Utilisation des chlorures d’acyle

Les chlorures d’acyle de divers aminoacides ont été préparés selon la méthode Babu et

coll.120 et utilisés pour leur couplage avec l’énantiomère (R) majoritaire de l’α-Tfm-Alanine non

protégée. Dans un premier temps, nous nous sommes placés dans les conditions précédemment décrites par notre laboratoire ayant permis le couplage du chlorure de N-Fmoc-Alanine sur le dipeptide H-(R)-α-Tfm-Ala-Leu-OBn, pour former le tripeptide correspondant avec un rendement de 74% (Schéma 53).

Dans ces conditions, les premiers essais de couplage de la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine ont été réalisés sur de petites quantités de matières et suivis par RMN du fluor afin d’observer le taux de conversion de l’α-Tfm-Alanine (Tableau 6). Ces taux de conversion représentent les intensités relatives des signaux en RMN 19F du produit de couplage par rapport à celui de l’α-Tfm-Alanine de départ.

Solvant Taux de conversion

1 ^CH3CN ^0%

2 ^CH2Cl2 35%

3 ^{THF 70%}

Tableau 6 : Optimisation des conditions de couplage de la fonction amine de la (R)-α-Tfm-Alanine en présence des chlorures d’acyle

99 A température ambiante, dans l’acétonitrile, en présence de DIPEA, aucune conversion de l’α-Tfm-Alanine en dipeptide Fmoc-Ala-(R)-α-Tfm-Ala-OH (S,R)-5 n’est observée en RMN du

19F (entrée 1). Si du CH2Cl2 est utilisé comme solvant pour la réaction de couplage (entrée 2), l’α-Tfm-Alanine est convertie à hauteur de 35% en un deuxième produit fluoré. Ce taux de conversion est même augmenté à 70% si le solvant de réaction utilisé est le THF anhydre (entrée 3). Après acidification et extraction du milieu réactionnel, la présence d’α-Tfm-Alanine de départ est toujours observable en phase aqueuse. En phase organique, la RMN du proton montre la présence du produit de couplage désiré mais accompagné de plusieurs autres produits secondaires. La purification de ces mélanges bruts réactionnels par chromatographie sur gel de silice, à l’aide d’un système éluant DCM / MeOH dans un rapport 98/2 ne permet cependant pas d’isoler pur le dipeptide désiré. En effet, même après plusieurs passages successifs sur colonne chromatographique, réalisés manuellement ou sur un appareil automatique de type BUCCHI plus performant en terme de séparation, le dipeptide est toujours élué en même temps que la Fmoc-Alanine résultant de l’hydrolyse du chlorure d’acyle.

Afin de convertir complètement l’α-Tfm-Alanine, quatre équivalents de chlorure de N-Fmoc-Alanine sont mis en jeu dans la réaction de couplage, dans les conditions précédentes (Schéma 56).

Schéma 56

Même si une conversion totale de l’α-Tfm-Alanine est observée en RMN du fluor, sa purification sur colonne de silice est impossible et le dipeptide attendu est toujours obtenu en mélange avec la Fmoc-Alanine résultant de l’hydrolyse du chlorure d’aminoacide de départ.

Ainsi, augmenter la quantité de réactif de départ dans le but de convertir totalement l’α-Tfm-Alanine entraine en contrepartie des problèmes de purification récurrents. Nous avons alors décidé de revenir à un nombre d’équivalents d’aminoacide raisonnable (1,2 équivalents). Ces nouveaux essais ont également été réalisés sur une petite quantité de produit de départ avec un temps de couplage de trois heures. Le chlorure de la N-Fmoc-Alanine préparé dans les conditions de Babu120 est alors placé avec l’α-Tfm-Alanine dans un tube scellé à 100°C. Différentes conditions basiques et de solvants ont alors été testées. Après 3 heures de réaction sous pression à

100

100°C, la réaction est stoppée par ajout d’une solution d’HCl 1M et la conversion de l’α-Tfm-Alanine en dipeptide (S,R)-5 correspondant est évaluée (Tableau 7).

Base Solvant Taux de conversion

1 ^{Et3N CH}3CN ^11% 2 ^{Et3N THF 15%} 3 ^{DIPEA CH}3CN ^24% 4 ^{DIPEA THF 29%} 5 ^{- THF 35%} 6 ^{K2CO3 THF 90%}

Tableau 7 : Optimisation des conditions de couplage de la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine sous pression en présence de chlorures d’acyle

L’utilisation de THF ou d’acétonitrile modifie faiblement le taux de conversion de l’α-Tfm-Alanine en dipeptide Fmoc-Ala-(R)-α-Tfm-Ala-OH (entrées 1-2 et 3-4). L’emploi de bases tertiaires organiques comme la triéthylamine (Et3N) ou la diisopropyléthylamine (DIPEA), entraine la formation de nombreux produits de dégradation observés par chromatographie sur couche mince (CCM), notamment l’alanine résultant de la déprotection du groupement Fmoc. Ceci explique les faibles taux de conversion de l’α-Tfm-Alanine obtenus dans le cas de leur utilisation (entrées 1, 2, 3 et 4). En effet, l’absence de base pendant la réaction de couplage ne nuit pas à ce dernier, au contraire, le taux de conversion est même légèrement amélioré et aucune trace d’aminoacide déprotégé n’est observée par CCM (entrée 5). Il semblerait donc que l‘emploi de bases tertiaires organiques comme Et3N ou DIPEA soit délétère au couplage de la fonction amine l’α-Tfm-Alanine à un aminoacide N-protégé par un groupement protecteur Fmoc. Afin d’améliorer ce taux de couplage, il a alors été envisagé d’utiliser une base minérale qui agirait comme simple « pompe à protons » au cours de la réaction de couplage (entrée 6). L’emploi de 2 équivalents de K2CO3 dans du THF permet ainsi d’augmenter la conversion de l’α-Tfm-Alanine en dipeptide désiré à hauteur de 90%.

Un avantage supplémentaire que possède l’utilisation de K2CO3 comme base dans la réaction de couplage, est son insolubilité dans les milieux organiques. Après complétion de la réaction, le traitement du milieu réactionnel consiste simplement à filtrer le K2CO3 insoluble du

101 milieu réactionnel sur coton ou papier filtre. L’analyse du filtrat en RMN du proton montre la présence du dipeptide désiré en mélange avec de la Fmoc-alanine résultant de l’hydrolyse du chlorure de N-Fmoc-Alanine n’ayant pas réagi. Or, comme nous l’avons vu, la séparation du dipeptide de cette Fmoc-Alanine résiduelle est particulièrement difficile sur colonne de silice.

Comme ces premières réactions d’optimisation avaient été réalisées sur de petites quantités de matières de départ, nous les avons réitérées sur plus grande échelle en utilisant les conditions optimisées de l’entrée 6 du Tableau 7, afin de disposer de suffisamment de matière à purifier manuellement (Schéma 57).

Schéma 57

Notre laboratoire disposant d’une chromatographie liquide à haute pression (HPLC) semi préparative de type Waters, la purification de ce dipeptide (S,R)-5 a alors pu être réalisée sur colonne de silice inverse de type C8, particulièrement adaptée à la séparation de petits peptides. Un mélange eau/acétonitrile en présence de 0,1% d’acide trifluoroacétique (TFA), en utilisant un gradient d’acétonitrile s’étendant de 10% à 30% permet la séparation des deux acides. Le rendement de couplage après purification est alors de 85 % (Schéma 58).

Schéma 58

Ce bon rendement de couplage nous a alors confirmé que les chlorures d’acyle sont une méthode d’activation efficace pour le couplage de la position N-terminale de l’α-Tfm-Alanine. Différents aminoacides activés sous cette forme ont alors été couplés dans les conditions optimisées précédemment et purifiés par HPLC semi-préparative en phase inverse sur colonne de silice de type C8 (Schéma 59 et Schéma 60).

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Schéma 60

Cependant, le recours à une HPLC semi préparative comme outil de purification ne nous permet pas d’obtenir de grosses quantités de dipeptides purifiés. Les masses obtenues sont de l’ordre de la dizaine, éventuellement de la centaine de milligrammes. Or, le but de la première partie de mes travaux de thèse était de développer une méthode efficace, rapide et donnant accès à de grandes quantités de dipeptides incorporant une α-Tfm-Alanine en position C-terminale. L’utilisation de l’α-Tfm-Alanine non protégée dans les réactions de couplage génère la formation de dipeptides dont la fonction acide carboxylique C-terminale est libre, ce qui ne permet par leur purification sur colonne de silice en phase normale. Pour parvenir à purifier ces dipeptides par chromatographie en phase normale, la protection des fonctions amine et acide carboxylique de l’α-Tfm-Alanine a été envisagée.