Utilisation du fluor dans des structures enzymatiques comme preuves mécanistiques de

Les aminoacides à chaîne latérale fonctionnalisée sont souvent engagés dans des interactions tertiaires qui stabilisent la structure protéique mais également dans la liaison d’un substrat à son enzyme ou même dans le processus catalytique de réactions enzymatiques. Le fluor exerçant une forte attraction électronique, il diminue le pKa des fonctions des chaînes latérales acides (Asp, Glu), stabilisant les carboxylates, et déstabilisant la charge positive des ammonium protonés (Lys), imidazolium (His) ou entités guanidinium (Arg).11

Les aminoacides présents dans des sites catalytiques d’enzymes et portant des chaînes latérales incorporant des groupements fonctionnels polaires comme des fonctions hydroxyles (Ser, Tyr, Thr) ou des amines (Asn, Gln) prennent souvent part à des liaisons hydrogène et peuvent temporairement former des liaisons covalentes avec des substrats pendant le déroulement d’une réaction enzymatique. De plus, leur chaîne est souvent le site de modifications post-traductionnelles comme des phosphorylations ou des glycosylations. La présence d’atomes de fluor sur ce type d’aminoacides peut donc modifier ces interactions et perturber l’activité catalytique des enzymes qui utilisent ces propriétés dans leur mécanisme d’action.

Le rôle des résidus tyrosine au sein de sites enzymatiques dans des processus catalytiques de type acide / base peut être modifié par incorporation de dérivés tyrosines fluorés. En effet, l’ajout d’atomes de fluor sur le cycle des aminoacides aromatiques comme la phénylalanine résulte en une profonde diminution de la densité électronique sur le cycle aromatique. Il en est de même pour les résidus tyrosine. Cependant, un effet supplémentaire de la fluoration du cycle de la tyrosine est la diminution du pKa de la fonction phénol présent sur celui-ci.34,35

Ainsi, Zheng et Ornstein ont étudié l’influence de la fluoration d’une tyrosine hautement conservée du site actif de glutathion S-transférases (GST).⁵² Ces protéines forment une classe

51 d’enzymes détoxifiantes qui catalysent la conjugaison d’un tripeptide glutathion (γ-Glu-Cys-Gly) sur une grande variété de composés organiques qui possèdent des groupes électrophiles ou des alkyles ou aryles halogénés, lactones, époxydes, quinones, esters et quelques alcènes activés. Toutes les isoformes de cette enzyme se présentent sous forme d’homo- ou hétérodimères d’environ 50 kD (Figure 17).

Figure 17 : Structure de la GST

Au cours d’une réaction enzymatique, le résidu tyrosine stabilise le thiolate du glutathion par une liaison hydrogène où le proton est plutôt déplacé vers le groupement phénolique (Figure 18). En, effet, le pKa de la fonction thiol de la cystéine du glutathion à l’intérieur du complexe enzyme-substrat est compris entre 6,2 et 6,7 alors que celui de la fonction phénol de la tyrosine de l’enzyme est compris entre 8,3 et 8,5.

Tyr-OH--- ^-SG

Figure 18 : Liaison hydrogène mise en jeu au cours d’une réaction de conjugaison par une GST

Ainsi, en substituant cette tyrosine par son analogue 3-fluorotyrosine, les auteurs constatent qu’au sein du complexe, le pKa de la fonction phénol de la chaîne latérale de la tyrosine diminue de 1,2 unités pKa,36 ce qui a pour conséquence le déplacement du proton vers l’atome de soufre de la cystéine du glutathion (Figure 19).

3F-Tyr-O^----H-SG

Figure 19 : Déplacement du proton de la liaison hydrogène par fluoration de la tyrosine du site actif de GST

Ce changement dans l’état de protonation peut expliquer une perte d’activité catalytique de l’enzyme par fluoration. C’est pourquoi ces tyrosines fluorées sont souvent incorporées dans des sites catalytiques d’enzyme où leur rôle catalytique est supposé important. Si, par substitution du résidu naturel par son dérivé fluoré il y a perte d’activité enzymatique, ce résidu possède bien une fonction dans le mécanisme catalytique.

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Un autre exemple d’utilisation d’aminoacide fluoré comme preuve de mécanismes catalytiques enzymatiques concerne le rôle des résidus histidine. Leur chaîne latérale imidazole joue un rôle crucial dans de nombreuses fonctions protéiques. L’une d’entre elles est leur caractère accepteur de liaisons hydrogènes au cours de catalyses acide / base.

L’incorporation d’atomes de fluor en position 2 et 4 du noyau imidazole diminue considérablement la valeur du cation imidazolium de plusieurs unités de pKa, celui-ci passant de 6,0 à 1,22 pour la 2-fluorohistidine et à 1,76 pour la 4-fluorohistidine.⁵³ Ceci a des conséquences sur les processus biologiques faisant intervenir le caractère acide / base d’une histidine.

Ainsi, Jackson et al. étudient le processus enzymatique catalytique par lequel la Ribonucléase A (RNAse A) clive les nucléotides des ARN.⁵⁴ Pour cela, deux histidines du site catalytique de l’enzyme His12 et His119 ont été remplacées par leur analogue 4-fluorohistidine et l’hydrolyse du substrat-urydil 3’,5’-adénosine a été étudié. Le mécanisme supposé ainsi qu’une représentation du site actif de la RNAse présentant les deux histidines 12 et 119, complexées avec un substrat uridine vanadate sont montrés sur le Schéma 10 suivant.

Schéma 10

Au cours de la réaction d’hydrolyse, l’histidine 12 jouerait un rôle basique alors que l’histidine 119 agirait plutôt comme un acide.

Le Graphe 1 suivant montre les taux relatifs d’hydrolyse du substrat par les enzymes non mutée, mutée sur l’histidine 12 ou mutée sur l’histidine 119, soit doublement modifiée. Ainsi si l’histidine 119 est remplacée par son analogue fluoré, aucune activité catalytique de la RNAse n’est observée. Une faible activité est conservée sur seule l’histidine 12 est modifiée. La présence

53 Yeh, H. J. C.; Kirk, K. L.; Cohen, L. A.; Cohen, J. S. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1975, 928-934. 54 Jackson, D. Y.; Burnier, J.; Quan, C.; Stanley, M.; Tom, J.; Wells, J. A. Science 1994, 266, 243-247.

53 d’un atome de fluor augmente l’acidité de l’imidazole et déstabilise fortement la forme protonée nécessaire à la réaction enzymatique.

Graphe 154

Ainsi, la modification par fluoration d’histidines dans le site catalytique de cette RNAse a permis de mettre en évidence, par modification du pKa du noyau imidazole, leur rôle catalytique par implication dans un mécanisme de type acide/base.

L’utilisation d’aminoacides fluorés se révèle donc intéressante pour prouver certains processus mécanistique enzymatiques.