Protections de la position N-terminale de l’α-Tfm-Alanine

Dans le but de protéger l’amine de la (R)-α-Tfm-Alanine sous forme de N-carboxybenzyle, cette dernière est soumise à l’action de de 1,1 équivalents de chlorure de carboxybenzyloxycarbonyle (CbzCl) en présence de 3,0 équivalents de carbonate de potassium dans un mélange eau/THF selon des conditions classiques.122 Dans un premier temps,

122 Lai, M. Y. H.; Brimble, M. A.; Callis, D. J.; Harris, P. W. R.; Levi, M. S.; Sieg, F. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 533-548.

103 Alanine et le K2CO3 sont dissouts dans l’eau et portés à 0 °C. Une solution de CbzCl dans du dioxane anhydre est ajoutée goutte à goutte. Après 30 min à 0 °C, le milieu réactionnel est laissé remonter à température ambiante et l’avancement de la réaction est suivi par RMN du fluor. Après 16 heures d’agitation, un faible taux de conversion de 20% de l’α-Tfm-Alanine en N-Cbz-(R)-α-Tfm-Alanine est observé par RMN ¹⁹F (Schéma 61). Cependant, le traitement de cette réaction par acidification du milieu réactionnel par une solution aqueuse d’HCl à 10% ne permet pas d’isoler la N-Cbz-(R)-α-Tfm-Alanine (R)-8.

Schéma 61

L’utilisation d’un nombre d’équivalents initial de CbzCl plus important (6,0 équivalents) ne permet pas non plus d’augmenter le taux de conversion de l’α-Tfm-Alanine (Schéma 62). De plus, le milieu réactionnel se retrouve saturé en alcool benzylique résultant de l’hydrolyse du chloroformiate.

Schéma 62

Un essai de protection sous pression en tube scellé à 100°C, en présence de 1,2 équivalents de CbzCl et de 3,0 équivalents de K2CO3 dans du THF anhydre ne permet pas non plus la protection de l’α-Tfm-Alanine par un groupement N-Carboxybenzoyle (Schéma 63). L’analyse du brut réactionnel par RMN ¹H montre que le milieu réactionnel est saturé en alcool benzylique provenant de la dégradation du chloroformiate dans ces conditions de température et de pression élevées. L’emploi des chloroformiates n’est donc pas adapté à ce type de conditions.

Schéma 63

L’hypothèse avancée pour expliquer ce taux de conversion faible est, qu’une fois ajouté au milieu réactionnel aqueux initial, le CbzCl s’hydrolyse progressivement en alccol benzylique et ne

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peut donc plus réagir avec la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine. Nous avons alors envisagé de procéder par ajouts lents successifs de plus petites quantités de CbzCl.

Ainsi, l’ajout de 1,1 équivalents de CbzCl au goutte à goutte sur une durée de 30 minutes permet d’augmenter le taux de conversion en RMN 19F de la (R)-α-Tfm-Alanine en N-Cbz-(R)-α-Tfm-Alanine (R)-8 à 52%. Il semblerait donc que l’hydrolyse rapide du chloroformiate de carboxybenzyloxy en milieu réactionnel aqueux soit le facteur limitant de cette réaction de protection.

L’utilisation de 5,0 équivalents de CbzCl répartis en 2 ajouts lents de 2,5 équivalents à 3 heures d’intervalles, permet, après plusieurs lavages au dichlorométhane et acidification du milieu réactionnel par une solution aqueuse d’HCl à 10 %, de convertir l’α-Tfm-Alanine en N-Cbz-(R)-α-Tfm-Alanine avec un rendement de 92% (Schéma 64).

Schéma 64

Ces conditions optimisées ont alors été appliquées à la protection de la fonction amine de l’énantiomère (S) minoritaire de l’α-Tfm-Alanine, permettant sa protection avec un rendement équivalent de 94% (Schéma 65).

Schéma 65

Ces premiers essais de protection de la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine sous forme de

N-Carboxybenzyle (Cbz) ont permis de confirmer sa faible réactivité. Pour un même nombre

d’équivalents de chloroformiate utilisé, son addition goutte à goutte doit être ralentie pour garantir la protection de l’amine. L’obtention de ce premier type de N-protection de la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine s’est montrée encourageante quant à sa réactivité, qui, certes fortement diminuée, peut être maitrisée. L’avantage du groupement Cbz pour les couplages en solution est sa grande stabilité aux conditions basiques de couplage peptidique. C’est le groupement de choix pour réaliser les couplages en solution. Il est orthogonal aux groupements labiles en milieu acide comme les esters méthyliques ou éthyliques souvent employés comme protections des fonctions acides carboxyliques en solution. Cependant, afin de diversifier les types de groupement protecteur

105 de la position N-terminale de l’α-Tfm-Alanine, nous avons ensuite envisagé sa protection sous forme de N-tert-butyloxycarbonyle.

2.3.1.2. N-(tert-butyloxycarbonyl)-α-Tfm-Alanine

L’avantage d’un groupement tert-butyloxycarbonyle (Boc) comme groupe protecteur d’une fonction amine est, au même titre que le groupement Cbz, son orthogonalité aux groupes protecteurs sensibles aux conditions acides. Cependant, celui-ci se révèle également compatible avec des groupements protecteurs clivés par hydrogénation comme les esters benzyliques, ce qui n’est pas le cas d’un Cbz qui lui-même est sensible à ce mode de déprotection. La stratégie Boc/benzyle est ainsi l’une des plus répandues pour les couplages en solution.

Les conditions classiques de formation de ce groupe protecteur nécessitent l’emploi du dicarbonate de di-tert-butyle (Boc2O) en présence d’une base qui est généralement un carbonate de sodium dans le THF ou dans l’eau. Ainsi, l’emploi de Boc2O en présence de différentes bases et dans différents solvants a été étudié pour la protection de l’amine de la (R)-α-Tfm-Alanine (Tableau 8).

Boc2O Base (équiv.) Solvant T° / tps Rdt

1 1.5 Et3N (2.5) DCM TA /1 nuit 0% 2 1.5 Et3N (2.5) MeOH TA / 1 nuit 0% 3 3 Et3N (6.0) MeOH TA / 1 nuit 0% 4 1.5 KOH (2.5) THF/H2O^a TA / 1 nuit 0% 5 2 K2CO3 (2.5) Eau/dioxane^b TA / 6h 0% 6 1.2 DMAP (0.1) THF TA / 6h 69 % 7 1.2 DMAP (0.1) THF TA / 30 min 95 % a proportions 40/60 b proportions 50/50

Tableau 8 : Optimisation des conditions de protection de la fonction amine de lα-Tfm-Alanine par un groupement Boc

Ainsi, le recours à des conditions classiques de protection à l’aide de Boc2O, en présence de triéthylamine à température ambiante pendant une nuit ne permet pas la protection de la (R)-α-TfmAlanine en Boc-(R)-α-Tfm-Alanine (R)-9 (entrées 1, 2 et 3), quel que soit le solvant utilisé.

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En effet, l’analyse des spectres RMN 19F des différents bruts réactionnels ne montrent pas de conversion de l’α-Tfm-Alanine en un quelconque produit fluoré. Celle-ci reste inchangée tout au long de la réaction. De même, l’utilisation de KOH (2,5 équivalents) dans un mélange THF/H2O (entrée 4) ou de K2CO3 (2,5 équivalents dans un mélange H2O/dioxane (entrée 5) ne permettent pas la formation de la Boc-(R)-α-Tfm-Alanine. Nous avons donc envisagé le recours à une quantité catalytique de 4-diméthylaminopyridine (DMAP). L’avantage de l’utilisation de cette base est son mécanisme catalytique (Schéma 66). Après réaction avec un équivalent d’anhydride pour former une espèce hautement réactive, la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine vient réagir sur celle-ci. Au cours de cette réaction, la DMAP est régénérée et peut alors réagir à nouveau avec un nouvel équivalent d’anhydride.

Schéma 66

L’addition lente d’un léger excès de Boc2O (1,2 équivalents) à une solution de (R)-α-Tfm-Alanine dans du THF anhydre en présence de 0,1 équivalent de DMAP à température ambiante pendant 6 heures permet, après acidification du milieu et extraction par de l’AcOEt, d’obtenir la Boc-(R)-α-Tfm-Alanine (R)-9 avec un rendement non optimisé de 69 % (entrée 6). Au cours des dix premières minutes de réaction un dégagement gazeux de CO2 peut être observé prouvant l’avancement de la réaction de protection.

Un deuxième essai, en présence d’une quantité plus importante de DMAP (0,3 équivalents) permet, après 30 minutes de réaction, de former la N-Boc-(R)-α-Tfm-Alanine (R)-9 avec un excellent rendement de 95% (entrée 7 du Tableau 8, Schéma 67).

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Schéma 67

Ces conditions optimisées de protection sous forme de N-(tert-butyloxycarbonyle ont été appliquées à l’énantiomère S minoritaire de l’α-Tfm-Alanine et permettent sa protection avec un rendement équivalent de 94% (Schéma 68).

Schéma 68

Ces deux types de N-protections, sous forme de groupement Cbz et de groupement Boc, conviennent parfaitement à la synthèse en solution car sont stables aux conditions basiques de couplages. Or, afin de pourvoir greffer l’α-Tfm-Alanine dans une séquence peptidique en croissance par synthèse peptidique sur support solide (SPPS), il serait intéressant de pouvoir obtenir la N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-α-Tfm-Alanine. En effet, comme nous le verrons au paragraphe 2.5.1., la stratégie conventionnelle de protection des fonctions terminales des aminoacides en SPPS consiste à protéger les fonctions amines sous forme de groupement Fmoc qui nécessite des conditions de déprotection basiques douces et les fonctions acides sous forme d’esters tert-butyliques.

2.3.1.3. N-(9-Fluorénylméthoxycarbonyl)-α-Tfm-Alanine

Différents essais de protection de la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine sous forme de groupement Fmoc ont été réalisés en présence de chlorure de fluorénylméthyloxycarbonyle (Schéma 69et Schéma 70).

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Schéma 70

Or, l’utilisation de chlorure de N-Fmoc en présence de carbonate de sodium dans un mélange eau/dioxane ne permet pas d’obtenir la N-Fmoc-(R)-α-Tfm-Alanine. Après 5 heures de réaction un prélèvement est réalisé et est directement analysé par RMN 19F qui ne montre pas la présence d’un nouveau produit fluoré. La (R)-α-Tfm-Alanine est retrouvée inchangée. De même, le recours à une base organique, la triéthylamine dans du dichlorométhane ne fournit pas le produit attendu. La fonction amine de l’α-Tfm-Alanine étant particulièrement désactivée par la présence du groupement trifluorométhyle en position α, sa protection par un groupement encombrant comme le groupement Fmoc est rendue très difficile. Nous n’avons pas pu obtenir N-Fmoc-α-Tfm-Alanine de configuration (R) ou (S).

2.3.1.4. Conclusion

Les essais de protection de la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine, et notamment l’échec de l’obtention de la Fmoc-α-Tfm-Ala, ont révélé la faible réactivité de sa fonction amine et notamment une vitesse de réaction ralentie par rapport aux analogues non fluorés. Il est nécessaire d’adapter les conditions classiques de protection. Néanmoins, le succès de l’obtention de deux types de protection des deux énantiomères de l’α-Tfm-Alanine, sous forme de N-Carboxybenzoyle et de N-tert-butyloxycarbonyle, est très encourageant et montre que cette fonction est à même de réagir (Figure 34).

109 Pouvant être obtenues à l’échelle du gramme, ces quatre α-Tfm-Alanine N-protégées sont une matière première facilement utilisable en vue de leur incorporation dans des peptides. Par ailleurs, elles sont à présent le point de départ pour l’obtention de l’α-Tfm-Alanine diversement

C-protégée. Pouvoir fabriquer en grande quantité l’α-Tfm-Alanine avec le choix de la protection

portée par la fonction amine était une étape nécessaire pour maitriser sa réactivité et utiliser cet acide aminé fluoré comme synthon efficace dans des réactions de protection ou de couplage.