Incorporation de l’α-Tfm-Alanine sur support solide

Afin de pouvoir intégrer l’α-Tfm-Alanine dans une séquence peptidique plus longue de manière rapide et automatisable, le recours à la synthèse peptidique sur support solide est nécessaire. Jusqu’alors, de par les profondes modifications de la réactivité des fonctions de l’α-Tfm-Alanine engendrées par la présence du groupement trifluorométhyle en position α, ainsi que par les quantités importantes de réactifs habituellement utilisées en SPPS, ce mode d’incorporation dans des peptides n’avait pas encore été envisagé.

Dans le cadre d’une étude de l’hydrophobie de petits peptides trifluorométhylés détaillée dans le chapitre III, nous devions synthétiser deux tripeptides incorporant une α-Tfm-Alanine en position N-terminale (R,S,S)-18 ou centrale (S,R,S)-19 (Figure 39).

Figure 39 : Tripeptides incorporant une α-Tfm-Alanine en positions N-terminale et centrale synthétisés pour l’étude de leur hydrophobie

La synthèse de ces peptides a alors été envisagée par synthèse peptidique supportée. Les fonctions acides carboxyliques terminales étant non protégées, la résine sélectionnée est une résine de Wang (Figure 38).

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2.5.2.1. Couplage de la position C-terminale de l’α-Tfm-Alanine en SPPS

La synthèse du peptide (R,S,S)-18 a ainsi été réalisée par SPPS. La fonction acide terminale étant libre, nous avons utilisé une résine de type Wang permettant, après clivage, de libérer les peptides sous forme acide libre. Le premier résidu de leucine est prégreffé sur la résine. Ainsi, la séquence réactionnelle suivie est la suivante (Schéma 85).

Schéma 85

La première étape consiste à régénérer la fonction amine libre par une solution de pipéridine à 20% dans le DMF, en trois fois 10 minutes, filtrations et ajout à chaque reprise d’une solution neuve de pipéridine. Le couplage d’un grand excès de Fmoc-Alanine s’effectue alors par activation préalable de l’aminoacide sous forme d’ester activé à l’aide de HATU et de DIPEA. Après déprotection de la position N-terminale, le couplage de la (R)-α-Tfm-Alanine peut alors s’opérer de la même manière pour un temps de couplage de deux jours. La fonction amine de la (R)-α-Tfm-Alanine n’étant pas protégée, le clivage de la résine est immédiatement réalisé pour donner, après purification semi-préparative, le peptide désiré (R,S,S)-18 avec un rendement de 21%.

Les premiers couplages en solution de l’α-Tfm-Alanine ont révélé qu’une activation classique sous forme d’ester activé suffisait pour réaliser avec succès et de bons rendements le couplage de la fonction acide terminale de l’α-Tfm-Alanine (Schéma 52). Par ailleurs, ces premiers essais ont montré qu’il n’était pas nécessaire de protéger l’amine de cet aminoacide fluoré pour réaliser le couplage. En effet, celle-ci est tellement désactivée par le caractère électroattracteur du fluor en position α, qu’il n’y a pas de risque de double couplage de l’α-Tfm-Alanine sur elle-même. Ne possédant pas de protection de la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine par un groupement Fmoc, stratégie utilisée en SPPS, nous avons donc tenté son couplage sous forme libre à la séquence peptidique en croissance. Seuls deux équivalents de (R)-α-Tfm-Alanine sont engagés à cette étape

123 mais le temps de réaction est allongé à 16 heures. Après microclivage à l’aide d’une solution acide de TFA/TIS et eau, et analyse du brut réactionnel, la présence du tripeptide désiré (R,S,S)-18 est vérifiée ainsi que l’absence de dérivé résultant d’un double couplage de l’α-Tfm-Alanine. Le clivage final de la résine a alors été réalisé dans les mêmes conditions pendant 3 heures. Après purification par HPLC semi-préparative sur colonne Jupiter^® avec un mélange eau/acétonitrile en gradient de 10% à 30 % en présence de 0,1 % de TFA, le tripeptide (R,S,S)-18 est obtenu avec un rendement de 68%.

Ainsi, l’incorporation de l’α-Tfm-Alanine non protégée, en position N-terminale d’un peptide synthétisé par SPPS est possible sans modifier les conditions habituelles de couplage. Ces résultats sont en accord avec les observations préalablement faites lors des couplages effectués en solution.

2.5.2.2. Couplage de la position N-terminale de l’α-Tfm-Alanine en SPPS

Dans le cadre de la synthèse du tripeptide H-Ala-(R)-α-Tfm-Ala-Leu-OH, le couplage de la fonction amine de la (R)-α-Tfm-Alanine par SPPS a alors été envisagé. Le début de la synthèse s’effectue de la même manière que celle du tripeptide (R,S,S)-18 par incorporation de 2 équivalents de (R)-α-Tfm-Alanine à l’aide de HATU et de DIPEA. L’utilisation de l’α-Tfm-Alanine non protégée s’est alors révélée intéressante car cela évite une étape de déprotection supplémentaire (Schéma 86).

Schéma 86

L’addition du dernier résidu de Fmoc-Alanine a alors été tentée dans les mêmes conditions. Cependant, même après 16 heures de temps de couplage, les microclivages réalisés à intervalles réguliers ne montrent pas la présence du tripeptide H-Ala-(R)-α-Tfm-Ala-Leu-OH désiré dans le brut réactionnel (Schéma 87).

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Effectivement, les premiers essais de couplage de la fonction amine de l’α-Tfm-Alanine en solution ont montré que la réactivité de cette fonction est particulièrement diminuée par la présence du groupement trifluorométhyle en position α. Son couplage à un aminoacide activé sous forme d’ester ne peut avoir lieu même en ayant recours au HATU, l’un des benzotriazioles les plus réactifs. Nous avions alors montré que l’utilisation des chlorures d’acyle permettait de coupler cette position avec succès. Nous avons alors envisagé l’utilisation du chlorure de N-Fmoc-Alanine synthétisé dans les conditions de Babu,120 en présence de DIPEA (Schéma 88).

Schéma 88

Or, même l’utilisation de 10 équivalents de chlorure de N- Fmoc-Alanine, ne permet pas le couplage en position N-terminale de l’α-Tfm-Alanine.

2.5.3. Stratégie d’incorporation de l’α-Tfm-Alanine sous forme de dipeptides