluer de façon fiable cette activité.

Nous avons donc tenté de mettre au point un test rapide, peu coûteux et réalisable en routine. Cependant cette mise au point nous confronte à deux problèmes majeurs : la forte absorbance des extraits dans les longueurs d’onde d’utilisation des tests et la dilution extrême des molécules inhibitrices recherchées dans les extraits totaux.

Nous avons sélectionné le test au pyrogallol afin de rechercher l’activité biologique des extraits d’endophytes sur la SOD. Mais ce test n’a pas démontré les qualités recherchées tant au niveau de la sensibilité que de la reproductibilité; malgré les différentes campagnes de mise au point. Ce problème peut être dû à la nature du test lui-même ou aux différents échantillons testés.

Nous orientons à présent les recherches vers des approches différentes, tel que effectuer les tests à des volumes supérieurs ou encore la recherche directe d’adduits sur la SOD par LC-MS.

Ces deux méthodes devraient permettre de déterminer de façon efficace, rapide et sensible la présence ou l’absence d’inhibiteurs de la SOD. Cette information nous permettra de compléter l’étude métabolomique des extraits d’endophytes avec la mise en place d’un réseau de travail moléculaire.

163 Cela étant, il serait aussi intéressant de tester les extraits et les furocoumarines pures commerciales sur d’autres modèles biologiques, tels que des cellules cancéreuses, polymérisation du peptide B amyloïde, anti-parasitaires, anti-fongiques, insecticides....

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