Vérification des identifications grâce aux spectres UV, obtenue par l’OrbiTrap

Les furocoumarines peuvent présenter deux profils d’absorption UV caractéristiques : - de 250 à 300 nm, avec un maximum à 270 nm,

- de 300 à 330 nm, avec un maximum à 311 nm, qui peut se déplacer jusqu’à 320 nm. Les analyses précédentes ne permettent pas d’obtenir les spectres UV des molécules, car la mesure de la longueur d’onde est fixée à 254 nm sur cet appareil. Il est donc décidé, de procéder à une seconde série de mesures sur un spectromètre de masse (LTQ-Orbitrap XL ETD) possédant un détecteur DAD et faisant de la fragmentation data-dépendante afin de réaliser les profils UHPLC-DAD-FTMS-MS/MS.

112 Seuls les trois échantillons ont été analysés (le pool des six réplicas des souches 73, 181 et184) car la quantité restante des autres extraits d’endophytes est trop faible

III.2.1 Alignement des pics et identifications potentielles

Les données brutes (.raw) sont téléchargées dans MZmine, puis les pics chromatographiques des trois échantillons sont alignés et 1617 molécules ont été trouvées.

La liste de pics a été comparée à la liste des furocoumarines, construite d’après le Dictionary of Natural Products.

Vingt-huit molécules ont cette fois été identifiées par MZmine comme des furocoumarines (voir annexe VI). Là encore, MZmine ne se fiant qu’aux données de masse, nous avons vérifié cette liste d’identifications en utilisant les profils UV et de fragmentation des profils UHPLC-DAD-FTMS-MS/MS, sachant que seul l’ion majoritaire du pic chromatographique est fragmenté (fragmentation « data-dépendante »).

III.2.2 Vérification des identifications par profils UV

Dans le même temps, les données sont entrées dans le logiciel de traitement des données UV, Xcalibur™ 3.0 qui est un logiciel traitant les données LC-MS obtenues avec des appareils ThermoScientific™.

Nous avons recherché les profils UV de chaque molécule identifiée par MZmine. Les résultats sont donnés en annexe VII.

Quatre furocoumarines semblent avoir été identifiées à l’aide de ce procédé. Elles sont présentées dans le tableau 4 ci-dessous :

Tableau 4: Furocoumarines identifiées grâce aux expériences menées avec l’OrbiTrap.

Nom de la molécule Formule brute Masse exacte (Da) Différence de masse observée entre la masse théorique et expérimentale (ppm) % correspon dance avec le profil isotopique théorique RT (min) Spectre UV Source biologique (littérature) Ochrocarpine A C25H24O6 420.15729 -7.6 91 2,87 260/318

Retrouvé dans l’écorce d’Ochrocarpos punctatus Moellendorffiline C26H20O10 492.10565 8,8 90,1 6,7 287/314 /329

Retrouvé dans les racines d’Esenbeckia grandiflora et d’Heracleum moellendorffii var. paucivitatum Anisolactone C21H18O7 366.11034 -0,8 94,5 7,78 270

Retrouvé dans Clausena

anisata et Murraya koenigii

Anhydrorutarétine C14H12O4 244.07356 0,6 95,5 7,66 270/308

Retrouvé dans Apium

113 Le tableau 5 suivant montre les formules développées des molécules identifiées, ainsi que celles de leurs ions associés :

Tableau 5: Formules développées des structures identifiées par UHPLC-DAD-QTOF.

Identité Propositionsde structures chimiques des ions observés

Formule développée de la molécule

Ochrocarpine A O O O O- O HO O O O OH O HO Moellendorffiline O O O O O O O CH3 O CH3 O CH3 O H3C Anisolactone O O O O O O H₃C CH3 Anhydrorutarétine O O O O- H3C H3C O O O OH H3C H₃C

114 Le croisement entre les bases de données et la masse exacte des composés nous laisse à penser que ces structures sont correctes. Cependant, nous émettons des réserves quant à ces identifications, dans la mesure où l’ionisation ESI- est particulièrement bien adaptée pour identifier sélectivement des composés comprenant des fonctions phénol ou acide carboxylique, voire énol, c’est-à-dire d’une manière plus générale des molécules possédant des protons portés par des hétéroatomes (oxygène, azote). Les formes chargées de la moellendorffiline et de l’anisolactone présentent une forme possible d'énol conjugué d'ester, qui est rarement retrouvé dans la littérature.

Le seul moyen permettant de répondre à cette question serait la co-injection d’une molécule standard.

Toutes ces furocoumarines ont été retrouvée exclusivement dans la souche 181, dont le génome n’a pas pu être séquencé et dont nous ne connaissons donc pas le genre. Étant donné que seules trois souches ont été analysées en OrbiTrap, il est nécessaire de refaire les cultures et les analyses pour confirmer ces hypothèses quant à la prévalence de certaines molécules dans la souche 181.

La confirmation de ces résultats par les données de fragmentation MS/MS n’a pas pu se faire : aucune de ces molécules n’est la molécule majoritaire du pic chromatographique dont elle est issue. De plus, elles ne sont pas retrouvées dans la liste de pics de la première série d’analyse en MSE

: aucune donnée de fragmentation n’est donc accessible pour ces molécules.

Par ailleurs, cette série de molécules est différente de celle obtenue avec le QTOF, malgré le fait que les deux appareils utilisés montrent une même précision dans la détermination de la masse exacte. Cette différence d’identification a déjà été retrouvé dans la littérature (Glauser et al. 2013). Dans ce document, les performances de deux spectromètres de masse, un QTOF et un OrbiTrap, couplés à une UPLC, ont été comparées en termes de quantité et de qualité de structures identifiées, de différences entre différents échantillons, de répétabilité et de sensibilité. Bien que les résultats aient été trouvés similaires, il a été remarqué pour le QTOF une moins grande variabilité analytique et une meilleure précision, tandis que l’OrbiTrap démontrait une plus grande sensibilité. Les auteurs ne concluent pas à la supériorité des résultats d’un appareil sur l’autre mais au contraire que chacune de ces identifications est valable et utilisable en recherche de métabolites issus de substances naturelles.

Dans le cas qui nous concerne, il est aussi à noter que les deux expérimentations ont été réalisées à 4 mois d’intervalle, durant lesquels les échantillons ont subi plusieurs cycles de congélation-décongélation. Certaines molécules ont donc pu être dégradées et donc ne pas être retrouvées dans la liste de pics de l’OrbiTrap.

L’ochrocarpine A est une furocoumarine cytotoxique qui a été isolée pour la première fois en 2002 dans l’écorce d’Ochrocarpos punctatus., une plante originaire de la forêt

115 tropicale de Madagascar (Chaturvedula, Schilling, and Kingston 2002). Depuis, elle a été retrouvée dans Mammea neurophylla (Dang et al. 2015), et a montré des propriétés inhibitrice sur la glycation des protéines et de protection contre le vieillissement endothélial (Dang et al. 2014).

La moellendorffiline a été isolée dans les racines d’Esenbeckia grandiflora (une Rutacéee) et d’Heracleum moellendorffii var. paucivitatum (une Ombellifère) (Wu et al. 1986) ou encore Pleurospermum govanianum (Rao et al. 1995).

L’anisolactone est une furocoumarine qui a été décrite pour la première fois dans

Clausena anisata, une plante de la famille des Rutacées (Lakshmi et al. 1984).

L’anhydrorutarétine est retrouvée dans Apium leptophyllum (Ombéllifère) en 1980 (Sharma, Rattan, and Sharma 1980).

Aucune de ces furocoumarines n’a été décrite dans les champignons endophytes jusqu’à ce jour.