Validation du potentiel antipsoriasique des molécules novatrices

Les cinq molécules les plus prometteuses ont été sélectionnées pour la poursuite des études pharmacologiques. Selon les résultats en immunofluorescence, les molécules #4 et #10 normalisent l’expression de la filaggrine et de l’involucrine et diminuent l’expression de Ki-67, et ce, aussi efficacement qu’un traitement au méthotrexate. Les molécules #2, #3 et #21 se sont également démarquées et semblent avoir un bon potentiel antipsoriasique. Toutefois, l’extraction et la purification de la molécule #2 a été problématique. Par conséquent, la validation de l’effet thérapeutique des composés chimiques s’est poursuivie avec quatre molécules au lieu de cinq.

3.5.1 Analyses macroscopiques

Les analyses macroscopiques (Figure 3.13) illustrent bien, une fois de plus, la différence entre un substitut sain et un substitut psoriasique au niveau de la formation de l’épiderme. L’épiderme du substitut sain est opaque, lisse et uniforme (Figure 3.13 A), tandis que l’épiderme du substitut psoriasique a un

A B C D

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aspect granuleux et ne recouvre pas uniformément la zone d’ensemencement (Figure 3.13 G). Tel que mentionné précédemment, d’autres techniques d’analyses telles que l’histologie et l’immunofluorescence permettront de valider l’activité potentiellement antipsoriasique des molécules à l’essai, puisqu’aucune conclusion n’est possible à partir des analyses macroscopiques. En effet, lorsque l’on compare les substituts traités – qu’ils soient sains (Figure 3.13 B-F) ou psoriasiques (Figure 3.13 H-L) – avec leur contrôle respectif, aucune différence macroscopique n’est observable et ce, peu importe la molécule testée.

Figure 3.13 Résultats macroscopiques des substituts bilamellaires

autologues sains (A-F) et psoriasiques (G-L) pour les molécules #3, #4, #10 et #21.

Les substituts contrôles sans traitement (A et G), ainsi que les substituts traités au MTX (B et H), avec la molécule #3 (C et I), avec la molécule #4 (D

et J), avec la molécule #10 (E et K) ou avec la molécule #21 (F et L). Trois

substituts de chaque condition ont été analysés et les cellules provenant d’une patiente en bonne santé âgée de 18 ans (18♀) et d’une patiente psoriasique âgée de 64 ans (64♀) ont été utilisées (barre d'échelle = 1 cm).

A B C D E F

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3.5.2 Analyses histologiques

La coloration au Trichrome de Masson des substituts cutanés a permis de démontrer que les substituts psoriasiques (Figure 3.14 G) possèdent un épiderme vivant plus épais que les substituts sains (Figure 3.14 A). L’épaisseur de l’épiderme vivant des substituts psoriasiques traités avec les différentes molécules (Figure 3.14 H-L) semblent, une fois de plus, comparable à celui d’un phénotype sain in vitro (Figure 3.14 A). Aucune différence significative n'a été constatée entre l’épaisseur de l’épiderme vivant des substituts sains traités avec les différentes molécules (Figure 3.14 B-F) et celle du substitut sain contrôle (Figure 3.14 A).

Figure 3.14 Analyses histologiques des substituts bilamellaires autologues sains (A-F) et psoriasiques (G-L) pour les molécules #3, #4, #10 et #21. Les substituts contrôles sans traitement (A et G), ainsi que les substituts traités au MTX (B et H), avec la molécule #3 (C et I), avec la molécule #4 (D

et J), avec la molécule #10 (E et K) ou avec la molécule #21 (F et L). Les

trois substituts de chaque condition ont été analysés et trois photos ont été prises pour chaque substitut (total de 9 photos histologiques par condition, objectif 10X). Les lignes pointillées noirs (A et G) indiquent à quel endroit se situe la jonction dermo-épidermique. La barre de mesure représente 100 µm

3.5.3 Mesures de l’épiderme vivant

Des mesures de l’épiderme vivant ont été prises avec le logiciel ImageJ et traitées à l’aide d’une analyse de variance (ANOVA) à deux facteurs. Le diagramme en boîte de Tukey (box plot en anglais) permet de visualiser une série de statistiques quantitatives, où chacune des conditions est représentée

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par une boîte à moustaches de couleur différente (Figure 3.15). L’axe des Y représente les mesures de l’épiderme vivant en micromètre (µm), alors que l’axe des X représente les différentes populations cellulaires à comparer; la population cellulaire psoriasique est présentée dans la portion gauche du graphique et la population cellulaire saine est présentée dans la portion droite. En ce qui concerne la condition contrôle, il y a une augmentation significative de l’épaisseur de l’épiderme vivant du substitut psoriasique par rapport au substitut sain. Aucune différence significative au niveau de l’épaisseur de l’épiderme vivant n’est observable lorsque les substituts cutanés sont traités avec le DMSO, le contrôle négatif. Une différence significative à la baisse est observée dans le substitut psoriasique traité au MTX, comparativement au substitut psoriasique contrôle. Des différences significatives à la baisse ont été observées entre le substitut psoriasique contrôle et les substituts psoriasiques traités avec les différentes molécules.

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Figure 3.15 Boîtes à moustaches présentant les différentes mesures de

l’épaisseur de l’épiderme vivant des substituts sains et psoriasiques non traités et traités avec le méthotrexate et les molécules #3, #4, #10 et #21. Test de comparaisons multiples de Tukey (P<0.001, N=1, n=2, 20 mesures par condition).

3.5.4 Analyses immunohistochimiques

Les résultats en immunofluorescence avec la filaggrine ont bel et bien confirmé le phénotype psoriasique des substituts pathologiques in vitro, car l’expression de cette protéine dans les substituts psoriasiques est diminuée (Figure 3.16 B), lorsque comparée aux substituts sains sans traitement (Figure 3.16 A). Lorsque les substituts psoriasiques sont traités avec le MTX (Figure 3.16 C) ou avec les différentes molécules (Figure 3.17 A-D)

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l’expression de la filaggrine est augmentée. Aucune différence n’est observée entre les substituts sains traités et leur contrôle (résultats non présentés). Les analyses immunohistochimiques contre la loricrine démontrent également le phénotype psoriasique des substituts pathologiques in vitro, puisque l’expression de cette protéine est diminuée dans ceux-ci (Figure 3.16 E), comparativement aux substituts sains sans traitement (Figure 3.16 D). Lorsque les substituts psoriasiques sont traités avec le MTX (Figure 3.16 F) ou avec les différentes molécules (Figure 3.17 E-H), l’expression de la loricrine est augmentée. Aucune différence n’est observée entre les substituts sains traités et leur contrôle (résultats non présentés).

Figure 3.16 Immunofluorescence indirecte sur des substituts cutanés avec

un anticorps dirigé contre la filaggrine (vert, A-C) ou la loricrine (vert, D-F). Les substituts sains contrôles (A et D), les substituts cutanés psoriasiques contrôles (B et E) et les substituts cutanés psoriasiques traités avec le MTX (C et F). Les noyaux ont été colorés au Hoechst (bleu). Les lignes pointillées blanches indiquent à quel endroit se situe la jonction dermo-épidermique (barre d'échelle = 100 µm).

A B C

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Figure 3.17 Expression de la filaggrine (vert, A-D) et de la loricrine (vert, E-H)

dans les substituts psoriasiques traités avec les différentes molécules.

Les substituts psoriasiques traités avec la molécule #3 (A et E), la molécule #4 (B et F), la molécule #10 (C et G) ou la molécule #21 (D et H). Les noyaux ont été colorés au Hoechst (bleu). Les lignes pointillées blanches indiquent à quel endroit se situe la jonction dermo-épidermique (barre d'échelle = 100 µm).

A

B

C

D

83

Chapitre 4 – Discussion des analyses